DE69912452T2

DE69912452T2 - Verfahren zur prüfung der toxizität von chemischen verbindungen unter verwendung von gastropoda

Info

Publication number: DE69912452T2
Application number: DE69912452T
Authority: DE
Inventors: Paul Jean Remon; Els Adriaens
Original assignee: Universiteit Gent
Current assignee: Universiteit Gent
Priority date: 1998-08-26
Filing date: 1999-08-24
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2019-08-25
Also published as: PT1108211E; ATE253222T1; CA2339254A1; DK1108211T3; US6436630B1; AU751505B2; DE69912452D1; EP0982589A1; EP1108211B1; CA2339254C; JP2002523778A; ES2211158T3; EP1108211A1; WO2000013013A1; JP4358443B2; AU5740099A

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Testen der Toxizität einer chemischen Substanz, insbesondere in Bezug auf Tier-, insbesondere humane Schleimhautmembranen, insbesondere einschichtige Schleimhaut-Oberflächen wie beispielsweise humane Darm-, Nasen- und Atemwegsschleimhaut und andere Schleimhaut-Oberflächen wie beispielsweise Vaginal- und Bukkalschleimhaut.
Technischer Hintergrund
Höhere Tiere wie beispielsweise Mäuse, Ratten, Kaninchen, Hunde, Katzen, Schweine und Affen werden üblicherweise als Versuchstiere bei der Durchführung von Toxizitätstests von Substanzen verwendet. Die Aufzucht muss unter sorgfältig kontrollierten Bedingungen über eine lange Zeitspanne von 2 bis 2½ Jahren durchgeführt werden. Somit ist die Durchführung solcher Toxizitäts-Test äußerst zeitaufwendig und teuer. In der pharmazeutischen und chemischen Industrie werden neue chemische Substanzen kontinuierlich synthetisiert, um den verschiedenen industriellen und Gesundheitsbedürfnissen zu entsprechen. Zusätzlich wird ein großer Forschungsaufwand durchgeführt, um neue Anwendungen für bekannte chemische Substanzen aufzufinden. Es ist in jedem Fall wünschenswert, ein rasches und preiswertes Verfahren zum Testen der Toxizität dieser Substanzen zu etablieren.
Ein Toxizitäts-Testen bzw. -Test unter Verwendung von Wirbeltieren zur Evaluierung der Sicherheit von Xenobiotika gegenüber Menschen wurde auf Grundlage ethischer und finanzieller Erwägungen scharf kritisiert. Die prinzipielle Alternative zum in vivo-Tiertest bzw. Tierversuch liegt in einem in vitro-Test. Viele Faktoren, beispielsweise die Nervenkontrolle, systemische Blutströmung, reduzierte Motilität und heterogene Zellpopulationen fehlen jedoch in einfachen Zellkulturmodellen, was den Wert des in vitro-Testens reduzieirt. Bakterien beispielsweise sind prokaryontische Organismen, die von multizellulären Organismen sehr verschieden sind, welche höhere Ebenen der biologischen Organisation besitzen. Es besteht deswegen eine Neigung dazu, höhere Tiere oder Teile höherer Tiere zum Testen komplexer Systeme, wie beispielsweise der humanen Schleimhäute, zu verwenden.
Im Workshop „The three Rs: The Way Forward", organisiert vom European Center for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) (Sheringham, Norfolk, UK, 30/5-3/6, 1995) wurden einige alternative Ersatzverfahren und Ansätze vorgeschlagen, beispielsweise die Verwendung „niederer" Organismen mit einer eingeschränkten Empfindung und/oder die nicht durch Tierexperimente kontrollierende Gesetzgebung geschützt sind, einschließlich wirbelloser Tiere, Pflanzen und Mikroorganismen. Jedoch wurden lediglich Nematoden, Bakterien oder Insekten als konkrete Alternativen zum Tierversuch vorgeschlagen. Die Verwendung von Nematoden für einen Toxizitäts-Test ist in US 4 444 891 beschrieben.
Untersuchungen haben demonstriert, dass die humane Mukosa bzw. Schleimhaut, insbesondere die Nasenschleimhaut, eine wirksame Arzneistoffabsorption ermöglicht. Insbesondere ist die nasale Verabreichung für Peptid-Arzneistoffe eine vielversprechende Alternative zur parenteralen Verabreichung. Jedoch zeigen Peptide aufgrund ihres großen Molekulargewichts und ihrer hydrophilen Eigenschaften bei physiologischen pH-Werten schlechte Transporteigenschaften durch die hydrophoben Membran-Barrieren. Die Absorptionseffizienz intranasal verabreichter Peptide kann durch Verwendung von Absorptionsverstärkern, wie beispielsweise Gallensalzen, Laureth-9, Fusidatderivaten oder Natriumtaurodihydrofusidat (STDHF) verbessert werden.
Solche Absorptionsverstärker spielen eine essentielle Rolle bei der nasalen Arzneistoffabgabe. Insbesondere ist die Verwendung von Absorptionsverstärkern für Peptide und Proteine oftmals obligat, um eine effektive Absorption aus der Nasenschleimhaut zu erreichen. Leider ist wenig über potentielle Nebenwirkungen dieser Substanzen bekannt, was für die klinische Anwendung der Absorptionsverstärker in Nasenarzneistoff-Formulierungen einen Nachteil darstellt. Ein näherer Blick auf die Wirkungen bzw. Effekte und die Mechanismen, die der Absorptionsverstärkung von Absorptionsverstärkern auf die Nasenschleimhaut zugrunde liegen, stellt mehr Informationen bzgl. ihrer Leistungsfähigkeit und Sicherheit bereit. Die Mechanismen, die zu einer erhöhten nasalen Arzneistoffabsorption unter dem Einfluß von Verstärkern führen sind sehr unterschiedlich und werden nur teilweise verstanden. In einigen Fällen wird die Löslichkeit oder die Stabilität des Arzneistoffes erhöht, jedoch können die Absorptionsverstärker auch mit der Schleim-Schicht interagieren, wodurch die Schleimeigenschaften verändert werden. Überdies kann die Permeabilität des Nasenepithels auch aufgrund der Interaktion mit den Epithelmembranen erhöht werden.
Wenn die nasale Arzneistoffabgabe berücksichtigt wird, sollten die Wirkungen von Arzneistoff und Additiven auf die Nasenfunktion in einem frühen Stadium getestet werden. Weil die Selbstreinigungsfähigkeit der Nase durch das Ziliarepithel für die Entfernung von Staub, Allergenen und Bakterien aus dem Nasenbereich von Menschen vital bzw. lebenswichtig ist, sollte diese durch die nasale Medikation nicht beeinflußt werden. Die Ziliarbewegung ist ein Hauptfaktor für die mukoziliäre Clearance in den oberen Atemwegen. Es ist von Patienten mit „immotile-Cilia-Syndrom" bekannt, das ein chronischer Ziliar-Stillstand zu wiederauftretenden Infektionen der Luftwege führt. Viele Arzneistoffe und Additive hemmen die nasale Ziliarbewegung, wie es in vitro demonstriert wurde. Beispielsweise sind lipophile und quecksilberhaltige Konservierungsmittel, Antihistaminika, Propranolol und Dihydroxygallensäuren ziliostatische Mittel, die alle die ziliare Schlagfrequenz innerhalb einer kurzen Zeit reduzieren. Es ist weiter von Bedeutung zu untersuchen, ob ein ziliostatischer Effekt nach Entzug der Arzneistoffexposition reversibel ist. Nasale Absorptionsverstärker sollten keine ernsthafte Ziliotoxizität aufweisen und das Vermögen der nasalen Arzneistoffverabreichung kann in großem Umfang von den Wirkungen auf das Ziliarepithelgewebe abhängen.
Die folgenden Verfahren zur Bestimmung der Cytotoxizität oder mukoziliären Clearance-Zeit chemischer Substanzen wurden vorgeschlagen: in situ Tests am Rattennasenepithel, in vitro Bestimmung des Einflusses der Verstärker auf die Ziliarschlaghäufigkeit der Luftröhrenzilien neugeborener Hühner und die Verwendung des Froschrachen-Modells, bei dem der Frosch enthauptet wird, der obere Gaumen exponiert und visuell mit der spezifischen Substanz ausgetestet wird.
Nicht nur die Nasenfunktion, sondern auch negative Nebenwirkungen sollten in einem frühen Stadium der Arzneistoff oder Arzneistoffabgabe-Entwicklung bestimmt werden, idealerweise vor klinischen Versuchen an Menschen. Ein Beispiel ist die Abgabe des β-Blockers Propanolol-HCl über die humane Bukkal-Mukosa bzw. Wangenschleimhaut. Diese Chemikalie verursachte während klinischer Versuche eine schwere Ulceration bzw. Geschwürbildung beim Menschen, deren Heilung Wochen in Anspruch nahm. Es wäre wünschenswert, ein Screening-Testverfahren zur Hand zu haben, das zuverlässig Chemikalien screenen könnte, die solche ernsthaften Probleme beim Menschen verursachen.
Gastropoden sind Mollusken und schließen Schnecken und Nacktschnecken ein. Sie weisen im allgemeinen eine einzige oder überhaupt keine Schale auf und haben oftmals einen asymmetrischen Körper. Eine umfassendere Diskussion von Gastropoden ist in der Encyclopaedia Britannica zu finden. Bis jetzt wurden Gastropoden, beispielsweise Schnecken, überwiegend in Medizinprodukten und Verfahren verwendet, wie sie beispielsweise in der US 5 538 740 , US 4 473 640 , US 4 314 992 , US 3 889 006 , US 4 855 285 , US 3 885 012 beschrieben sind.
DE 3 018 900 beschreibt ein Verfahren zum Testen der Toxizität von Verbindungen durch Verwendung von Nematoden.
Im Artikel von Marigomez et al., Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1996, 31(1), Seiten 54–62, ist die Verwendung von Schnecken als Wächterorganismen („Schneckenwacht") bei der Bestimmung der Bodenqualität beschrieben. Die Schnecken können als Biomarker der Exposition gegenüber metallischen Verunreinigungen im Boden verwendet werden. Es wird jedoch lediglich auf die Reaktion der Schnecken auf Quecksilber Bezug genommen und es gibt keinen Hinweis darauf, dass die Schnecken als Modell für die humane Schleimhaut verwendet werden können.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Testverfahren bereitzustellen, mit dem Substanzen auf ihre Toxizität gegenüber Tier- und Menschen-Membranen einfach, rasch, genau und preiswert getestet werden können.
Es ist eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zum Testen der Toxizität einer Substanz unter Verwendung von wirbellosen Tieren anstelle von Wirbeltieren bereitzustellen.
Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung einen Test bereitzustellen, der die einfache Wiederholung von Tests ermöglicht, um die statistische Interpretation der Ergebnisse zu verbessern.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung schließt die Verwendung eines Gastropoden für einen Toxizitäts-Test ein. Die vorliegende Erfindung schließt ein Toxizitätstestverfahren zur Modellierung der Reizung von Wirbeltier-Schleimhautoberflächen, insbesondere von humanen oder anderen Säugetier-Schleimhautoberflächen, durch eine chemische Substanz ein, umfassend die folgenden Schritte:
Bereitstellen zumindest eines Teils des Epithels des Körpers oder zumindest eines Teils des Fußes eines Gastropoden, wobei der Gastropode ein Gastropode der Klasse Gastropoda ist; und
Exponieren des Teils des Epithels oder des Teils des Fußes gegenüber der chemischen Substanz, die getestet werden soll.
Insbesondere kann die chemische Substanz mit der Haut und/oder dem Fuß des Gastropoden in Berührung gebracht werden. Die vorliegende Erfindung schließt sowohl in vivo Tests unter Verwendung des gesamten Gastropoden als auch in vitro Tests an einem Teil eines Gastropoden ein. Die chemischen Substanzen sind nicht auf kosmetische oder pharmazeutisch-chemische Formulierungen beschränkt, sondern können auch industrielle oder Haushalts- Gegenstände wie beispielsweise Farben, Lacke, Klebstoffe und Lösungsmittel sein, die mit den humanen oder tierischen Schleimhautmembranen in Berührung kommen können.
Gemäß diesem Test kann die Schleimhautirritation bzw. Reizung einfach und rasch qualitativ bestimmt werden, beispielsweise durch visuelle Beobachtung der Farbe oder der Zunahme der Memge des Schleimes, die aus dem Fuß des Gastropoden freigesetzt wird. Eine mechanische Vibration oder andere Irritationen können die Schleimproduktion von Gastropoden beeinflussen. Um eine Verwechslung mit anderen Effekten zu vermeiden wird es gemäß der vorliegenden Erfindung bevorzugt, wenn die Gastropoden keinen anderen Stress- oder Erregungsformen während der Tests unterworfen werden, außer den chemischen Substanzen, die getestet werden sollen. Gemäß des Toxizitätstestverfahrens der vorliegenden Erfindung kann eine Schleimhautschädigung ebenfalls in einfacher Weise quantitativ durch Freisetzung des Schleims aus dem Fuß, durch den Verlust des Körpergewichts des Gastropoden, oder durch Freisetzung von Markersubstanzen, Proteinen oder Enzymen aus dem Fuß bestimmt werden. Insbesondere kann die Toxizität eine Substanz quantitativ durch Messen der Menge an Gesamtprotein und/oder Lactatdehydrogenase und/oder alkalischer Phosphatase und/oder Cholesterin und/oder Phospholipiden und/oder anderer Membranbestandteile gemessen werden, die aus der Fußschleimhaut des Gastropoden nach Behandlung mit der chemischen Substanz freigesetzt werden. Ein Vorteil des Tests besteht darin, dass die Schleimproduktion, die durch reizende Substanzen verursacht wird, in einfacher Weise gemessen werden kann. Das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung stellt einen Screening-Test für die Toxizität von Substanzen bereit, während ebenfalls ein Modell für einschichtige Schleimhaut-Oberflächen wie beispielsweise humane Darm-, Nasen- und Atemwegsschleimhaut und andere Schleimhaut-Oberflächen wie beispielsweise Vaginal- und Bukkal-Schleimhaut bereitgestellt wird, das ebenfalls eine genaue quantitative Analyse ermöglichen kann. Dabei kann das Testverfahren der vorliegenden Erfindung sowohl qualitative als auch quantitative Testergebnisse bereitstellen, beispielsweise die Freisetzung von Proteinen, Enzymen oder Membranbestandteilen aus dem behandelten Epithel und kann sowohl als Screening-Test als auch als genauer, quantitativer Toxizitäts-Test geeignet sein.
Die vorliegende Erfindung wird nunmehr unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Figuren beschrieben. Die abhängigen Ansprüche definieren individuelle, getrennte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 bis 5 zeigen die Ergebnisse (Tabelle 1) des Testbeispiels 1 gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
6 bis 10 zeigen die Ergebnisse (Tabelle 2) des Testbeispiels 2 gemäß der ersten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung.
11 zeigt die Reduktion des Körpergewichts (Prozent des anfänglichen Körpergewichts), die durch unterschiedliche Testsubstanzen für die Nacktschneckenspezies Arion verursacht wurde (Beispiel 3, Tabelle 3).
12 zeigt die Reduktion des Körpergewichts (Prozent des anfänglichen Körpergewichts), verursacht durch unterschiedliche Testsubstanzen für die Nacktschneckenspezies Limax (Beispiel 3, Tabelle 4).
13 zeigt die Reduktion des Körpergewichts (Prozent des anfänglichen Körpergewichts), verursacht durch die unterschiedlichen Testsubstanzen (Beispiel 4, Tabelle 5).
Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen
Die vorliegende Erfindung wird unter Bezugnahme auf bestimmte Ausführungsformen beschrieben werden, jedoch ist die Erfindung nicht auf diese sondern lediglich durch die Ansprüche beschränkt. Die vorliegende Erfindung wird hauptsächlich unter Bezugnahme auf zwei Spezies von Gastropoden beschrieben werden, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Spezies beschränkt. Die vorliegende Erfindung wird ebenfalls hauptsächlich unter Bezugnahme auf bestimmte Klassen von Substanzen beschrieben werden, beispielsweise Arzneistoffadsorptionsverstärker und Lokalanästhetika, wie sie in der Zahnheilkunde verwendet werden können, jedoch ist die vorliegende Erfindung nicht auf diese Arten von Substanzen beschränkt. Weiterhin werden aufgrund des Typs und der Form der chemischen Substanzen, die in den nachfolgenden Beispielen der Erfindung getestet werden, terrestrische Schnecken bevorzugt, d. h. solche Gastropoden, die über Lungen atmen (Gastropoda pulmonata), weil diese Schnecken einfach zu halten sind und unter Laborbedingungen beobachtet werden können. Jedoch ist die vorliegende Erfindung weder auf diese Art von Substanzen noch auf diese Gastropodentypen beschränkt. Beispielsweise können andere chemische Substanzen in flüssiger Form, entweder in einem Lösungsmittel wie beispielsweise Wasser oder Salzlösungen getestet werden, und in diesem Falle können Wasserschnecken oder Nacktschnecken, einschließlich Meeresschnecken, die bevorzugten Organismen sein. Der Fuß des Gastropoden ist gemäß der vorliegenden Erfindung von besonderem Interessen, weil er eine Schleimhautoberfläche bereitstellt, die in vorteilhafter Weise für einen Toxizitäts-Test gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann und der ein geeignetes Modell für Schleimhautmembranen höherer Tiere, beispielsweise von Wirbeltieren, insbesondere von Menschen und anderen Säugetieren, bereitstellen kann.
Endpunkte des Toxizitätstests gemäß der vorliegenden Erfindung können ein oder mehreres der Schleimproduktion, der Veränderung der Schleimfarbe, des Verlustes an Körpergewicht und der Freisetzung biochemischer Markersubstanzen einschließen. Jeder oder all diese Endpunkte können entweder eine qualitative oder quantitative Rangliste des Irritationsgrades bereitstellen. Es sollte klar sein, dass der Begriff „Toxizität" allergische Reaktionen einschließt, so dass ein Toxizitäts-Test gemäß der vorliegenden Erfindung auch ein Testen auf allergische Reaktionen gegenüber Substanzen einschließt. Solche Reaktionen sind bei Schleimhautmembranen üblich.
Gemäß einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann ein lebender Gastropode wie beispielsweise eine hermaphroditische, terrestrische, lungenatmende Schnecke, Arion sp., als Testorganismus verwendet werden. Die Körperwand solcher Schnecken besteht aus einem äußeren einschichtigen Epithel, zusammengesetzt aus epithel- und schleimsezernierenden Zellen, die auf Bindegewebe aufliegen. Der Fuß der Schnecken besteht aus unterschiedlichen Epithelzelltypen mit unterschiedlichen funktionellen Rollen. Die Seitenbanden des Fußes sind aus mikrovillösen Epithelzellen zusammengesetzt, die denjenigen absorptiver Oberflächen in anderen Tiersystemen ähneln. Die Mittelbande ist aus Zilien-tragenden Zellen zusammengesetzt und ist für die Fortbewegung spezialisiert. Die Haut der Schnecken ist weich, ohne Himweis auf eine Keratinisierung oder Oberhaut-Produktion. Es hat sich gemäß dieser Erfindung herausgestellt, dass die Fußepithelien von Schnecken ein gutes Modell für absorptive Epithelien höherer Tiere wie beispielsweise Wirbeltiere und insbesondere von Säugetieren, einschließlich Menschen, sind.
Anfänglich werden die Schnecken unter kontrollierten Temperatur- und Feuchtigkeitsbedingungen in Kultur gehalten, bis sie ein stabiles Körpergewicht erreicht haben. Der Zweck des Erreichens eines stabilen Körpergewichts besteht darin, die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse zu verbessern, insbesondere, weil die Freisetzung von Substanzen aus den Schnecken bzgl. deren Körpergewicht in geeigneter Weise gemessen werden kann. Die Schnecken werden dann aus der Kultur isoliert und in einer belüfteten Kunststoffbox angeordnet, die mit einem feuchten Papiertuch ausgekleidet ist und werden sieben Tage vor Beginn des Experimentes bei 95% relativer Luftfeuchtigkeit bei 20°C gehalten. Die Schnecken wurden nicht in einer speziellen Weise gezüchtet, d. h. sie waren Wildschnecken. Es wird angenommen, dass noch genauere und reproduzierbarere Ergebnisse durch selektives Züchten der Schnecken erzielt werden können, obwohl dies, wie durch die Testergebnisse gezeigt wird, kein notwendiges Erfordernis der vorliegenden Erfindung ist, um genaue und nützliche Daten zu gewinnen.
Das Testverfahren ist einfach und schnell. Die chemische Substanz die getestet werden soll, wird direkt auf die Schleimhautmembran einer Schnecke aufgebracht, beispielsweise auf den Fuß, indem die Schnecke individuell in einer Petrischale angeordnet wird, die die Testsubstanz enthält. Schnecken, die mit phosphatgepufferter Salzlösung behandelt wurden, werden als Negativkontrolle verwendet. Als Positivkontrolle wurden Schnecken, die mit einer toxischen bekannten Substanz, nämlich Benzalkoniumchlorid behandelt wurden, verwendet.
Weil das Schleimhautepithel von Interesse an der Außenseite der Schnecke lokalisiert ist, kann die Wirkung der Substanzen in einfacher Weise beobachtet werden. Reizende Substanzen können eine erhöhte Schleimproduktion der Schnecken verursachen, die visuell beobachtet werden kann. Dies kann ebenfalls einfach durch Wiegen der Petrischale vor und nach der Behandlung der Schnecken mit der chemischen Substanz (wobei die Schnecken in jedem Fall entfernt werden) gemessen werden. Zusätzlich kann eine indirekte Reaktion einer Epithelschädigung, die durch eine chemische Substanz verursacht ist, durch Reduktion des Körpergewichts der Schnecken aufgrund des Ausströmens hämolymphatischer Flüssigkeiten durch die geschädigte Fuß-Oberfläche bestimmt werden.
Nach der Behandlung werden die Schnecken einzeln auf eine frische Petrischale übertragen, die Phosphat-gepufferte Salzlösung enthält. Nach einer geeigneten Expositionszeit, beispielsweise 1 Stunde, wird die Phosphat-gepufferte Salzlösung gesammelt und bzgl. des Vorhandenseins von Proteinen und/oder Enzymen, beispielsweise Lactatdehydrogenase und/oder alkalischer Phosphatase oder bzgl. anderer Markersubstanzen, die aus dem Fuß oder Epithel der Schnecke freigesetzt wurden, beispielsweise membranassoziierte Bestandteile wie beispielsweise Phospholipide oder Cholesterin, analysiert. Dieses Verfahren kann nach mehrstündigen Perioden wiederholt werden, um die Umkehrbarkeit der Zellschädigung, die durch die chemische Testsubstanz verursacht wurde, zu bestimmen. Die Konzentration oder die Menge der chemischen Substanz die getestet werden soll, kann verändert werden und der Einfluß der Konzentration kann in einfacher Weise überprüft werden. Die Expositionszeit kann ebenfalls, falls erforderlich, verändert werden. Die Schnecken können während mehrerer aufeinanderfolgender Tage behandelt werden, um die subchronische Wirkung der Substanzen auf die Fuß-Schleimhaut zu untersuchen.
Beispiel 1
Sieben Tage vor Beginn des Experimentes wurden die Schnecken in einer Kunststoffbox isoliert, die mit einem feuchten Papiertuch ausgekleidet war und wurden bei 95% relativer Luftfeuchtigkeit bei 20°C gehalten. Als Testsubstanzen wurden Didecanyol-L-α-phosphatidylcholin (DDPC) und Natriumdesoxycholat (SDC) ausgewählt. Benzalkoniumchlorid (1% G/V), SDC (1% G/V) und DDPC (1% G/V) wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt (PBS, pH 7,4). Die Schnecken wurden täglich während 15 min. mit der Testlösung während 5 Tagen inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden die Schnecken in einer Petrischale auf 500 μl PBS angeordnet. Die PBS wurde jede Stunde gesammelt bzw. eine Probe entnommen und für 6 Stunden nach der Behandlung mit 500 μl PBS aufgefrischt. Während des Testes wurden die Schnecken vorzugsweise in einem im allgemeinen ruhigen und normalen Zustand gehalten und wurden keinen mechanischen Vibrationen oder mechanischen oder elektrischen Störungen ausgesetzt, die die Schleim-Produktion beeinflussen können.
Die Enzyme (Lactatdehydrogenase (LDH) und alkalische Phosphatase (ALP)) und das in die PBS freigesetzte Gesamtprotein wurden bestimmt. Die Schnecken wurden vor und nach der Inkubationsperiode gewogen, um die Veränderung des Körpergewichts zu bestimmen. Die Schleim-Produktion wurde durch Wiegen der Petrischalen vor und nach der Behandlung mit einer Testsubstanz gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 und graphisch in den 1 bis 5 dargestellt.
Die Ergebnisse sind in den 3 bis 5 dargestellt. Die Gesamtproteinfreisetzung und die Gesamt-LDH-Freisetzung steigt gleichmäßig im Vergleich mit den stabilen Ergebnissen für die Kontrolle (PBS) und DDPC. Es existiert ebenfalls mehr ALP-Freisetzung als bei der Kontrolle oder DDPC. Diese Ergebnisse stellen klar identifizierbare Indikatoren bereit, dass Benzalkoniumchlorid oder SDC eine ernsthafte Membranschädigung verursachen, wohingegen die Behandlung mit PBS oder DDPC eine geringe oder keine Schädigung verursacht. Diese Ergebnisse stimmen nicht nur mit veröffentlichten Daten für diese Substanzen überein, wie sie durch andere Verfahren bestimmt wurden, sondern das Testverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ordnet die Testsubstanzen ebenfalls quantitativ in derselben Reihenfolge in eine Rangliste ein, wie sie durch andere Verfahren bestimmt wurde. Somit kann die vorliegende Erfindung ein Testverfahren bereitstellen, das nicht nur potentielle Veränderungen der humanen Schleimhaut bestimmt, wenn diese Veränderungen schwerwiegend sind, sondern kann auch ein analytisches Werkzeug bereitstellen, das verfeinert werden kann, um subtilere Empfindlichkeiten zu bestimmen, einschließlich physikochemischer Faktoren wie beispielsweise die Wirkungen der Wasser-zu-Lipid-Verteilung bei einem Arzneistoff, des pH, der Ionenstärke oder Osmolarität der Arzneistofflösung, der Ladung und Konzentration von Pufferspezies und sogar der Dosierungsform. Aufgrund der Einfachheit, mit der der Test durchgeführt werden kann, ist es in einer ökonomisch durchführbaren Zeit möglich, Tests mit variierten Parametern durchzuführen, wenn einmal ein initiales Screening dazu verwendet wurde, die Auswahl einzuengen. Von Anwendbarkeit in dieser Hinsicht sind die raschen und einfachen, jedoch weniger quantitativen Tests des Gewichtsverlustes und der Schleimproduktion (1 und 2), die ebenfalls eine zuverlässige Toxizitätsinformation bereitstellen können. Dies demonstriert, dass rasche Screening-Tests unter Verwendung dieser einfacheren analytischen Tests durchgeführt werden können, die den Vorteil aufweisen, dass sie keine komplexen Testgeräte, anspruchsvollen chemischen Analysen oder lange Zeit zur Vervollständigung erfordern. Überraschenderweise stellt die Verwendung von Wildschnecken genaue Ergebnisse mit einer minimalen Vor-Testkonditionierung bereit, was bedeutet, das ein Langzeitzucht-, Ernährungs- und achstums-Schritt vermieden werden kann, wodurch überraschend schnelle Ergebnisse bereitgestellt werden. Tabelle 1
wobei:

% WL: die Gewichtsreduktion (Gewichtsverlust) repräsentiert, verursacht durch die 15-minütige Behandlung, ausgedrückt als % des anfänglichen Körpergewichts des Tages und
% MP: die Schleim-Produktion repräsentiert, ausgedrückt als % des Körpergewichts zu Beginn des Tages vor der Behandlung.

Beispiel 2
In Beispiel 2 wurden Schnecken der Spezies Arion sieben Tage vor dem Start des Experimentes isoliert und bei 20°C und 95% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Als Testsubstanz wurde der β-Blocker Propranolol-HCl (1% G/V) verwendet. Benzalkoniumchlorid (1% G/V) und Propranolol (1% G/V) wurden in PBS (pH 7,4) hergestellt. Die Schnecken wurden täglich während 15 Minuten mit der Testlösung während vier Tagen inkubiert. Nach der lnkubationsperiode wurden die Schnecken auf 500 μl PBS in einer Petrischale angeordnet. Der PBS wurde jede Stunde eine Probe entnommen und mit 500 μl PBS für 3 Stunden nach der Behandlung aufgefrischt.
Die Enzyme (LDH, ALP) und das in das PBS freigesetzte Gesamtprotein wurden bestimmt. Die Veränderung des Körpergewichtes und die Schleim-Produktion, die durch die Behandlung verursacht wurde, wurde überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt und graphisch in den 6 bis 10 gezeigt. Tabelle 2
Tabelle 2 (Forts.)
wobei:

% WL: den Gewichtsverlust repräsentiert, ausgedrückt als % Reduktion des Körpergewichts, verursacht durch die 15-minütige Behandlung, und
% MP: die Schleim-Produktion repräsentiert, ausgedrückt als % des Körpergewichts zu Beginn des Tages vor der Behandlung.

Das Testergebnis zeigt, dass 1% Propranolol-HCl eine beträchtliche Reizung verursacht. Alle Indikatoren (6 bis 10) zeigten hohe Werte, wobei die Werte auf eine erhöhte Irritation im Vergleich zu Benzalkoniumchlorid hinwiesen. Nach 4 Tagen Behandlung mit 1% Propranolol-HCl waren alle Schnecken tot. Diese Ergebnisse zeigen, dass 1% Propranolol eine schwere Membranschädigung verursacht. Dies stimmt mit veröffentlichten Daten überein, die zeigen, dass klinische Tests bei Menschen unter Verwendung von Propranolol-HCl eine ernsthafte Ulzeration verursachten. Die Ergebnisse bestätigen, dass der Toxizitäts-Test gemäß der vorliegenden Erfindung dazu in der Lage ist, zuverlässig chemische Substanzen zu screenen, die eine ernsthafte Schädigung der humanen Mukosa verursachen und somit dem praktizierenden Mediziner ein nützliches Werkzeug in die Hand gibt, klinische Studien zu vermeiden, die Schädigungen von Menschen verursachen können. Das Iritationspotenzial von Propranolol-HCl wird ebenfalls durch die Reduktion des Körpergewichts und durch die Schleim-Produktion während der Behandlung gezeigt. Obwohl in diesem Test dich Schnecken bis zum Tod mit der reizenden Substanz in Berührung gehalten wurden, kann ein solcher Extremfall rascher beendet werden, wenn dieses Testverfahren auf einer regulären Basis verwendet wird. Der durch die Schnecken abgesonderte Schleim wies eine orange Farbe auf, wohingegen er normalerweise farblos ist. Die Produktion von orangem Schleim ist deswegen ein Hinweis auf eine schwere Irritation und der Test könnte normalerweise innerhalb einer kurzen Zeitspanne gestoppt werden, wenn dieser orange Schleim beobachtet wird, um den Schnecken unnötiges Unbehagen zu ersparen.
Beispiel 3
Schnecken der Spezies Arion und Limax wurden sieben Tage vor dem Beginn des Experimentes isoliert und bei 20°C und 95% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die Schnecken der Spezies Limax sind terrestrische Schnecken mit Lungen und auch einer kleinen inneren Schale. Als Testsubstanzen wurden Hydroxypropyl-β-cyclodextrin (HPβCD), Natriumtauro-24,25-dihydrofusidat (STDHF) und Natriumdesoxycholat ausgewählt. Benzalkoniumchlorid (1% G/V), HPβCD (5% G/V), STDHF (1% G/V) und SDC (1% G/V) wurden in Phosphat-gepufferter Salzlösung hergestellt (PBS, pH 7,4). Die Schnecken wurden täglich während 15 Minuten mit der Testlösung während fünf Tagen inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden die Schnecken auf 500 μl PBS in einer Petrischale angeordnet. Der PBS wurden jede Stunde Proben entnommen und mit 500 μl PBS für 6 Stunden nach der Behandlung aufgefrischt.
Die Enzyme Lactatdehydrogenase (LDH) und alkalische Phosphatase (ALP) und das in die PBS freigesetzte Gesamtprotein wurden bestimmt. Die Veränderung des Körpergewichtes und die Schleim-Produktion, die durch die Behandlung verursacht wurden, wurden überprüft. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 3 und 4 dargestellt, wobei die durch die Behandlung verursachte Reduktion des Körpergewichtes in den 11 und 12 dargestellt ist.
Eine Behandlung mit PBS und HPβCD verursacht keine Schleimproduktion und eine nur geringe Protein- und Enzymfreisetzung. STDHF verursachte eine erhöhte Schleim-Produktion, eine Abnahme des Körpergewichts und eine leicht erhöhte LDH Freisetzung für beide Spezies. Benzalkoniumchlorid und SDC verursachen eine schwere Membranschädigung und eine Reduktion des Körpergewichts auf ungefähr 50% des initialen Gewichtes. Die Ergebnisse der Spezies Arion, die mit SDC behandelt wurde, sind in Tabelle 1 (Beispiel 1) dargestellt.
Für beide Spezies Arion und Limax konnte dieselbe Rangfolge einer zunehmenden Toxizität erzielt werden: PBS, 5% HPβCD < 1% STDHF < 1% SDC und 1% BAC. Diese Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Daten für diese Substanzen überein, wie sie durch andere Verfahren bestimmt wurden. Tabelle 3
wobei:

% MP: Schleim-Produktion ausgedrückt als % des Körpergewichtes zu Beginn des Tages vor der Behandlung.

Beispiel 4
Die Schnecken der Spezies Arion wurden sieben Tage vor Beginn des Experimentes isoliert und bei 20°C und 95% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten. Die folgenden Lokalanästhetika wurden als Testsubstanz verwendet: Procain-HCl, Lidocain-HCl, Procain-HCl, Tetracain-HCl und Bupivacain HCl. Alle Testsubstanzen wurden in PBS (pH 7,4) bei 1% G/V Konzentrationen hergestellt. Die Schnecken wurden täglich während 15 Minuten mit der Testlösung während 5 Tagen inkubiert. Nach der Inkubationsperiode wurden die Schnecken in einer Petrischale auf 1 ml PBS angeordnet. Der PBS wurden jede Stunde Proben entnommen und mit 1 ml PBS für 3 Stunden nach der Behandlung aufgefrischt.
Das in die PBS freigesetzte Gesamtprotein wurde bestimmt. Die Veränderung des Körpergewichtes und die Schleimproduktion, verursacht durch die Behandlung, wurden überprüft. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 und in 13 dargestellt. Eine Behandlung mit PBS, Procain, Lidocain und Lidocain verursacht eine geringe oder keine Schädigung. Tetracain und Bupivacain hatten eine erhöhte Schleimproduktion und eine erhöhte Proteinfreisetzung zur Folge. Diese Ergebnisse stimmen mit publizierten Daten überein. Tabelle 5
Tabelle 5 (Forts)
wobei:

Die obigen Tests, die unter Bezugnahme auf die Beispiele 1 bis 4 beschrieben sind, sind keine erschöpfende Liste von Tests gemäß der vorliegenden Erfindung. Andere Tests sind im Umfang der vorrliegenden Erfindung mit eingeschlossen. Beispielsweise kann die Ziliarschlagfrequenz und der Beginn der Immotilität der Zilien ebenso wie die Umkehrbarkeit der Immotilität visuell am Fuß des Gastropoden beobachtet werden und kann als Test in den Umfang der vorliegenden Erfindung und der beigefügten Ansprüche mit eingeschlossen sein.
Die vorliegende Erfindung ist ebenfalls nicht auf in vivo Tests beschränkt, sondern schließt die Verwendung zumindest eines Teils eines Gastropoden zum in vitro Testen ein. Zur Durchführung eines in vitro-Testes werden die Eingeweide des Gastropoden unter Zurücklassung eines Muskelsackes und des Epithels entfernt. Diese können in physiologischer Salzlösung während der Durchführung der Tests lebensfähig gehalten werden, bei denen eine chemische Substanz auf den Fuß und/oder andere Epithelteile des Gastropoden aufgebracht wird. Ein Vorteil der Verwendung lebender Gastropoden besteht jedoch darin, dass die Tests über mehrere Tage hinweg durchgeführt werden können und eine quantitative Messung der Schleimhautexkretion der Gastropoden ermöglichen, wohingegen der in vitro Test am besten für schnellere Tests geeignet ist, beispielsweise den Ziliarschlag-Test oder den Immotilitätstest. Ein Vorteil des in vitro Toxizitäts-Tests gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass ein größerer Bereich an Gastropodenspezies in geeigneter Weise verwendet werden kann, wohingegen lebende Tiere manchmal ein einer Testumgebung schwieriger zu verwenden sein können.
Die Tests und die Ergebnisse, die oben beschrieben wurden, zeigen, dass die Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung ein Modell einer Schleimhautmembran von Wirbeltieren, beispielsweise von Menschen oder anderen Säugetieren, bereitstellen kann, einschließlich Darm-, Vaginal-, Bukkal-, Nasal- und Atemwegsschleimhaut, aus dem qualitative und quantitative Daten bzgl. der Toxizität chemischer Substanzen im Hinblick auf diese humanen oder andere Tierschleimhaut-Membranen genau, rasch und ökonomisch erzielt werden können. Ein besonderer Vorteil des Verfahrens gemäß der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass dasselbe Basistestverfahren und diesselbe Testausrüstung sowohl für rasche Screening-Tests als auch für genauere quantitative Tests verwendet werden kann.

Claims

Toxizitätstestverfahren, das zur Modellierung der Reizung einer Wirbeltier-Schleimhautoberfläche, insbesondere einer humanen oder anderen Säugetier-Schleimhautoberfläche, geeignet ist, die durch eine chemische Substanz verursacht ist, und das die folgenden Schritte umfasst: Bereitstellen zumindest eines Teils des Epithels des Körpers oder zumindest eines Teils des Fußes eines Gastropoden, wobei ein Gastropode ein Organismus der Klasse Gastropoda ist; und Exponieren des zumindest einen Teils des Epithels oder des zumindest einen Teils des Fußes des Gastropoden gegenüber der chemischen Substanz, die getestet werden soll.
Verfahren nach Anspruch 1, das weiterhin den Schritt umfasst, ein Charakteristikum bezüglich Substanzen zu beobachten, die von dem Gastropoden freigesetzt werden.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, das weiterhin den Schritt umfasst, den Gastropoden vor dem Expositionsschritt auf ein stabiles Gewicht zu bringen.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Beobachtungsschritt eine Beobachtung der Farbe des vom Gastropoden freigesetzten Schleims aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, wobei der Beobachtungsschritt ein Messen des Gewichts des Gastropoden vor und nach dem Expositionsschritt, ein Messen des Gewichts des Schleims, der aus dem Fuß des Gastropoden während und nach dem Expositionsschritt freigesetzt wird, ein Messen der Menge an Protein, die aus dem Fuß des Gastropoden während und nach dem Expositionsschritt freigesetzt wird, oder ein Messen der Menge eines Enzyms oder von Membran-assoziierten Bestandteilen, wie beispielsweise Phospholipiden oder Cholesterin, die aus dem Fuß des Gastropoden während und/oder nach dem Expositionsschritt freigesetzt werden, aufweist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Enzym allkalische Phosphatase oder Lactatdehydrogenase ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Protein das aus dem Fuß des Gastropoden während und nach dem Expositionsschritt freigesetzte Gesamtprotein ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Gastropode ein Lungen astropode ist.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Gastropode eine terrestrische Schnecke ist.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Schnecke der Spezies Arion oder Limax angehört.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Bereitstellungsschritt eine Entfernung zumindest der Eingeweide aus dem Gastropoden und ein Aufrechterhalten der physiologischen Lebensfähigkeit des verbleibenden Epithels und/oder Fußes einschließt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die chemische Substanz eine kosmetische oder eine pharmazeutische Formulierung ist.
Testverfahren, das die folgenden Schritte umfasst: Durchführen des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1–12 bezüglich einer ersten und einer zweiten chemischen Substanz; und Einordnen der ersten und zweiten chemischen Substanzen abhängig von den Ergebnissen der Exposition des zumindest einen Teils des Epithels oder des zumindest einen Teils des Fußes des Gastropoden gegenüber der ersten und zweiten chemischen Substanz.