DE60310646T2

DE60310646T2 - Verfahren und Zusammensetzungen zur Stabilisierung des Brain-Natriuretic-Peptids (BNP) in Blutproben

Info

Publication number: DE60310646T2
Application number: DE60310646T
Authority: DE
Inventors: New York Belensky. Alexander; Barry Mansfiled Bluestein
Original assignee: Bayer Corp
Current assignee: Siemens Healthcare Diagnostics Inc
Priority date: 2002-06-19
Filing date: 2003-06-18
Publication date: 2007-10-04
Anticipated expiration: 2023-06-19
Also published as: CA2430889A1; ES2279911T3; DE60310646D1; ATE349219T1; EP1378242B1; EP1378242A1; JP2004029021A; AU2003204649A1; US20040067889A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren, Zusammensetzungen und Sets zur Reduktion des proteolytischen Abbaus von Brain-Natriuretic-Peptid (BNP), wodurch dieses Peptid in Proben auf Blutbasis, wie z.B. Plasma und Serum, stabilisiert wird.
Hintergrund der Erfindung
Brain-Natriuretic-Peptid (BNP) ist ein spezifischer und empfindlicher Indikator für kongestive Herzinsuffizienz. BNP ist ein vasoreaktives Herzpeptidhormon, das hauptsächlich von den Herzventrikeln synthetisiert wird und von dort in den Blutkreislauf sekretiert wird (H. Shimizu et al., Clinica Chimica Acta 305, 181–186 (2001); H. Shimizu et al., Clinica Chimica Acta 285, 169–172 (1999)). Dieses Peptidhormon fördert die Natriurese und die Diurese, fungiert als Vasodilator und antagonisiert die vasokonstriktiven Wirkungen des Renin-Angiotensin-Aldosteron-Systems (A. Goginet-Georges et al., Clin. Chem. Lab. Med. 38 (6), 519–523 (2000)).
Da Plasmakonzentrationen von BNP mit der Abnahme der Herzfunktion, besonders der ventrikulären Funktion, zunehmen, ist die Messung der BNP-Konzentration im Blut für die Diagnose und Prognose von akutem Myokard-Infarkt (AMI) oder Herzversagen nützlich (E. Morita et al., J. Am. Coll. Cardiol. 88, 82–91 (1993); T. Tsutamoto et al., Am. Heart J. 117, 599–606 (1989); M. Mukoyama et al., Lancet 335, 801–802 (1990); T.A. McDonagh et al., Lancet 351, 9–13 (1998); T. Omland et al., Circulation 93, 1963–1969 (1996); T. Tsutamoto et al., Circulation 96, 509–516 (1997)). Da Herzerkrankungen und Herzversagen weltweit zu den schwer wiegenden Gesundheitsproblemen zählen, wurde BNP als biochemischer Marker zur Verwendung beim Screening von Patienten vorgeschlagen, um weitere Herzuntersuchungen und/oder Behandlungen auszuwählen (A. Goginet-Georges et al., Clin. Chem. Lab. Med. 38 (6), 519–523 (2000)).
Die Verwendung von BNP als diagnostischer Marker zur Identifikation von Patienten mit Herzerkrankungen, z.B. linke ventrikuläre systolische Dysfunktion, ist aufgrund der schlechten Stabilität des Peptids in Blutproben kompliziert (A. Goginet-Georges et al., Clin. Chem. Lab. Med. 38 (6), 519–523 (2000); H. Shimizu et al., Clinica Chimi ca Acta 305, 181–186 (2001); H. Shimizu et al., Clinica Chimica Acta 285, 169–172 (1999); D.R. Murdoch et al., Heart 81, 212–213 (1999); T. Tsuju et al., Clin. Chem. 40 (4), 672–673 (1994)). Sowohl das endogene BNP als auch synthetische Formen des Peptids neigen als Resultat von Proteolyse zu relativ schnellem Abbau im Blutplasma und Serum. Zusätzlich kommt es nach der Abtrennung des Plasmas von Vollblut zu einem schnellen Abbau von BNP. Dieser Abbau schreitet sogar bei Lagerung unter gekühlten Bedingungen voran, was eine genaue Messung von BNP in anderen Proben als in frischen Blutproben schwierig macht, es sei denn die frische Probe wird sofort eingefroren.
Obwohl nach dem Stand der Technik über Ansätze zur Stabilisierung von BNP in Blutproben berichtet wurde, ist jedoch keiner davon vollkommen zufrieden stellend, und die meisten sind ineffizient. Versuche, BNP in Patienten-Blutproben zu stabilisieren, umfassten beispielsweise die Verwendung von Sammelröhrchen aus einer bestimmten Zusammensetzung (H. Shimizu et al., Clinica Chimica Acta 285, 169–172 (1999)); die Zugabe von EDTA zu Blutproben (D.R. Murdoch et al., Heart 81, 212–213 (1999)) und die Zugabe einer Kombination aus Aprotinin und Benzamidin zu Blutproben (T. Tsuju et al., Clin. Chem. 40 (4), 672–673 (1994)).
Das Problem der Prävention oder der signifikanten Reduktion des BNP-Abbaus in Blutproben ist auf dem Gebiet der Hämatologie immer noch ein sehr lebendiges, und es werden bessere Verfahren und Lösungen zur Stabilisierung von BNP benötigt. Die vorliegende Erfindung stellt eine Lösung der bestehenden Schwierigkeit der Stabilisierung von BNP bereit, um dessen proteolytischen Abbau in Blutproben zu reduzieren oder zu verhindern.
Figurenbeschreibung
1 zeigt die Wirkung von Inhibitoren zur Reduktion des Abbaus von nativem (endogenem) BNP in einer Patientenprobe, die bei 4 °C gelagert wird, über einen bestimmten Zeitraum. In diesen Studien wurde PPACK in einer Konzentration von 35 μg/ml verwendet, und Leupeptin wurde in einer Konzentration von 50 μg/ml verwen det. In der Probe, die Inhibitoren enthielt, war nach etwa 25 Stunden Lagerung bei 4 °C signifikant mehr BNP vorhanden als im Vergleich zu der Probe, die keine Inhibitoren enthielt.
2 zeigt die Wirkung von Inhibitoren zur Reduktion des Abbaus von exogenem synthetischen BNP (10.000 pg/ml), das einem menschlichen Plasmapool hinzugefügt wurde (Intergen, Milford, MA). BNP in menschlichem Plasma war in Gegenwart von Inhibitoren nahezu 30 Tage lang stabilisiert – im Vergleich zu Plasma ohne Inhibitoren, dem BNP zugesetzt wurde. In diesen Studien wurde die folgende Kombination aus Inhibitoren verwendet: AEBSF, d.h. [4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid], (200 μg/ml), Antipain (100 μg/ml), Benzamidin (14 mM) und PPACK (35 μg/ml).
Zusammenfassung der Erfindung
In einem ihrer Aspekte bietet die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung von BNP in einer Körperflüssigkeitsprobe, insbesondere einer auf Blut basierenden Probe, wie z.B. Plasma oder Serum, vorzugsweise eine Plasmaprobe. Gemäß der Erfindung reduziert eine Stabilisierung von BNP dessen Abbau durch endogene Proteasen in der Probe. Das Verfahren der Erfindung umfasst die Zugabe von stabilisierenden Komponenten zu Blutproben, die BNP enthalten, entweder exogen hinzugefügtes oder endogenes BNP, oder in Gefäße oder Behälter, in die BNP enthaltende Blutproben gefüllt werden. Die stabilisierenden Komponenten umfassen eine oder mehrere Proteaseinhibitorverbindungen, die den proteolytischen Abbau von BNP reduzieren, gegen ihn schützen oder diesen verhindern. Die Inhibitorverbindungen umfassen Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin), N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain) und H-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK) sowie D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK) und Diisopropylfluorophosphat (DFP). Gemäß der Erfindung können die Verbindungen alleine oder als Kombination eingesetzt werden. Die Kombinationen können zwei, drei oder mehr der stabilisierenden Verbindungen als Gemisch umfassen. Zusätzlich kann der Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid (AEBSF) alleine oder in Kombination mit den zuvor genannten Inhibitoren eingesetzt werden. Beispiele für bevorzugte BNP-Inhibitor-Kombinationen umfassen Leupeptin und PPACK; Antipain und PPACK; Leupeptin und PPRACK; Antipain und PPRACK; Leupeptin, Antipain und PPACK; und Leupeptin, Antipain, PPRACK und DFP. Bevorzugte Inhibitoren, insbesondere für praktische Anwendungen, sind PPACK oder PPRACK. Die hierin beschriebenen BNP-Inhibitoren bieten im Vergleich zu zuvor verwendeten Verbindungen eine verbesserte Stabilisierung von BNP.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine stabilisierte Zusammensetzung von BNP bereit, die, alleine oder in Kombination, stabilisierte Inhibitorkomponenten umfasst. Genauer gesagt kann die Zusammensetzung Komponenten umfassen, die aus PPACK alleine, aus Antipain alleine oder aus Leupeptin alleine, aus einer Kombination von Leupeptin und PPACK; einer Kombination von Antipain und PPACK, einer Kombination von Leupeptin und Antipain; einer Kombination von Leupeptin, Antipain und PPACK und einer Kombination von Leupeptin, Antipain, PPACK und DFP oder Analoga, Varianten oder Derivaten davon ausgewählt werden oder Inhibitoren, die strukturell und/oder funktionell damit verwandt sind. Wenn etwa PPACK verwendet wird, so ist allgemein bekannt, dass PPRACK auch alleine oder in den zuvor genannten Kombinationen eingesetzt werden kann. Vorzugsweise umfasst die stabilisierende Kombination der Komponenten Leupeptin und PPACK (oder PPRACK). Die hierin beschriebenen stabilisierenden Komponenten können einer Blutprobe zugegeben, d.h. gespickt, werden, um das endogene BNP in der Probe zu stabilisieren und/oder um exogenes BNP zu stabilisieren, das ebenso einer Probe beigemischt werden kann. Die hierin beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen sorgen für eine signifikante Verbesserung der BNP-Stabilität in Blutproben, unter anderem Plasma- und Serumproben (z.B. Beispiel 5).
In einem anderen ihrer Aspekte stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung BNP-hältiger Blutproben bereit und zwar durch direkten Zusatz der oben genannten Inhibitorkomponenten und Kombinationen davon zu abgenommenen Blutproben, vorzugsweise Plasmaproben, vor, während oder kurz nach der Abnahme und vor dem Testen in einem Labor oder in klinischer Umgebung oder aber vor der Lagerung. Diese Komponenten dienen als BNP-Inhibitor-Additive zu frischen Proben sowie zu aufgetauten Proben, insbesondere frisch aufgetauten Proben von Blut, Plasma oder Serum. Die Verwendung von PPACK in einer wässrigen Zusammensetzung zur Stabilisierung von BNP in frischem oder aufgetautem Plasma wird bevorzugt.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen) Blutsammelbehälter oder -gefäß, wie z.B. ein Vakuumröhrchen (z.B. Vacutainer^TM), bereit, der/das zum Sammeln von Vollblut verwendet wird, umfassend eine oder eine Kombination, z.B. einen Cocktail, der Inhibitorkomponente(n), die z.B. aus Antipain, Leupeptin, PPACK, PPRACK und DFP ausgewählt werden. Blutproben, insbesondere BNP-hältige Proben, werden in solchen Blutsammelbehältern oder -gefäßen gesammelt, in denen sich, wie beschrieben, ein oder mehrere Inhibitor(en) befindet/befinden. In diesem Aspekt sind die zuvor hinzugefügten Inhibitorkomponenten, wie z.B. Leupeptin und PPACK, vorhanden, um BNP sofort nach der Einführung der Probe in den Behälter oder das Gefäß in einer abgenommenen Blut- oder Plasmaprobe zu stabilisieren.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung stabile Plasmavergleiche zur BNP-Bestimmung bereit. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung können Vergleiche hergestellt werden, indem eine festgesetzte Menge an exogen hinzugefügtem BNP, z.B. eine rekombinant produzierte oder synthetische Form von BNP, wie z.B. BNP-32 (D.R. Murdoch et al., Disparity between studies of the stability of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous peptide, Heart 81, 212 (1999)), zu einer menschlichen, auf Blut basierenden Matrix, z.B. einer Plasma-Matrix, beigemischt wird, worin die Matrix gemäß vorliegender Erfindung eine oder mehrere der hinzugefügten Inhibitorkomponenten enthält, z.B. Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK, DFP oder Kombinationen davon. Dieses Merkmal der Erfindung überwindet frühere Schwierigkeiten der Herstellung von Plasmamatrixvergleichen aufgrund des schnellen Abbaus von beigemischtem BNP durch endogene Proteasen während der Herstellung sowie des Wertezuordnungsvorgangs für solche Vergleiche.
In einem weiteren Aspekt umfasst die vorliegende Erfindung die Einführung von zumindest einer – oder einem Cocktail aus einer Kombination – der Inhibitorkomponenten Antipain, Leupeptin, PPACK, PPRACK und/oder DFP in BNP-hältige Blutproben, unter anderem Plasma- und Serumproben. Die Erfindung stellt stabile Zusammensetzungen bereit, die BNP und die Inhibitorkomponenten umfassen. Als bevorzugtes Beispiel stellt die Einbeziehung der Kombination aus Leupeptin und PPACK in auf Blut basierende Matrices vor der Zugabe von exogenem, z.B. synthetischem, BNP ein stabiles Vergleichsmaterialpräparat bereit, z.B. für kommerzielle BNP-Vergleiche, die in einer menschlichen oder tierischen Plasma-Matrix stabil sind.
Weitere Aspekte, Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der Lektüre der ausführlichen Beschreibung der Erfindung.
Detallierte Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Zusammensetzungen, die eine oder mehrere Proteaseinhibitorkomponenten umfassen, die den Abbau des Herzpeptidhormons BNP in Blutproben, insbesondere Plasma- und Serumproben, inhibieren oder reduzieren. BNP-Abbau während der Abnahme, der Lagerung und des Testens der Probe kann zu fälschlicherweise verringerten oder negativen Testergebnissen und für klinisch oder medizinisch getestete Patientenproben zu einer falschen Probenklassifizierung führen. Gemäß vorliegender Erfindung reduziert oder inhibiert die Zugabe einer oder mehrerer der neu gefundenen BNP-stabilisierenden Komponenten, wie sie hierin beschrieben sind, zu Blut, insbesondere Blutplasma, den BNP-Abbau signifikant und ermöglicht eine genauere und verlässlichere Interpretation der Probe. Die Verfahren und Zusammensetzungen, die die BNP-stabilisierenden Materialien gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, sorgen für genauere BNP-Konzentrationsmessungen in Routinetests für die Diagnose und die Behandlung von Patienten, die auf Herzversagen und/oder Herzerkrankungen getestet werden oder bei denen ein Verdacht darauf besteht.
Die Komponenten, von denen herausgefunden wurde, dass sie, alleine oder in Kombination, z.B. als Cocktail aus mehr als einer Komponente, gemäß dieser Erfindung bessere BNP-stabilisierende Eigenschaften aufweisen, umfassen die Proteaseinhibitoren Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin); N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain), (Sigma Aldrich, St. Louis, MO; Calbiochem, San Diego, CA) und N-D-Phe- Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK), (Bachem-Penninsula Labs, San Carlos; CA), sowie H-D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK) (Calbiochem, San Diego, CA) und Diisopropylfluorophosphat (DFP), (Calbiochem, San Diego, CA). Zusätzlich kann der Inhibitor 4-(2-Aminoethyl)benzensulfonylfuorid (AEBSF) oder strukturell mit AEBSF verwandte Verbindungen, alleine oder in Kombination mit den zuvor genannten Inhibitoren, eingesetzt werden. Diese stabilisierenden Komponenten oder Zusammensetzungen, die diese Komponenten umfassen, können verwendet werden, um endogenes BNP in Blutproben zu stabilisieren, sowie BNP, das exogen Blutproben zugegeben, z.B. beigemischt, wird.
Gemäß vorliegender Erfindung stabilisiert einer oder mehrere der oben genannten Inhibitoren BNP und reduziert oder verhindert dessen Abbau durch Proteasen in einer Blut- (Plasma-) Probe. Alleine und in Kombination mit Antipain, Leupeptin oder beiden wurde besonders von PPACK neu herausgefunden, dass es die Stabilität von BNP stark verbessert. Wurden sie direkt zu Blutplasmaproben von Tieren (Säugetieren), vorzugsweise Menschen, hinzugefügt, so stabilisierten die Inhibitoren, vorzugsweise Leupeptin und PPACK, oder Antipain und PPACK, in Kombination, BNP in den Proben bei Raumtemperatur und bei 4 °C, sogar nach wiederholtem Einfrieren und Auftauen (Beispiel 1).
Die Stabilisierungsfähigkeit der zuvor genannten Inhibitoren wurde basierend auf einer Evaluierung der Struktur von BNP bestimmt, die Regionen umfasst, die besonders anfällig für Proteolyse sein könnten, z.B. eine Region des zirkulären Teils von reifem BNP-32, die die Reste -Phe-Gly-Arg umfasst. Dementsprechend sind Inhibitoren der vorliegenden Erfindung, z.B. PPACK und PPRACK, ohne Einschränkung, mit strukturellen Ähnlichkeiten zu den Phe-Gly-Arg-Resten in BNP besonders zur Stabilisierung von BNP geeignet. Ohne dabei an eine bestimmte Theorie gebunden zu sein, bedeutet jedoch eine strukturelle Ähnlichkeit mit BNP für einen Inhibitor, dass er eine bevorzugte, bessere BNP-Stabilisierungsfunktion aufweist. Zusätzlich kann BNP in den weiters hierin beschriebenen Vergleichsmaterialien und stabilisierenden Zusammensetzungen modifiziert werden, um die ihm eigenen Arginin- (Arg-) Reste und verwandte Fragmente vor Abbau zu schützen, z.B. durch Ersetzen der natürlichen Aminosäurereste, die in den Abbau von BNP-32 involviert sind, durch Moleküle, die die Beständigkeit von BNP gegen Proteolyse erhöhen können. Als nicht einschränkendes Beispiel kann ein stabileres BNP D-Arg anstatt von nativem L-Arg enthalten. Weiters können auch wirksamere, BNP-stabilisierende Verbindungen unter Verwendung dieses Grundprinzips geschaffen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch Stabilisierungsverfahren oder -zusammensetzungen, die zusätzlich ein oder mehrere PPACK-Analoga, -Varianten oder -Derivate umfassen, um BNP zu stabilisieren. Ein Beispiel für eine mit PPACK verwandte Verbindung, die zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung geeignet ist, ist PPRACK (D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon) (Calbiochem, San Diego, CA).
In einer speziellen, verwandten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wurde gezeigt, dass die Inhibitoren Diisopropylfluorophosphat (DFP) (Calbiochem, San Diego, CA) und PPRACK BNP genauso wirksam stabilisierten wie Antipain, Leupeptin und PPACK (siehe Beispiel 5, Tabelle 11). Dementsprechend umfasst die Erfindung DFP und/oder PPRACK, die in den hierin beschriebenen Zusammensetzungen und Verfahren alleine oder in Kombination mit einem oder mehreren von Antipain, Leupeptin und PPACK eingesetzt werden.
Diese Erfindung umfasst zahlreiche praktische Anwendungen, unter anderem (i) das Hinzufügen der beschriebenen BNP-Abbau-Inhibitoren im Verlauf des Vorgangs der Abnahme von Blut- oder Plasmaproben, um einen BNP-Abbau in der Probe während der Handhabung vor den Tests zu verhindern; (ii) das Hinzufügen der Inhibitoren zu Blut- oder Plasmaproben nach der Abnahme, um einen Abbau von BNP während der Vorbereitung zum Testen und während des Testens zu verhindern; und (iii) das Hinzufügen der Inhibitoren zu Plasma oder einer serumfreien Basis zur Herstellung von Vergleichen oder medizinischen Entscheidungspools unter Verwendung von entweder endogenem oder synthetischem BNP. Diese Anwendungen werden hierin näher beschrieben.
In einer Ausführungsform gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, in dem eine oder mehrere der stabilisierenden Komponenten Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK und/oder DFP in menschliche oder tierische Blutproben eingeführt werden, um das BNP darin zu stabilisieren. Vorzugsweise ist die Probe eine Plasmaprobe. Noch bevorzugter ist die Probe eine menschliche Plasmaprobe. Die Stabilisierung von BNP in Blutproben von Tieren (Säugetieren), die nicht Menschen sind, z.B. Hunden, Katzen, Rindern, Pferden, Schafen oder Schweinen, wird ebenso in Betracht gezogen, z.B. für veterinärmedizinische Anwendungen.
Die BNP-stabilisierenden Komponenten der vorliegenden Erfindung umfassen die Proteaseinhibitoren Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK und/oder DFP, die alleine oder in Kombination verwendet werden, um BNP in einer Blut- oder Plasmaprobe zu stabilisieren, d.h. um dessen Abbau zu verringern oder zu eliminieren. Obwohl jede Inhibitorkomponente Wirksamkeit bei der Stabilisierung von BNP in Plasmaproben über einen gewissen Zeitraum zeigt, erzielen Kombinationen der Inhibitorkomponenten, wie z.B. eine Kombination von Leupeptin und PPACK oder eine Kombination von Antipain und PPACK oder eine Kombination von Antipain, Leupeptin und PPACK, signifikante BNP-stabilisierende Wirkung über einen gewissen Zeitraum bei Raumtemperatur und bei 4 °C sowie nach dem Auftauen von gefrorenen Proben (siehe beispielsweise die Beispiele 1–3 und 7). Die Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung ermöglichen daher eine genaue Analyse von BNP-hältigen Blutproben mit verlässlichen Werten für BNP, die unter Bedingungen erhalten wurden, die in der medizinischen Anwendung, wie z.B. in Kliniken, klinischen Labors, Krankenhausstationen und Ordinationen, routinemäßig angetroffen werden. Zusätzlich stellt die vorliegende Erfindung vorteilhafte Verfahren und Zusammensetzungen bereit, um wirksamere(n) und einfachere(n) Abnahme und Transport von Blutproben in eine Klinik oder ein Labor zur BNP-Analyse zu ermöglichen.
Zur Verwendung als stabilisierende Komponente in Blut- und Plasmaproben sind die hierin beschriebenen Proteaseinhibitoren in der Probe in einer BNP stabilisierenden Menge enthalten. So ist beispielsweise, ohne Einschränkung, Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin) in einer Probe in einer Menge von etwa 0,5 μg/ml bis etwa 55 μg/ml, vorzugsweise von etwa 5 μg/ml bis etwa 50 μg/ml und noch bevorzugter von 45 μg/ml bis etwa 55 μg/ml, enthalten; N-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK) oder D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK) ist in einer Probe in einer Menge von etwa 0,35 μg/ml bis etwa 38 μg/ml, vorzugsweise von etwa 3,5 μg/ml bis etwa 35 μg/ml und noch bevorzugter von etwa 32 μg/ml bis etwa 38 μg/ml, enthalten; und Antipain ist in einer Probe in einer Menge von etwa 0,5 μg/ml bis etwa 55 μg/ml, vorzugsweise von etwa 5 μg/ml bis etwa 50 μg/ml und noch bevorzugter von etwa 45 μg/ml bis etwa 55 μg/ml, enthalten. DPF ist vorzugsweise in einer Menge von etwa 2 μg/ml bis etwa 200 μg/ml, noch bevorzugter in einer Menge von etwa 18 μg/ml (100 μM), enthalten.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst eine stabilisierte Zusammensetzung, die die hierin beschriebenen BNP stabilisierenden Komponenten, alleine oder in Kombination, in einer Plasma-Matrix, vorzugsweise einer menschlichen Plasma-Matrix, umfasst. Die stabilisierte Zusammensetzung, die zur Verwendung als Vergleich für klinische und medizinische Anwendungen geeignet ist, umfasst einen oder mehrere der Stoffe Leupeptin, Antipain und/oder PPACK, die den proteolytischen Abbau von BNP in der Probe, d.h. der Plasma-Matrix, reduzieren oder verhindern. Zusätzlich kann die stabilisierte Zusammensetzung DFP und/oder PPRACK alleine, in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Inhibitoren gemäß der Erfindung umfassen. Werden Kombinationen der stabilisierenden Komponenten eingesetzt, so kann die stabilisierte Zusammensetzung als nichteinschränkende Beispiele Leupeptin und PPACK in Kombination; Leupeptin und Antipain in Kombination; Antipain und PPACK in Kombination; Antipain, Leupeptin und PPACK in Kombination; Leupeptin und PPRACK in Kombination; Antipain und PPRACK in Kombination; Antipain, Leupeptin und PPRACK in Kombination; DFP und PPACK in Kombination; DFP und PPRACK in Kombination; DFP und Antipain in Kombination, DFP und Leupeptin in Kombination; DFP, Antipain, Leupeptin und PPACK in Kombination; DFP, Antipain, Leupeptin und PPRACK in Kombination; DFP, Antipain, Leu peptin, PPACK und PPRACK in Kombination umfassen, um einen Cocktail dieser stabilisierenden Bestandteile bereitzustellen.
Die stabilisierenden Bestandteile können alleine oder gemeinsam formuliert oder kombiniert werden, falls gewünscht gefriergetrocknet werden oder vor der Verwendung in wässriger Lösung oder wässrigem Puffer gelöst werden und als Additiv in frisch hergestellte Laborproben eingeführt werden. Alternativ dazu können die stabilisierenden Bestandteile, die einen oder mehrere der Stoffe Antipain, Leupeptin, PPACK, PPRACK oder DFP umfassen, direkt als wässrige Lösung bereitgestellt werden, von der eine wirksame, BNP stabilisierende Menge vor der anfänglichen Messung von BNP zu der Plasma- oder Blutprobe, falls erforderlich oder gewünscht, hinzugefügt werden kann. Vorzugsweise, jedoch ohne Einschränkung wird/werden der/die Inhibitor(en) gemäß der vorliegenden Erfindung innerhalb von etwa 5 bis 30 Minuten oder weniger nach der Abtrennung des Plasmas vom Vollblut mittels Abzentrifugieren hinzugefügt; die Proben werden vorzugsweise zur Lagerung eingefroren. Falls Serum als Probentyp verwendet werden soll, werden die Inhibitoren vor der Abnahme von Vollbluts dem Sammelröhrchen zugesetzt, da der Koagulationsvorgang BNP zerstört.
Die stabilisierenden Komponenten können in konzentrierter Form bereitgestellt werden, so dass lediglich ein Tropfer voll mit einem konzentrierten Proteaseninhibitor-Präparat zu einer Blut- oder Plasmaprobe hinzugefügt werden kann, ohne eine signifikante Verdünnung des Bluts oder des Plasmas zu bewirken. Dementsprechend können die stabilisierenden Komponenten in einer/-m Tropfphiole oder Tropfbehälter bereitgestellt werden, z.B. einem Behälter, der geeignet ist, eine Tropfpipette oder eine ähnliche Vorrichtung, oder sogar eine Spritze, aufzunehmen, um die Abgabe der Komponenten in eine Probe zu erleichtern. Die Komponenten sind vorzugsweise in einer Kombination, z.B. einer Kombination von Leupeptin und PPACK oder einer Kombination von Antipain und PPACK, in der der Probe zuzusetzenden konzentrierten Formulierung vorhanden. Zusätzlich kann eine) Tropfphiole oder -behälter, die/der eine Proteaseinhibitor-Zusammensetzung der Erfindung enthält, in einem Set zur Durchführung eines Tests zur BNP-Detektion in Blut- oder Plasmaproben inklu diert werden. Solch ein Aspekt zur Bereitstellung von stabilem BNP ist besonders für kommerzielle Anwendungen von Vorteil, da Plasma routinemäßig in verschiedenen Intervallen vor der tatsächlichen analytischen BNP-Messung als Analyt in einer Patientenprobe abgetrennt wird.
Als Richtlinie können konzentrierte Inhibitor(en) in einer Konzentration von etwa 5–10 mg/ml in gefrorener Form als nicht einschränkendes Beispiel; oder als trockenes Pulver, mit etwa 5–10 mg/Phiole als nicht einschränkendes Beispiel bereitgestellt werden, um einfache Verdünnung auf etwa 5–10 mg/ml zu ermöglichen. 5- bis 10-mg/ml-Lösungen ergeben typischerweise ein 100x- bis 200x-Stammmaterial zur weiteren Zugabe zu BNP-hältigen Proben, z.B. in einem Verhältnis vom 1fachen bis zum 99- bis 199fachen Volumen.
In einer weiteren Ausführungsform umfassen Vergleichsmaterialien, wie z.B. medizinische Entscheidungspools, Materialien, die in derselben, auf Blut basierenden Matrix, z.B. Plasma, hergestellt sind wie die zu analysierende Probe, z.B. eine menschliche Plasmaprobe. Diese Vergleichsmaterialien müssen genau sein und stabile Komponenten enthalten, da sie als Standards dienen, auf deren Basis klinische Entscheidungen bezüglich der Behandlung von Patienten und der Resultate getroffen werden. Zur Veranschaulichung weisen die Vergleiche festgelegte Werte oder Spiegel von enthaltenen Materialien, wie z.B. BNP, auf; die festgelegten Werfe oder Spiegel entsprechen einem Grenzwert, d.h. einem Wert, der dazu dient, eine medizinische Feststellung oder Entscheidung bezüglich eines Patienten zu treffen, z.B. die Menge oder der Spiegel an in der Probe eines Patienten enthaltenem BNP. Vergleiche, die bestimmte Bereiche festgelegter Werte an stabilisiertem BNP aufweisen, die auf speziellen Grenzwerten basieren, können für verschiedene Anwendungen hergestellt werden, z.B. zum Screening einer Patientenprobe auf das Risiko eines Herzanfalls, eines Infarkts, weiterer Herzerkrankungen und dergleichen; zum Verfolgen der Therapie eines Herzpatienten; und/oder zur Einstufung eines Herzpatienten bezüglich des Grads oder der Schwere einer Herzerkrankung.
In dieser Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die stabilisierenden Komponenten, wie z.B. Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK, DFP und Kombinationen davon, bei der Produktion von Vergleichsmaterialien von Vorteil, die BNP in einer Blut-Matrix umfassen, um den Abbau von BNP über eine gewisse Zeit und/oder nach dem Einfrieren und Auftauen zu verhindern oder signifikant zu reduzieren. Die Verwendung eines oder mehrerer der BNP-stabilisierenden Inhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung zur Herstellung von Vergleichsmaterialien ermöglicht die Herstellung einer großen Anzahl an Vergleichsproben (z.B. tausende) unter Verwendung großer Mengen an Material (z.B. Plasma). Zusätzlich können diese Vergleichsmaterialien gelagert werden und bleiben im Zeitverlauf stabil, da die Mengen der Komponenten, wie z.B. BNP, in diesen Vergleichsmaterialien im Zeitverlauf stabil bleiben. Weiters weichen die BNP-Werte, wie z.B. eingespicktes oder exogen hinzugefügtes BNP, nicht signifikant vom anfänglich festgelegten Wert oder Grenzwert des Vergleichs ab, so dass die später abgelesenen Werte in den gelagerten Vergleichsmaterialien praktisch konstant und verlässlich stationär bleiben. Gemäß dieser Ausführungsform können die Inhibitoren, alleine oder in Kombination, vor oder während der Zugabe von exogenem BNP (z.B. synthetischem BNP) zu den auf Blut basierenden (z.B. Plasma-) Matrizen hinzugefügt werden, um die Vergleichsmaterialien zur Verwendung bei der BNP-Analyse und der Quantifizierung von Patienten-Blutproben herzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform stellt diese Erfindung eine Zusammensetzung stabilisierender Komponenten bereit, nämlich einen oder mehrere der Inhibitoren Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK, DFP oder Kombinationen davon, die zur Verwendung zum Zeitpunkt der Abnahme von Vollblut in einem Blutabnahmeröhrchen oder einem Vacutainer-Röhrchen vorhanden sind. Bei Zugabe der stabilisierenden Komponenten vor der Blutabnahme wird jegliches, in der Probe vorhandenes BNP während der Abnahme stabilisiert. Die stabilisierende Zusammensetzung der Erfindung kann die beschriebenen Proteaseinhibitoren, z.B. Leupeptin, Antipain, PPACK, PPRACK und/oder DFP, alleine oder in Kombination, entweder in einer kleinen Menge konzentrierter, wässriger Lösung oder in gefriergetrockneter Form, die sich bei Zusatz der Blutprobe auflöst oder die mit einer geringen Menge an wässriger Lösung kurz vor der Abnahme der Blutprobe aufgelöst wird, im Abnahmeröhrchen umfassen. Um eine Verdünnung der abgenommenen Probe zu vermeiden, wird die Verwendung eines Volumens der konzentrierten Inhibitor(en)-Lösung empfohlen, das 1 % des Probenvolumens nicht übersteigt. Es sollten beispielsweise nicht mehr als 60 μl an konzentriertem/-n Inhibitor(en) oder Inhibitorgemisch zu einem typischen 6-ml-Abnahmeröhrchen zugesetzt werden.
In einer speziellen Ausführungsform wird eine Kombination von Leupeptin und PPACK zu auf Blut basierenden Matrizen, z.B. menschlichem Plasma, hinzugefügt, bevor exogenes synthetisches BNP zugegeben wird, um Vergleichsmaterialien, medizinische Entscheidungspools und dergleichen herzustellen. Vergleiche und medizinische Entscheidungspools können ebenso unter Verwendung einer Kombination von stabilisierenden Komponenten und endogenem BNP hergestellt werden.
In einer anderen Ausführungsform umfasst die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Stabilisierung BNP-hältiger Blutproben durch direktes Hinzufügen der Inhibitorkomponenten und Kombinationen davon zu abgenommenen Blutproben, vorzugsweise Plasmaproben, und zwar vor, während oder kurz nach der Abnahme und vor dem Testen in einem Labor oder in klinischer Umgebung. Diese Komponenten dienen als BNP-Inhibitoradditive zu frischen Proben sowie zu aufgetauten Proben, insbesondere frisch aufgetauten Proben von Blut, Plasma oder Serum. Die Verwendung einer Kombination von Leupeptin und PPACK oder Leupeptin und PPRACK in einer wässrigen Zusammensetzung, um BNP in frischem oder aufgetautem Plasma zu stabilisieren, wird bevorzugt.
Von manchen dieser Proben wurde herausgefunden, dass sie unterschiedliche Aggressivität gegenüber BNP aufweisen, so dass sich BNP sehr schnell zersetzt. Dies könnte auf die ungewöhnlich schnelle BNP-Zersetzung in gewissen Probensätzen als Resultat von in einer Probe enthaltenen aktiveren oder stärkeren Proteasen im Vergleich zu anderen zurückzuführen sein. Wie dies beispielsweise in Tabelle 1 gezeigt wird, zeigte eine Probe eines Patienten aggressiven proteolytischen Abbau von BNP (d.h. > 50 % Verlust innerhalb von 24 Stunden nach Lagerung bei 4 °C); durch Zusatz von Proteasen gemäß der vorliegenden Erfindung wurde diese Proteolyse signifikant reduziert. Tabelle 1

*: Diese Probe stellt eine menschliche Probe für kongestive Herzinsuffizienz (CHF) dar, New York Heart Association (NYHA) Klasse II von ProMedDx (Norton, MA).

Somit erfolgt die Zugabe von Inhibitoren) zu einer Probe vorzugsweise möglichst bald nach der Abnahme (z.B. innerhalb von Minuten; vorzugsweise innerhalb von etwa 5 Minuten oder weniger). Die Verwendung der Inhibitoren gemäß der vorliegenden Erfindung bietet gute (z.B. etwa 90 %) Wiederfindung von exogenem BNP in menschlichem Plasma, das bei Raumtemperatur (etwa 20 °C) etwa 44 Stunden lang gelagert wurde. Zusätzlich zeigt die folgende Tabelle 2 eine Dosiswiederfindung von synthetischem BNP (2000 pg/ml), das menschlichen Plasmaproben (Intergen) beigemischt wurde, mit und ohne Leupeptin (50 μg/ml) und PPACK (35 μg/ml) als zugesetzte Inhibitoren.
Tabelle 2
Für Proben mit höheren BNP-Zersetzungsraten kann eine akzeptable Lagerungszeit jedoch viel kürzer sein. Die Lagerung der Probe (und von BNP) beträgt daher vorzugsweise eine Zeitspanne, die das Aussetzen von BNP gegenüber Temperaturen über 0 °C minimiert, sogar in Gegenwart von Inhibitor(en).
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung stabile Plasmavergleiche zur BNP-Bestimmung bereit. Gemäß diesem Aspekt der Erfindung können Vergleiche hergestellt werden, indem eine festgesetzte Menge an exogen hinzugefügtem BNP, z.B. eine rekombinant produzierte oder synthetische Form von BNP, wie z.B. BNP-32 (D.R. Murdoch et al., Disparity between studies of the stability of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous peptide, Heart 81, 212 (1999)), in eine menschliche, auf Blut basierende Matrix, z.B. eine Plasma-Matrix, gespickt wird, wobei die Matrix gemäß vorliegender Erfindung eine oder mehrere der hinzugefügten Inhibitorkomponenten, d.h. Leupeptin, Antipain, PPACK oder Kombinationen davon, enthält. Dieses Merkmal der Erfindung überwindet frühere Schwierigkeiten bei der Herstellung von Plasmamatrixvergleichen aufgrund des schnellen Abbaus des beigemischten BNP durch endogene Proteasen während der Herstellung und des Wertezuordnungsvorgangs für solche Vergleiche. Mit einer oder mehreren der stabilisierenden und Inhibitor-Komponenten, wie z.B. Leupeptin und PPACK (oder PPRACK), in der Plasmamatrixprobe besitzt die Probe nachweisbare Stabilität, z.B. bei 4 °C für zumindest 17 Stunden, ohne Verlust an Aktivität.
Die nachstehende Tabelle 3 stellt beispielsweise die Stabilitäts-Resultate von synthetischem BNP-32 dar, das zu normalem menschlichem Plasma hinzugefügt wurde, das gemäß der Erfindung sowohl Leupeptin (50 μg/ml) als auch PPACK (35 μg/ml) enthielt: Tabelle 3
Tabelle 4 zeigt, dass bei Raumtemperatur (RT) (22 °C) die Stabilität von BNP-32 in der Plasmaprobe, welche die Inhibitorkombination enthielt, wie oben unter Bezugnahme auf Tabelle 3 beschrieben, nur geringfügig geringer war als die Stabilität bei 4 °C.
Tabelle 4
Beispiele
Die folgenden Beispiele beschreiben spezifische Aspekte der Erfindung, um die Erfindung zu verdeutlichen, und stellen eine Beschreibung der vorliegenden Verfahren für den Fachmann bereit.
Beispiel 1
Es wurden Versuche durchgeführt, um die Wirksamkeit der BNP stabilisierenden Inhibitorverbindungen, wie sie hierin beschrieben werden, sowohl alleine als auch in Kombination, zu testen und zwar unter Verwendung eines Immuntests zur Detektion von synthetischem BNP-32 in Proben.
In den in diesem Beispiel beschriebenen Versuchen wurde auf Stabilität von synthetischem BNP-32 in Plasma getestet. Zur Durchführung der Versuche wurden Proteaseinhibitoren normalem menschlichem Plasma hinzugefügt („eingespickt"), gefolgt von der Zugabe einer bekannten Menge an BNP. Normales menschliches Plasma ohne Inhibitorzusatz wurde als Vergleich verwendet. Das Signal, das durch das in den Plasmaproben mit und ohne Inhibitoren vorhandene BNP erzeugt wurde, wurde sofort nach dem Spicken sowie nach Lagerung der Proben bei 4 °C gemessen.
Zur Erzeugung eines Analysensignals zur Quantifizierung BNP-Konzentration in der Probe wurden zwei monoklonale BNP-spezifische Antikörper verwendet (Shionogi & Co, LTD, Osaka, Japan; EP 542.255 A1/B1; JP 3297392 ). Der erste Antikörper wurde mit Acridiniumester (AE) markiert, und der zweite Antikörper wurde mit Biotin markiert. Die beiden Antikörper binden an in den Plasmaproben vorhandene BNP-Moleküle, um einen Komplex zu bilden; der gebildete Komplex wurde mit paramagnetischen Partikeln (PMP) eingefangen, die mit Streptavidin überzogen waren. Die PMP wurden mittels Magnetfelds abgetrennt und gewaschen, um nichtspezifisch gebundenes Material zu entfernen. Auf den PMP zurückgehaltene BNP-AE-Komplexe wurden mit einer alkalischen Lösung behandelt, um ein Chemolumineszenzsignal zu erzeugen, das proportional zur Menge an eingefangenem BNP war; das Signal wurde in relativen Lichteinheiten oder „RLU" gemessen. Der Test wurde auf einem automati sierten Chemilumineszenzsystem ADIVA: Centaur^TM (Bayer Corporation, Tarrytown, NY), unter Verwendung von bereits beschriebenen BNP-Detektionsreagenzien (z.B. B. Bluestein et al., Development of an automated test for BNP as an aid in the diagnosis and evaluation of CHF on the Bayer ADIVA Centaur ACS, Clinical Chemistry 48 (S6), A85, Abstract C37 (2002)) durchgeführt. Die Resultate der Versuche sind in Tabelle 5 angegeben.
In Tabelle 5 wurden Vergleichsstandards (S1–S7) in Phosphatpuffer bis zur Verwendung eingefroren. Diese Standards wurden gravimetrisch durch Spicken von synthetischem BNP in physiologische Pufferlösung hergestellt. Spalte 1 in Tabelle 5 gibt die getesteten Proben an: Standards, S1–S7; Intergen's Human Plasma Pool (IHPP), im Handel bei Intergen (Milford, MA) erhältlich, umfassend normales EDTA-Plasma, das von gesunden menschlichen Spendern erhalten wurde und durch von der FDA anerkannte Verfahren negativ bezüglich Heptatis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus und HIV getestet wurde; AEBSF- (d.h. [4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid]-) Inhibitor; Antipain-Inhibitor; Benzamidin-Inhibitor; PPACK-Inhibitor; und KCBB- (Kansas City Blood Bank-) Plasma Pool, der gepooltes normales EDTA-Plasma von gesunden menschlichen Spendern umfasste, das durch von der FDA anerkannte Verfahren negativ bezüglich Heptatis-B-Virus, Hepatitis-C-Virus und HIV getestet wurde.
Spalte 2 in Tabelle 5 gibt, sofern vorhanden, die BNP-Konzentration [BNP] an. Die Spalten 3–8 in Tabelle 5 zeigen ein Stabilitätsprofil von BNP in Plasmaproben und geben die Testzeiten einer Probe bezüglich BNP an. „RLU" gibt die relativen Lichteinheiten oder Photonenzählungen an, wie sie im Test quantifiziert wurden. Spalte 9 in Tabelle 5 gibt den Prozentsatz des erzielten Signals an.
Tabelle 5
Die oben stehende Tabelle 5 stellt Daten dar, die zwei Plasmaproben miteinander vergleichen, Plasma von Intergen und Plasma von KCBB. Die Plasmaproben wurden mit einer extrem hohen Dosis an synthetischem BNP gespickt, um die Beobachtung der BNP-Konzentration zu erleichtern. Plasma mit BNP, jedoch ohne hinzugefügte Inhibitoren, diente als negativer Vergleich. BNP in KCBB-Proben ohne Inhibitoren war nach 72 Stunden Lagerung praktisch nicht nachweisbar; dasselbe Plasma mit Inhibitoren zeigte jedoch nur eine allmähliche Abnahme der BNP-Konzentration, d.h. auf etwa 92 % des anfänglichen Werts nach der ersten Woche Lagerung. Die Wirksamkeit einzelner Inhibitoren wurde nur für IHPP getestet. PPACK schien der stärkste der getesteten Inhibitoren zu sein und ergab ein ausreichendes Ausmaß an Schutz für exogenes BNP für zumindest drei Tage, d.h. etwa 95,9 % BNP wurden wiedergefunden. Antipain zeigte ebenfalls eine gute Schutzwirkung (etwa 90 % Wiederfindung nach 3 Tagen Lagerung). In dieser Versuchsreihe überdauerte die Aktivität von Antipain jene von PPACK. Die Wirkung von Antipain konnte 4 Wochen lang beobachtet werden, während PPACK im Wesentlichen keine Aktivität zeigte. Wie jedoch dem Fachmann bekannt ist, ist es für Inhibitoren nicht ungewöhnlich, in man chen Blutproben instabil zu sein; die Hemmaktivität von typischerweise guten Inhibitoren, z.B. PPACK, kann daher in manchen Plasmaproben, nicht aber in allen Proben, mit der Zeit abnehmen.
Die obigen Resultate, zusammen mit der Dynamik der Blutprobenunterschiede, ergeben, dass eine Kombination aus Antipain und PPACK zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung gut geeignet ist und in manchen Fällen anstelle eines einzelnen Inhibitors erwünscht sein kann. Für praktische Zwecke würden jedoch entweder PPACK oder Antipain alleine ebenso eine akzeptable BNP-Stabilität ergeben. Da Antipain im Allgemeinen ein Aktivitätsspektrum zeigt, das dem von Leupeptin ähnelt, wurde Leupeptin in weitere Tests miteinbezogen (siehe Tabelle 7, Beispiel 2).
Die nachstehende Tabelle 6 liefert Daten, die zeigen, dass PPACK alleine BNP in einer Probe in einem Ausmaß erfolgreich stabilisiert, das akzeptabel ist, um den Abbau von BNP zu reduzieren oder zu inhibieren. Gemäß der vorliegenden Erfindung ermöglicht die Hemmaktivität einer Kombination von Inhibitoren, wobei PPACK im Gemisch enthalten ist, daher eine lange Lebensdauer der Hemmaktivität zur Stabilisierung von BNP.
Tabelle 6 Lagerbedingungen
Beispiel 2
Dieses Beispiel liefert Daten aus zusätzlichen Tests, die durchgeführt wurden, um die Wirkung der Inhibitorkomponenten PPACK, Leupeptin und Antipain, alleine und in Kombination, auf die Stabilität von synthetischem BNP-32 in Plasma im Zeitverlauf zu evaluieren. Plasmaproben wurden mit synthetischem BNP-32 gespickt, und sie wurden vor dem Testen für variierende Zeitspannen bei 4 °C gelagert, z.B. Tag 0, 24 Stunden und etwa 90 Stunden. Der Test zur Detektion und Quantifizierung der Gegenwart von BNP zu einem bestimmten Zeitpunkt war derselbe, wie er in Beispiel 1 beschrieben wurde. Es wurden Intergen-Humanplasma-(IHP-)Proben eingesetzt, die EDTA enthielten (K₂ EDTA oder K₃ EDTA in einer Menge von etwa 1,8 g/l Blut oder entsprechend etwa 10,8 mg pro 6-ml-Abnahmeröhrchen) (Intergen Nr. 01D1707, Intergen, Milford, MA). Die Standards entsprachen den in Beispiel 1 beschriebenen. Die Resultate der in diesem Beispiel durchgeführten Versuche sind in Tabelle 7 angegeben.
Tabelle 7
Wie aus den in Tabelle 7 angeführten Resultaten hervorgeht, verbesserte die Einbeziehung der stabilisierenden Komponenten Leupeptin, Antipain oder PPACK (50 μg/ml) alleine oder zusammen, die Stabilität von BNP nach gekühlter Lagerung der Plasmaproben bei 4 °C für unterschiedliche Zeitspannen, gefolgt vom Testen der Proben deutlich. Insbesondere die letzte Spalte in Tabelle 7 zeigt die Gesamtänderung der BNP-Konzentration während der Stabilitätsstudie. Eine negative Zahl, z.B. –14,3 % im Fall von Antipain, gibt an, dass sich der Verlust an BNP auf 14,3 % der anfänglichen Menge an BNP belief. Obwohl die Resultate die Verwendung von PPACK alleine zur Stabilisierung von BNP in Proben unterstützen, kann die BNP-Stabilität gemäß der Erfindung durch Kombination eines oder mehrerer der hierin beschriebenen Inhibitoren verbessert werden, insbesondere bezüglich der Langzeit-Stabilität, wie dies oben in Tabelle 7 gezeigt wird.
Beispiel 3
Die in diesem Beispiel durchgeführten Versuche evaluierten die Stabilität von endogenem BNP in Plasmaproben (d.h. menschliches CHF-Plasma (NYHA-Klasse III)). Plasmaproben, die endogenes BNP enthielten, wurden von ProMedDx (Norton, MA) erstanden und gefroren gelagert. Am Tag des Tests wurden die Proben vor der Verwendung aufgetaut. Die aufgetauten Proben wurden etwa 1 Stunde nach dem Auftauen verwendet. Unmittelbar nach dem Auftauen der Probe wurden Inhibitoren zugesetzt. Die Resultate werden in Tabelle 8 angegeben.
In Tabelle 8, Spalte 2 ist die Menge an BNP angegeben, die in einer aufgetauten und an Tag 0 getesteten Plasmaprobe enthalten ist. Spalte 3 in Tabelle 8 gibt die Menge an in der Tag-0-Plasmaprobe enthaltenem BNP an, wenn nach etwa 4 Stunden Lagerung bei 4 °C getestet wurde. Spalte 4 in Tabelle 8 gibt die Menge an in derselben Tag-0-Plasmaprobe enthaltenem BNP an, wenn nach etwa 24 Stunden Lagerung bei 4 °C getestet wurde. Der Test wurde wie in den obigen Beispielen beschrieben durchgeführt.
Tabelle 8
Die Resultate der oben genannten Beispiele bestätigen, dass in Gegenwart der BNP stabilisierenden/Inhibitor-Komponenten gemäß vorliegender Erfindung den Blutplasmaproben verbesserte Stabilität verliehen wird.
Beispiel 4
Es wurden Versuche durchgeführt, um die BNP-Stabilisierung in Tierserum und in menschlichem Serum im Vergleich zu Humanplasma zu erforschen. Die nachstehenden Tabellen 9 und 10 veranschaulichen die Wirksamkeit von PPACK und Leupeptin als BNP-Stabilisatoren in drei verschiedenen Medien, nämlich fötalem Rinderserum (Biocell Labs, Rancho Dominguez, CA), normalem Humanserum (Biocell Labs) und normalem Humanplasma (Intergen). Die Resultate zeigen, dass sowohl Human- als auch Tiersera im Hinblick auf BNP-Abbau viel höhere Aggressivität aufweisen als Plasma; selbst bei der höchsten getesteten Inhibitor-Konzentration erfolgte der Abbau des Peptids rasch. Nichtsdestotrotz wurde unter allen Bedingungen herausgefunden, dass die Zugabe von PPACK und Leupeptin zu signifikanter Hemmung des BNP-Abbaus führte: Tabelle 9 Lagerbedingungen
Tabelle 10 Lagerbedingungen
Beispiel 5
Beispiel 5 liefert eine vergleichende Evaluierung mehrerer verschiedener Inhibitoren. Die nachstehende Tabelle 11 vergleicht Inhibitoren von Serinproteasen, die mit thrombolytischer Aktivität assoziiert sind. Die Inhibitoren wurden in ihren normalen funktionellen Konzentrationen eingesetzt. Alle Inhibitoren außer PPACK wurden von Calbiochem (San Diego, CA) erstanden. Inhibitoren, wie z.B. Aprotinin und Benzamidin, sind bekannt und wurden zu Vergleichszwecken zusammen mit den neuen, hierin beschriebenen Inhibitorverbindungen eingesetzt. AEBSF ([4-(2-Aminoethyl)benzolsulfonylfluorid)]) stellt einen Inhibitor dar, der mit Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) verwandt ist. Die Daten zeigen die geringe Wirksamkeit von Aprotinin und die mittlere Wirksamkeit von AEBSF und Benzamidin bei der Stabilisierung von BNP. Wie hierin jedoch erstmals gezeigt wird, wurde von DFP (Diisopropylfluorophosphat) und PPRACK (D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon) herausgefunden, dass sie bezüglich BNP-Stabilisierung genauso wirksam wie Antipain, Leupeptin und PPACK sind.
Tabelle 11 Lagerbedingungen
Beispiel 6
Die in diesem Beispiel gezeigten Versuche liefern die Resultate der Titration von PPACK (Tabelle 12) und Antipain und Leupeptin (Tabelle 13) in verschiedenen Chargen von menschlichem Plasma. Die Daten wurden nach PPACK-, Antipain- oder Leupeptin-Titration in Proben von normalem menschlichen Plasma (Intergen), das mit synthetischem BNP gespickt wurde, erhalten. Für PPACK wurden drei normale menschliche Plasmaproben (A, B und C) verwendet. Die Resultate der PPACK-Titration unterstützen eine Wiederfindung von etwa 90 % oder mehr des mit etwa 3,9 μg/ml und mehr PPACK im Plasma gelagerten BNP (Tabelle 12). Die Resultate für die Antipain- und Leupeptin-Titration zeigen, dass diese Inhibitoren guten Schutz für die BNP-Stabilität in Plasma mit etwa 50 μg Inhibitor/ml bieten.
Tabelle 12 Lagerbedingungen
Tabelle 13 Lagerbedingungen
Beispiel 7
Beispiel 7 liefert die Ergebnisse verschiedener Versuche, um die Wirkung von PPACK auf die Stabilität von endogenem BNP zu bestimmen. Zur Bestimmung der Stabilität verschiedener Patientenproben bei verschiedenen Zeitspannen gekühlter Lagerung wurden 5 Patientenproben für 0, 1, 8, 24, 48 und 144 Stunden gekühlt. Ein begleitender Probensatz wurde mit PPACK in einer Endkonzentration von 35 μg/ml gespickt, um die Fähigkeit ihres Inhibitors, den Abbau von BNP zu reduzieren, zu bestimmen. Wie nachstehend in Tabelle 14 gezeigt wird, verzögerte PPACK den Abbau deutlich, sogar zum Zeitpunkt 0. Die Resultate wurden als absolute Wiederfindung, relativ zur Messung an Zeitpunkt 0 (1. Versuch) berechnet.
Die in Tabelle 14 angeführten Resultate zeigen, dass nach 24 Stunden der durchschnittliche Verlust an BNP in den Proben ohne Inhibitor bei 28 % lag, im Vergleich zu einem durchschnittlichen Verlust von nur 6,2 % bei hinzugefügtem PPACK. Nach 48 Stunden erhöhte sich der durchschnittliche Verlust an BNP in den Proben ohne PPACK auf 40 %, während PPACK-hältige Proben eine Wiederfindung von 100 % im Vergleich zur anfänglichen BNP-Messung zeigten. Die anfänglichen Werte von BNP in Proben zum Zeitpunkt 0 waren durchschnittlich 31 % höher mit hinzugefügtem PPACK. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Zugabe von Proteaseinhibitor direkt nach dem Zentrifugieren des Plasmas ein wertvolles Verfahren zur Stabilisierung von Patientenproben und zur Erhöhung der Haltbarkeit gekühlter Proben ohne BNP-Abbau darstellt. Zusätzlich zeigen die Daten die Fähigkeit von PPACK, BNP-Abbau zu verhindern, sselbst nach einer Lagerung bei 4 °C für einen Zeitraum von 6 Tagen.
Die nachstehende Tabelle 15 zeigt zusätzliche Daten für die oben (Tabelle 14) analysierten Patientenproben und demonstriert die Fähigkeit von PPACK, BNP-Abbau nach einer Lagerung bei Raumtemperatur für 6 Stunden zu verhindern. Ohne PPACK ist zu den jeweiligen in den Tabellen 14 und 15 angegebenen Zeitpunkten nahezu kein immunreaktives BNP mehr enthalten. Wie in Tabelle 14 sind die Resultate als absolute Wiederfindung relativ zur Messung des 1. Versuchs (Zeitpunkt 0) berechnet. Schlüssel: 1 = Patientennummer 1; 1p = Patientennummer 1 mit hinzugefügtem PPACK-Proteaseinhibitor, etc. Tabelle 15 Wiederfindung von Patienten-BNP mit und ohne PPACK nach 6-stündiger Lagerung bei Raumtemperatur

*: Unzureichendes Probenvolumen für die Evaluierung der Patientenproben 2 und 3.

Beispiel 8
In diesen Analysen wurden zwei Mengen an synthetischem BNP in unterschiedliche, im Handel erhältliche, auf Serum oder Plasma basierende Verdünner gespickt, um die Stabilität von BNP in den verschiedenen Verdünnern zu vergleichen. Alle Verdünner waren ursprünglich BNP-frei. Die verwendeten Verdünner waren folgende: Verdünner 1 war filtriertes Pferdeserum; Verdünner 2 war hitzeinaktiviertes Ziegenserum; Verdünner 3 war Holzkohle-gestripptes, defibriniertes menschliches Plasma; Verdünner 4 war defibriniertes menschliches Plasma (Irvine); Verdünner 5 war defibriniertes menschliches Plasma (Seracon II); Verdünner 6 war reines menschliches Serum; und Verdünner 7 war delipidiertes, gestripptes Plasma (Seracon II).
Der Stabilitätstest wurde etwa 45 Minuten, nachdem BNP zu den Verdünnern hinzugefügt wurde, durchgeführt. Die Resultate sind in Tabelle 16 angeführt. In Tabelle 16 gibt „wenig gespickt" an, dass BNP in einer Konzentration von etwa 300 pg/ml hinzugefügt wurde, während „stark gespickt" angibt, dass BNP in einer Konzentration von etwa 3000 pg/ml zugesetzt wurde. Trotz der hierin demonstrierten stabilisierenden Wirkung von PPACK war die BNP-Wiederfindung beeinträchtigt, insbesondere bei Verdünner Nr. 7. Diese Resultate zeigen die unterschiedlichen Aktivitäten von Patientenproben in Bezug auf BNP-Abbau mit und ohne Proteaseinhibitoren. Tabelle 16

**: unter der Nachweisgrenze

Tabelle 17 zeigt, dass die Verdünnung von BNP-positivem Plasma (d.h. Plasma, das endogenes BNP enthält) in normalem Plasma zu einer unterschiedlichen BNP-Abbaurate führt. Diese Rate ist für das jeweilige als Verdünner verwendete Plasma spezifisch und in geringerem Ausmaß auch für das getestete Plasma. In Tabelle 17 stellen Plasma A, B und C Proben dar, die von der Cardiovaskulären Abteilung, Brigham, und dem Women's Hospital, Boston, MA, erhalten wurden. Ein normaler Plasmapool 1 wurde in den Labors der Bayer Corporation, Tarrytown, NY, aus Plasma von innerbetrieblichen Spendern hergestellt; Plasmapool 2 ist derselbe KCBB-Pool, wie er hierin zuvor beschrieben wurde, und die Plasmapools 3 und 4 wurden von Intergen erhalten. „Verd." bedeutet „verdünnt".
Tabelle 17

Claims

Verfahren zur Stabilisierung des Brain-Natriuretic-Peptids (BNP) in einer Blut- oder Plasmaprobe, umfassend das Einführen einer stabilisierenden Menge zumindest einer stabilisierenden Komponente, die aus Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin), N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain), H-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK), D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK), Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Kombinationen davon ausgewählt ist, in die Probe.
Verfahren nach Anspruch 1, weiters ein oder mehrere Analoga, Varianten oder Derivate der stabilisierenden Komponenten umfassend, worin die Analoga, Varianten und Derivate BNP-stabilisierende Funktion aufweisen.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eine stabilisierende Komponente in einem Sammelbehälter vorhanden ist, bevor die Blut- oder Plasmaprobe entnommen wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zum Zeitpunkt der Probenentnahme zumindest eine stabilisierende Komponente in die Blut- oder Plasmaprobe eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin zumindest eine stabilisierende Komponente in konzentrierter oder gefriergetrockneter Form vorliegt.
Stabilisierte, Brain-Natriuretic-Peptid (BNP) enthaltende Zusammensetzung, die BNP und zumindest eine aus Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin), N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain), H-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK), D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK), Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Kombinationen davon ausgewählte Komponente umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 6, worin zumindest eine Komponente in konzentrierter oder gefriergetrockneter Form vorliegt.
Vergleichsmaterial zum Testen von Proben, die Brain-Natriuretic-Peptid (BNP) enthalten oder von denen vermutet wird, dass sie es enthalten, umfassend Brain-Natriuretic-Peptid (BNP) und zumindest eine BNP-stabilisierende Komponente, die aus Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin), N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain), H-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK), D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK), Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Kombinationen davon ausgewählt ist.
Set zur Stabilisierung von Brain-Natriuretic-Peptid (BNP) in Proben auf Blutbasis, umfassend zumindest einen Behälter, in dem sich zumindest eine aus Acetyl-Leu-Leu-Arginal (Leupeptin), N-(Nα-Carbonyl-Arg-Val-Arg-al)Phe (Antipain), H-D-Phe-Phe-Arg-Chlormethylketon (PPACK), D-Phe-Pro-Arg-Chlormethylketon (PPRACK), Diisopropylfluorophosphat (DFP) und Kombinationen davon ausgewählte Komponente befindet, und gegebenenfalls eine Tropfpipette oder ähnliche Vorrichtung zur Abgabe der zumindest einen Komponente, einen Puffer zur Solubilisierung der zumindest einen Komponente, synthetisches oder exogenes BNP sowie Gebrauchsanweisungen.