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Osteoporose
oder Knochenverlust ist ein Befinden, das, ebenso wie eine Reihe
von Krankheiten unterschiedlicher Ätiologie, das Älterwerden
begleitet. Zu diesen Krankheiten zählen stoffwechselbedingte Knochenkrankheiten,
Hypogonadismus, adrenogenitales Syndrom, Skorbut, erbliche Bindegewebsstörungen,
wie beispielsweise Osteopsatyrosis, Homocysteinurie und Ehlers-Danlos-Syndrom
und andere Befinden, wie beispielsweise rheumatoide Arthritis und
idiopathische Osteoporose. Altersbedingte Osteoporose tritt insbesondere
vorwiegend bei Frauen nach der Menopause auf.
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Wenn
sie frühzeitig
erkannt wird, kann Osteoporose mit Nahrungsergänzungsmitteln, Hormonersatz-Therapie
und gewissen verschreibungspflichtigen Medikamenten behandelt werden.
Leider lässt
sich Osteoporose bei einer körperlichen
Untersuchung nicht leicht feststellen und bleibt oft unerkannt,
bis ein Knochenbruch eintritt, welcher der Person Schmerzen und
mögliche
Deformierung und Behinderung verursacht. Mit zunehmendem Alter schwindet
das Vermögen,
auf diese Behandlungen anzusprechen, und die Komplikationen werden
ernsthafter. Daher ist eine frühzeitige
Erkennung ein wichtiges Mittel, um die Konsequenzen von Osteoporose
abzuschwächen
oder zu verhindern und die Lebensqualität von denjenigen zu verbessern,
die für
dieses Befinden anfällig
sind.
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Osteoporose
lässt sich
durch eine Reihe von Verfahren feststellen. Dazu gehören Röntgen-Absorptiometrie
mit Ein-Energie-,
Zwei-Energie- und peripheren Mitteln, radiografische Absorptiometrie,
quantitative Computertomographie, quantitativer Ultraschall, Knochendichtemessung
und die chemische Analyse von Urinproben. Das praktischste und kosteneffektivste Verfahren
ist die chemische Analyse einer Urinprobe, um die Spiegel gewisser
biochemischer Marker für
Knochenerneuerung festzustellen. Je höher der Resorptionsanteil in
bezug auf den Anteil von Knochengewebebildung ist, um so größer ist
der Knochenverlustanteil. Der Resorptionsspiegel speziell wird einfach
auf einer quantitativen Basis durch die Analyse von Urin auf Abbauprodukte
von Knochen-Mineralstoffen
und -Substanz ermittelt. Diese Abbauprodukte oder Marker sind die
Collagen-Querverbindungen Pyridinolin und Deoxypyridinolin und die
Abbauprodukte von Collagen Typ I, N-Telopeptid und C-Telopeptid.
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Die
Untersuchung von Urin auf diese Marker erfolgt durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC)
und durch Immunassays. Diese Immunassays können auf automatisierten Geräten zum
Erhöhen
der Effizienz ausgeführt
werden und um die Analyse einer großen Anzahl von Proben zuzulassen.
Wie bei jeder klinischen Analyse fordert das Qualitätswesen,
dass bei der Durchführung
des Tests und der Analyse der Testergebnisse Präzision und Genauigkeit eingehalten
werden. Aus diesem Grund ist die Verwendung von Kontrollmaterialien,
die bekannte Mengen der Marker enthalten, eine wichtige Komponente
des Laborprotokolls. Leider ist die Isolierung und Reinigung der
Marker aus Urin, entweder normalem Urin oder Urin mit einem erhöhten Spiegel
dieser Marker, ein langwieriger und mühsamer Prozess, und aus diesem
Grund sind die Kontrollen für
diese Marker sehr kostspielig und manchmal sogar unerschwinglich.
Ein weiterer Nachteil von Kontrollen, die auf diese Weise angesetzt
werden, besteht darin, dass sie in erster Linie Pufferlösungen sind,
in denen die Marker gelöst
sind, und Pufferlösungen
unterscheiden sich wesentlich von der Urinprobe eines Patienten.
Dies wirkt sich nachteilig auf die analytischen Prozeduren aus und
beeinträchtigt
die Fähigkeit,
direkte Vergleiche zwischen den Kontrollen und den Testproben zu
ziehen.
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KURZDARSTELLUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wurde jetzt entdeckt, dass flüssige
Kontrollen für
Bestimmungen der vier biochemischen Marker von Osteoporose in Urin
unter Verwendung von Materialien auf Urin-Basis durchgeführt werden
können,
die primär
durch Gefriertrocknung und Wiederherstellung gereinigt worden sind,
ohne den Einsatz von chromatographischen Mitteln zum Extrahieren
der Marker und ihre Trennung von anderen im Urin vorhandenen Spezies.
Die Materialien auf Urin-Basis können
entweder aus normalem Urin oder Urin mit erhöhten Spiegeln der Marker erlangt
werden. Gefriertrocknung und Wiederherstellung erzeugen zusammen
mit dem Entfernen von fremden Substanzen, die ausfällen und
sich nicht wieder lösen,
eine abgeklärte
Menge von Urin und tun dies erstaunlicherweise ohne Verlust oder
Zerstörung
der Marker, die im Urin vorhanden sind. Die Menge jedes in dem Ausgangs-Urin
vorhandenen Markers wird somit während
der Verarbeitung beibehalten. Die Wiederherstellung mit Wasser erzeugt
eine Kontroll-Lösung,
deren Grundsubstanz klar und dennoch in hohem Maße ähnlich dem Probenurin des Patienten
ist. Die Marker-Konzentration kann durch den für die Wiederherstellung verwendeten
Anteil von Wasser kontrolliert werden, und zwei oder mehr Aliquots
können
kombiniert werden, um jede spezielle Kombination der Marker als
Zielkonzentration zu erhalten. Die Erfindung stellt somit Kontrollen
bereit, die ausreichend klar sind, um für den Einsatz geeignet zu sein,
die ausreichend stabil sind, um klinisch nützlich zu sein, und die Marker
in einer präzise
bekannten Konzentrationen enthalten, und dennoch kostengünstig und
leicht anzusetzen sind, wobei sie den zusätzlichen Vorteil einer Grundsubstanz
bieten, die in hohem Maße ähnlich derjenigen
der Testproben ist. Diese Qualitäten
ermöglichen
es, dass die Kontrollmaterialien dieser Erfindung eine zuverlässige und
exakte Quantifizierung von Urinproben erleichtern.
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Diese
und andere Merkmale, Aufgaben und Vorteile der Erfindung sind im
Zusammenhang mit der folgenden Beschreibung besser verständlich.
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BESCHREIBUNG
DER SPEZIFISCHEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Diese
Erfindung betrifft Kontrollmaterialien für Bestimmungen von Knochen-Resorptions-Markern
in Urinproben und Verfahren zum Ansetzen von solchen Kontrollmaterialien.
Die Erfindung erstreckt sich auf Kontrollmaterialien, die nur einen
von den vier Markern – Pyridinolin,
Deoxypyridinolin, N-Telopeptid und C-Telopeptid – enthalten, und sie erstreckt
sich auch auf Kontrollmaterialien, die zwei oder mehr dieser Marker in
Kombination enthalten, einschließlich Kontrollmaterialien,
die alle vier enthalten. Die Auswahl des bzw. der Marker für ein bestimmtes
Kontrollmaterial wird von dem Marker bestimmt, dessen Vorhandensein
ermittelt und quantifiziert werden soll. Die Marker-Auswahl ändert sich
je nach Bevorzugung oder Absichten des Herstellers des Assays, mit
dem der bzw. die Marker verwendet werden sollen, nach dem Assay-Protokoll
selbst und der Bevorzugung des einzelnen Anwenders. Die Materialien
dieser Erfindung können
als Kontrollen sowie als Kalibratoren und Standards verwendet werden,
welche die genannten Marker in bekannten Konzentrationen enthalten.
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Die
Begriffe "N-Telopeptid" und "C-Telopeptid" werden hier in der
Weise verwendet, in der sie von Biochemikern verwendet werden, um
auf Sequenzen von etwa 12 bis 25 Aminosäuren zu verweisen, die an den N-
und C-Endständen
des Tropocollagen-Moleküls
auftreten. Die Begriffe "N-Telopeptid" und "C-Telopeptid" verweisen jeweils
auf eine Klasse von Spezies, und jede umfasst im allgemeinen eine
Mischung von Spezies, einschließlich
querverbundenen Spezies, innerhalb der Klasse, anstatt eine einzelne
Spezies. Dennoch ist das Vorhandensein und die Aussagekraft von
N-Telopeptid und C-Telopeptid im Urin für die Diagnostizierung von Osteoporose
sowie die Bedeutungen der Begriffe in der medizinischen Fachwelt
anerkannt. In dieser Spezifikation wird C-Telopeptid durch die Abkürzung "CTX" und N-Telopeptid
durch die Abkürzung "NTX" dargestellt. Aufgrund
seiner Heterogenität
wird NTX in Begriffen von "Knochen-Collagen-Äquivalenten" ("BCE") ausgedrückt, einem
Begriff, der von praktischen Ärzten
ebenfalls anerkannt ist, die Osteoporose diagnostizieren und behandeln.
Zum Ausgleichen der Schwankungen von Urin-Konzentrationen, die normalerweise
bei einem Spender über
den Zeitraum eines typischen Tags auftreten, werden die gemessenen
CTX- und NTX-Spiegel in bezug auf Creatinin normalisiert. Creatinin
wird für
diesen Zweck ausgewählt,
weil es in den Urin mit einem im wesentlichen konstanten Anteil
ausgestoßen
wird. Seine Konzentration in Urin ist somit ein direkter Hinweis auf
die normalen Schwankungen in Urin-Konzentrationen, die im Laufe
eines Tages auftreten, und ist daher ein geeigneter Normalisierungsfaktor.
Die CTX- und NTX-Spiegel werden somit jeweils als μg/l pro mmol
Creatinin und nmol BCE pro mmol Creatinin ausgedrückt.
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Die
Begriffe "peptidfreies
Pyridinolin" und "peptidfreies Deoxypyridinolin" verweisen auf proteolytisch abgebaute
Spezies, während "Pyridinolin" und "Deoxypyridinolin" jeweils auf eine
Mischung von Spezies verweisen, die angelagertes Protein speichern
können.
HPLC-Assays neigen dazu, gesamtes Pyridinolin und Deoxypyridinolin
abzufragen, während
Immunassays dazu neigen, gesamtes Pyridinolin und Deoxypyridinolin
bis zu einer gewissen maximalen Fragmentlänge abzufragen, die normalerweise
1000 Kilo-Dalton
oder weniger beträgt.
Obwohl Assay-Prozeduren bekannt sind, die zwischen Pyridinolin und
Deoxypyridinolin unterscheiden, treffen gewisse Assay-Prozeduren
keine Unterscheidung zwischen ihnen, sondern stellen statt dessen einen
Wert für
die kombinierten Konzentrationen oder Mengen dieser zwei Marker
bereit. Diese Erfindung erstreckt sich in ähnlicher Weise auf Kontrollmaterialien
für Assays,
bei denen diese zwei Marker gemeinsam oder einzeln identifiziert
werden. In dieser Spezifikation wird Pyridinolin durch die Abkürzung "PYD", Deoxypyridinolin
durch die Abkürzung "DPD", und Kombinationen
der beiden durch die Abkürzung "PYD/DPD" dargestellt.
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Die
erste Stufe beim Ansetzen der Kontrollmaterialien dieser Erfindung
ist die Auswahl von Urinproben als Ausgangsstoffe für das Material.
Die Proben werden basierend auf ihren Mengen der Marker ausgewählt, die
in den letztendlich ausgebildeten Kontrollmaterialien enthalten
sein sollen. Somit ist für
ein PYD-Kontrollmaterial
die Ausgangs-Urinprobe eine, die große Mengen von PYD enthält, und
dies gilt ähnlich
für die
drei anderen Marker. Zwei oder mehr solcher Proben können erforderlich
sein, um die benötigte
Gesamtmenge des Markers zu erhalten oder um das Probenvolumen zu
begrenzen, wenn eine solche Begrenzung hinsichtlich des Verarbeitungsgeräts (wie
beispielsweise der Vakuumtrocknervorrichtung, die für die Gefriertrocknung
verwendet wird) erforderlich ist. Wenn ein einzelnes Kontrollmaterial
für zwei
oder mehr Marker angesetzt wird, sind die Ausgangs-Urinproben in ähnlicher
Weise entweder eine Probe, die alle der angegebenen Marker in großen Mengen
enthält,
oder zwei oder mehr Proben, die zusammen alle der angegebenen Marker
in großen Mengen
enthalten.
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Die
Marker-Menge, die in der Ausgangs-Urinprobe vorhanden ist, ist für die Erfindung
nicht entscheidend und kann weit voneinander abweichen. Aus Einfachheits-
und Effizienzgründen
werden Proben mit relativ hohen Konzentrationen der Marker bevorzugt.
Somit ist für
ein DPD-Kontrollmaterial die Ausgangsprobe vorzugsweise eine, die
DPD in einer Konzentration von wenigstens etwa 20 nmol enthält. In ähnlicher
Weise ist für
ein PYD/DPD-Kontrollmaterial
die Ausgangsprobe vorzugsweise eine, die PYD und DPD in einer kombinierten
Konzentration von wenigstens etwa 100 nmol enthält. Für ein NTX-Kontrollmaterial ist die Ausgangsprobe
ebenfalls vorzugsweise eine, die NTX in einer Konzentration von
wenigstens 50 nmol BCE pro mmol Creatinin enthält. Schließlich ist für ein CTX-Kontrollmaterial
die Ausgangsprobe vorzugsweise eine, die CTX in einer Konzentration
von wenigstens 200 μg/l
pro mmol Creatinin enthält.
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Der
Urin, der als die Ausgangsprobe verwendet wird, die als der Ausgangsstoff
für die
Marker dient, ist menschlicher Urin, entweder von männlichen
Spendern oder weiblichen Spendern, einschließlich schwangeren weiblichen
Spendern und Spendern mit erhöhten
Spiegeln von Knochen-Resorptions-Markern.
In bevorzugten Verfahren zum Anwenden der Erfindung werden die Proben
oder gesammelten Proben zuerst gefiltert, um Feststoffe zu entfernen
und die Klarheit durch Reduzieren der Trübung zu verbessern. Trübung kann weiter
reduziert werden, indem der pH-Wert auf einen Wert zwischen etwa
4,0 und etwa 5,0, vorzugsweise etwa 4,5 angeglichen wird, anschließend wird
der Urin eingefroren und wieder aufgetaut. Danach erfolgt vorzugsweise
eine Filtration, für
die ein Filter mit einer Rückhaltung
von wenigstens 0,8 Mikrometer verwendet wird. Der Begriff "Rückhaltung von 0,8 Mikrometer" wird in diesem Kontext
verwendet, um anzugeben, dass Partikel von 0,8 Mikrometer und größer von
dem Filter zurückgehalten
werden. Der Begriff "wenigstens" wird verwendet,
um anzugeben, dass Filter mit kleinformatigeren Öffnungen ebenfalls verwendet
werden können. Der
pH-Wert wird vorzugsweise auf einen basischen Spiegel angehoben,
wie beispielsweise auf einen Bereich von etwa 7,8 bis etwa 8,5,
vorzugsweise etwa 8,0, und danach erfolgt optional ein nochmaliges
Einfrieren zur Aufbewahrung. Diese verschiedenen pH-Wert-Angleichungen,
Einfrier-Auftau-Zyklen und Filtrationen dienen zur Stabilisierung
der Proben, bis sie für
den Gebrauch fertig sind, und um einige der Proteine auszufällen und die
Proben abzuklären,
wodurch die Analysen erleichtert werden, die sich zum Bestimmen
der in den Proben vorhandenen DPD-, PYD-CTX- und NTX-Spiegel daran anschließen.
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Die
Analysen werden danach mit herkömmlichen
Mitteln durchgeführt,
wobei von diesen die immunometrischen Techniken bedeutend sind.
Immunometrische Analyse-Kits sind im Handel für jeden der vier Marker erhältlich,
die in dieser Erfindung angesprochen werden. Ein DPD-Kit ist beispielsweise
von Bayer Corporation, Walpole, Massachusetts, USA erhältlich;
ein PYD/DPD-Kit ist von Metra Biosystems, Mountain View, Kalifornien,
USA erhältlich;
ein NTX-Kit ist von Ostex, Seattle, Washington, USA erhältlich,
und ein CTX-Kit ist erhältlich
von DSL, Webster. Texas, USA.
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Sobald
die Proben analysiert sind, werden Proben mit relativ großen Mengen
der Marker für
die anschließende
Gefriertrocknung ausgewählt.
Die Auswahlkriterien sind für
diese Erfindung nicht entscheidend, aber im allgemeinen gilt, je
größer die
Mengen von einem oder mehr der Marker in den Proben sind, um so nützlicher
sind sie als Ausgangsstoffe für
die letztendlich erzeugten Kontrollmaterialien. Eine typische Gruppe von
Auswahlkriterien, die hier als Beispiel aufgeführt wird, ist, dass DPD größer als
20 nmol, PYD/DPD größer als
100 nmol, NTX größer als
50 nmol BCE pro mmol Creatinin, und CTX größer als 200 μg/l pro mmol
Creatinin ist. Diese Mengen können
entweder in einzelnen Proben vorliegen, oder es können zwei
oder mehr in einer gemeinsamen Probe zusammen vorhanden sein.
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Sobald
die Proben ausgewählt
und optional gesammelt worden sind, um Volumen zu erhalten, die
für eine
effiziente Verarbeitung groß genug
sind, werden die Proben gefriergetrocknet. Dazu können herkömmliche
Gefriertrocknungs-Prozeduren und -Geräte verwendet werden.
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Im
allgemeinen umfasst die Prozedur das Absenken der Temperatur einer
Probe auf ein Niveau unter dem eutektischen Punkt der Probe und
das anschließende
ausreichende Absenken des Drucks, um durch Sublimation Wasser aus
der Probe zu entfernen. Einige der Anbieter von Gefriertrocknungs-Geräten sind
FTS Systems, Life Science Division, Stone Ridge, New York, USA;
Formatech, Inc., Lowell, Massachusetts, USA; und Hull Corporation,
Hatboro, Pennsylvania, USA.
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Nachdem
sie gefriergetrocknet sind, werden die Materialien durch Hinzufügen von
destilliertem oder anderweitig gereinigtem Wasser mit Anteilen wiederhergestellt,
die berechnet wurden, um gewünschte
Konzentrationen für
den Einsatz als die Kontrollmaterialien zu erhalten. Die endgültigen Konzentrationen
sind nicht entscheidend und können
je nach Wunsch der Hersteller, Anbieter, Vertriebshändler oder
Anwender variieren. Wie vorher erwähnt, kann eine einzelne Kontrolle
einen, zwei, drei oder alle vier Marker mit vorgegebenen Konzentrationen
enthalten. In vielen Fällen
wird es nützlich
sein, eine Reihe von Kontrollmaterialien mit unterschiedlichen Konzentrationen
der Marker anzusetzen, die sich über
den Konzentrationenbereich, der in den Proben erwartet werden könnte, oder
der das Vorhandensein eines Krankheitszustands anzeigen könnte, der mit
einem hohen Spiegel von Knochen-Resorption
verbunden ist, erstrecken oder ihn eingrenzen. Beispielsweise kann
eine Reihe von Kontrollmaterialien ein Kontrollmaterial enthalten,
in dem die Konzentration des bzw. der Marker annähernd gleich derjenigen bei
einem Patienten ist, der nicht unter Osteoporose leidet, ein zweites
Kontrollmaterial, das den bzw. die Marker in einer Konzentration
enthält,
die wesentlich höher
(z.B. etwa doppelt so hoch) als die des ersten Kontrollmaterials
ist, und ein drittes Kontrollmaterial, das den bzw. die Marker in
einer Konzentration enthält,
die wesentlich höher
als diejenige des ersten und zweiten Kontrollmaterials ist (z.B.
dreimal so hoch wie diejenige des ersten Kontrollmaterials). Andere
Kombinationen und Konzentrationen sind für den Fachmann leicht erkennbar.
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Sobald
die Materialien in den gewünschten
Kombinationen und Konzentrationen wiederhergestellt sind, ist es
oft wünschenswert,
die Materialien optional nochmals gefrierzutrocknen, nachdem sie
nochmals gefiltert worden sind, um sie für den Vertriebshändler oder
Anwender in gefriergetrockneter Form bereitzustellen. Die endgültigen gefriergetrockneten
Materialien werden dann mit Anweisungen für ihre Wiederherstellung bereitgestellt.
Die Filtration vor der endgültigen
Gefriertrocknung kann mit der gleichen Rückhaltegröße oder mit einer feineren
Rückhaltegröße zur weiteren
Reinigung erfolgen.
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Die
folgenden Beispiele sind nur zu Veranschaulichungszwecken aufgeführt.
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BEISPIEL 1
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Sammlung von menschlichem
Urin
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Unverarbeitete
menschliche Urinproben werden gesammelt, um Volumen von etwa 50
Liter pro Sammlung zu erhalten, und durch Zwischenlagen mit einer
Rückhaltung
von 0,8 Mikrometer gefiltert. Der pH-Wert jeder Sammlung wird auf
4,5 ± 0,1
mit konzentriertem HCl angeglichen. Die Sammlungen werden gefroren,
aufgetaut und anschließend
durch Zwischenlagen mit einer Rückhaltung
von wenigstens 0,6 Mikrometer gefiltert. Der pH-Wert jeder Sammlung
wird unter Verwendung von NaOH auf 8,0 ± 0,1 angeglichen. Danach
werden die Sammlungen bei –20 °C eingefroren
gelagert.
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BEISPIEL 2
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Untersuchung von menschlichen
Urin-Sammlungen
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Die
eingefrorenen Urin-Sammlungen aus Beispiel 1 werden aufgetaut und
auf das Vorhandensein von DPD, PYD/DPD, CTX und NTX mit immunometrischen
Techniken untersucht, die mit Kits durchgeführt werden, die von Anbietern
im Handel erhältlich
sind. Sammlungen mit den folgenden Kriterien werden zur Gefriertrocknung
ausgewählt:
DPD größer als
20 nmol, PYD/DPD größer als
100 nmol, NTX größer als
50 nmol BCE pro mmol Creatinin, CTX größer als 200 μg/l pro mmol
Creatinin oder jede Kombination davon.
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BEISPIEL 3
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Gefriertrocknung
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Die
ausgewählten
Sammlungen werden in Gefriertrocknungsbecken gefüllt, wobei jedes Becken ein Füllvolumen
von 1,5 1 aufweist. Danach wird die Gefriertrocknung in einem industrieüblichen
Vakuum-Gefriertrockner
ausgeführt
(Hull Corporation, Modell 651 VC36F40). Die Prozedur besteht daraus,
die Lagertemperatur vor dem Beschicken der Becken auf –29 °C oder darunter
abzusenken, dann die Becken zu beschicken und die Inhalte auf die
abgesenkte Lagertemperatur abzukühlen,
dann durch Absenken des Drucks auf unter 10 mmHg ein Vakuum herbeizuführen. Danach
wird die Lagertemperatur auf –7 °C erhöht und auf
diesem Niveau gehalten, bis alle der Sammlungen –18 °C erreicht haben. Die Lagertemperatur
wird dann auf +5 °C
erhöht
und auf diesem Niveau gehalten, bis alle der Sammlungen –1 °C erreicht
haben. Danach wird die Lagertemperatur auf +16 °C erhöht, auf der sie gehalten wird,
bis alle der Sammlungen +10 °C
erreicht haben. Die Temperatur wird dann auf +27 °C erhöht, auf
der sie gehalten wird, bis alle der Sammlungen +21 °C erreicht haben.
Danach wird die Lagertemperatur auf +43 °C erhöht, auf der sie gehalten wird,
bis alle der Sammlungen +38 °C
erreicht haben. Die Sammlungen werden zwölf Stunden lang auf dieser
Temperatur gehalten. Danach werden die Trockner entlüftet, um
den Druck auf atmosphärischen
Druck zu erhöhen,
und das gefriergetrocknete Material wird aus den Becken entnommen.
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BEISPIEL 4
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Wiederherstellung
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Gefriergetrocknete
Materialien aus Beispiel 3 werden wiederhergestellt, indem sie in
destilliertem Wasser gelöst
werden, um ein Gesamtvolumen zu erhalten, das einem Zehntel des
ursprünglichen
Volumens und daher einer Konzentration entspricht, die zehnmal höher als
die der ursprünglichen
Sammlung ist. Die wiederhergestellten Materialien werden gesammelt
und durch eine 0,45-Mikrometer-Filterkartusche gefiltert und auf
DPD, PYD/DPD, CTX und NTX untersucht, wie in Beispiel 2. Danach
werden die Materialien mit destilliertem Wasser auf die gewünschten
Zielkonzentrationen verdünnt,
durch einen 0,45-Mikrometer-Filter
gefiltert, in Phiolen von 5,2 ml pro Phiole gefüllt und erneut gefriergetrocknet.
Vor dem Gebrauch stellt der Anwender das gefriergetrocknete Material
wieder her, um eine klare Lösung
mit den gewünschten
Konzentrationen zu erhalten.
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BEISPIEL 5
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Marker-Assays
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Urinproben
wurden gesammelt, behandelt, gefriergetrocknet und wiederhergestellt,
wie in den Beispielen 1 bis 4 beschrieben, und die Gesamtmengen
jedes der vier Marker wurden in den ursprünglichen Proben und in den
Materialien nach der Gefriertrocknung und Wiederherstellung bestimmt.
Die Mengen der vier Marker vorher (die ursprünglichen Proben) und danach
sind unten aufgelistet. Die Werte in der Spalte "Danach" sind zurück auf die Verdünnung der
ursprünglichen
Proben normalisiert worden, um einen direkten Vergleich bereitzustellen.
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Konzentrationen
von Markern vor und nach der Verarbeitung
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Das
Vorhergehende ist primär
zu Veranschaulichungszwecken aufgeführt. Weitere Modifizierungen und
Variationen der Prozeduren und Materialien, die immer noch im Umfang
der Erfindung liegen, sind für Fachleute
leicht erkennbar.
