ES2475975T3 - Diagnóstico de la preeclampsia - Google Patents

Abstract

Un método para diagnosticar que una mujer embarazada tiene, o es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relación de la expresión de sFlt-1 a la expresión de PIGF se usa como base para un indicador con respecto a si la mujer está en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP): log [sFlt-1/PIGF x 100].

Description

Diagnostico de la preeclampsia

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La preeclampsia es un trastorno hipertensivo que complica hasta el 6-8% de embarazos, y sigue siendo la causa principal de morbimortalidad materna y perinatal (1, 2). No obstante, a pesar de los amplios esfuerzos de investigacion, la etiologia de este trastorno multisistematico todavia sigue estando incomprendida completamente. Parece que la activacion endotelial vascular, seguida de vasoespasmos, es el rasgo central en la patogenesis de la preeclampsia. Las teorias de esta causa incluyen implantacion y desarrollo anormal de la placenta, estres oxidativo, homeostasia de prostanoides y oxido nitrico endotelial alterada, polimorfismos geneticos, autoanticuerpos circulantes anormales, y una respuesta inflamatoria sistematica materna anormal (3, 4, 5, 6, 7). Mas recientemente, ha habido un foco creciente sobre los efectos de las variaciones en los niveles de expresion de moduladores de angiogenesis, que provocan sintomas de preeclampsia, incluyendo hipertension, proteinuria, activacion de celulas endoteliales y aumento de la agregacion plaquetaria (8, 9, 10, 11, 12).

Especificamente, estudios recientes han dado a conocer que las concentraciones sericas maternas del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), del factor de crecimiento placentario (PIGF) y tirosina cinasa-1 similar a fms soluble (sFlt-1) estan alteradas en pacientes con preeclampsia clinica (13, 14, 15). VEGF y PIGF son factores de crecimiento implicados en el desarrollo placentario, y ambos contribuyen a la actividad mitogenica y a la angiogenesis que es crucial para un feto en desarrollo. sFlt-1 es una variante de corte y empalme del receptor de Flt

1. Carece de los dominios citoplasmicos y transmembranicos de Flt-1, un receptor que se une tanto a VEGF como a PIGF, activando sus rutas de senalizacion. El aumento de sFlt-1 serico precede al comienzo de preeclampsia clinicamente identificable en aproximadamente 5 semanas, y la reduccion de PIGF libre es evidente tan pronto como el primer trimestre (13, 15, 16). Por el contrario, las concentraciones sericas de VEGF son bajas durante el embarazo en mujeres con preeclampsia clinica (15).

Tambien parece que tales factores angiogenicos son significativos en la regulacion de la fisiologia vascular glomerular renal humana. sFlt-1 exogeno, administrado a roedores prenados, conduce a hipertension, proteinuria y endoteliosis glomerular (17). De forma similar, la neutralizacion de VEGF, un factor de supervivencia mitogenico, clave para el endotelio vascular glomerular, conduce a apoptosis incrementada, reparacion capilar glomerular alterada, y proteinuria importante (18). En preeclampsia grave, la endoteliosis glomerular, una caracteristica habitual del trastorno, da soporte adicional a la relacion entre los factores angiogenicos alterados en pacientes con trastornos hipertensivos y la funcion renal general (19, 20, 21, 22, 23).

Actualmente, no hay un unico ensayo para predecir o diagnosticar la preeclampsia, o para pronosticar la gravedad de la afeccion que se desarrollara en un paciente particular. Los sintomas tempranos incluyen cefaleas persistentes, vision borrosa, o sensibilidad a la luz y dolor abdominal. Sin embargo, un diagnostico de la preeclampsia no se realiza tipicamente hasta que se revela una tension arterial elevada y proteina en la orina (proteinuria), tipicamente en ensayos medicos rutinarios tras la 20a semana de embarazo (1). Los efectos graves de la preeclampsia, incluyendo ataques, hemorragia cerebral, coagulacion intravascular diseminada e insuficiencia renal, pueden aparecer muy poco despues tras tal diagnostico. Estos metodos son imprecisos y proporcionan poca comprension sobre la probabilidad del desarrollo de sintomas mas graves. Ademas, los diagnosticos actuales requieren la inadvertencia medica y metodologias invasivas, retrasando y complicando adicionalmente la evaluacion temprana e inmediata. Se necesita un metodo temprano y exacto para la deteccion y diagnostico de preeclampsia y trastornos hipertensivos proteinuricos asociados.

El documento WO 2004/008946 y el documento WO 98/28006 describen metodos para diagnosticar trastornos hipertensivos en mujeres embarazadas midiendo los niveles de VEGF, sFLt-1 y/o PLGF.

SUMARIO DE LA INVENCION

La presente invencion se refiere a metodos para determinar o ayudar a determinar que una mujer embarazada esta en riesgo de desarrollar preeclampsia u otro trastorno o trastornos hipertensivos. En ciertas realizaciones, la invencion se refiere a metodos para determinar o ayudar a determinar que una mujer embarazada tiene preeclampsia. En realizaciones adicionales, la invencion se refiere a metodos de deteccion o deteccion previa de mujeres embarazadas para identificar aquellas mujeres embarazadas con un riesgo bajo de desarrollar trastornos hipertensivos, que reducen la necesidad de ensayos adicionales a lo largo del embarazo.

Se teorizo que los desajustes funcionales y morfologicos del rinon materno asociados con preeclampsia indican que las alteraciones en los niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF urinarios pueden agrupar trastornos hipertensivos, y pueden diferenciar a mujeres embarazadas con preeclampsia grave de controles embarazadas normotensas. Mientras varios articulos suficientemente publicados han dado a conocer que niveles aumentados de sFlt-1 circulante y PIGF y VEGF reducidos en suero pueden predecir el comienzo de preeclampsia, la excrecion urinaria de estos factores antiangiogenicos no se ha estudiado previamente en profundidad, ni se ha analizado el efecto especifico de tales niveles de secrecion en el contexto de la gravedad de las enfermedades. La presente invencion proporciona la monitorizacion y uso de niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF en muestras de orina como un indicador diagnostico de trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia. Ademas, la invencion proporciona un metodo no invasivo para diferenciar preeclampsia grave de otros trastornos hipertensivos. Los metodos y ensayos desarrollados son simples y baratos, y se pueden utilizar tan pronto como el primer trimestre de embarazo, incrementando asi la probabilidad de una deteccion y tratamiento tempranos. Ademas, esta invencion se describe con referencia a mujeres embarazadas, los metodos descritos aqui tambien se pueden utilizar para evaluar el riesgo de mujeres no embarazadas a desarrollar trastornos hipertensivos durante el embarazo.

La invencion se describe mediante las reivindicaciones adjuntas.

En una realizacion, se describe un metodo para diagnosticar o ayudar a diagnosticar si una mujer embarazada tiene,

o tiene propension a desarrollar, un trastorno hipertensivo midiendo la concentracion de sFlt-1 en una muestra de orina obtenida del sujeto de ensayo, y comparando la concentracion con un patron apropiado. El patron puede ser, por ejemplo, la concentracion de sFlt-1 en orina obtenida de mujeres embarazadas cuyos embarazos son normales,

o de mujeres embarazadas que tienen un trastorno hipertensivo confirmado, incluyendo preeclampsia. Tales sujetos se denominan como sujetos de referencia. Las muestras de referencia se obtienen de sujetos de referencia quienes, cuando se obtiene la muestra, estan en la semana de embarazo correspondiente a aquella semana de embarazo en la que esta la sujeto de ensayo cuando se obtiene la muestra de ensayo. Las muestras de referencia se pueden obtener y analizar en el mismo momento en que las muestras de orina se obtienen de los sujetos de ensayo. Como alternativa, se puede utilizar un patron establecido (un patron previamente establecido, o uno desarrollado tras la evaluacion de la muestra de orina obtenida de un sujeto de ensayo). Una concentracion incrementada de sFlt-1 en la orina de una mujer embarazada que se evalua (un sujeto de ensayo), en comparacion con la concentracion de sFlt-1 en orina procedente de una mujer embarazada normal, indica que la mujer tiene mayor riesgo de desarrollar preeclampsia u otro trastorno o trastornos hipertensivos. Un incremento en la concentracion de sFlt-1 por encima de 9,5 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia leve, mientras que un incremento en la concentracion de sFlt-1 por encima de 40 picogramos por miligramo de creatinina urinaria indica que la mujer embarazada tiene un mayor riesgo de desarrollar preeclampsia grave.

En otra realizacion se describe un metodo para evaluar o ayudar a evaluar la probabilidad de que una mujer embarazada desarrolle un trastorno hipertensivo midiendo la concentracion de PIGF y sFlt-1 en una muestra de orina obtenida de la mujer embarazada, y someter los valores obtenidos a analisis posterior. Se usa una formula para analizar los valores y calcular lo que se denomina como el uFP de la mujer, que es igual al log [sFlt-1/PIGF x 100]. El resultado de este analisis indica si la mujer embarazada que se evalua tiene riesgo de desarrollar trastorno hipertensivo. Por ejemplo, un uFP en exceso de 1,4 es un indicador pronostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada requerira tratamiento para prevenir el desarrollo de o el empeoramiento de sintomas asociados con trastornos hipertensivos. Como ejemplo adicional, un uFP en exceso de 2,1 tiene una sensibilidad de 88,2% y una especificidad de 100% diferenciando mujeres embarazadas con preeclampsia grave de controles normotensos. Este metodo proporciona un diagnostico significativamente mas exacto de preeclampsia grave en mujeres embarazadas que los metodos actualmente disponibles, que evaluan la proteinuria a traves de una prueba de orina con tira reactiva y medida de la concentracion de proteina total. En otro aspecto, el valor de uFP se utiliza como un indicador diagnostico del riesgo de desarrollar complicaciones especificas de preeclampsia, incluyendo parto por cesarea, acido urico serico incrementado, tensiones arteriales sistolica y diastolica incrementadas, proteinuria de tira reactiva, embarazo, peso fetal en el parto, desprendimiento placentario, restriccion del crecimiento intrauterino (IUGR), hemolisis, trombocitopenia, enzimas hepaticas elevadas y sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo).

En los metodos anteriores, las muestras de orina se pueden obtener en condiciones de ayuno o sin ayuno. Los factores angiogenicos se pueden medir usando un ensayo inmunologico, tal como un ELISA. En aspectos de los metodos descritos aqui, en la mujer embarazada se puede diagnosticar por tener o que tiene un mayor riesgo de desarrollar cualquiera de los siguientes trastornos hipertensivos: preeclampsia, eclampsia, preeclampsia leve, hipertension cronica, gestosis por EPH, hipertension gestacional, preeclampsia sobreimpuesta (incluyendo preeclampsia sobreimpuesta en hipertension cronica, nefropatia cronica o lupus), sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo) o nefropatia. Aunque esta invencion se describe con referencia a mujeres embarazadas (seres humanos), tambien se puede usar para diagnosticar y/o evaluar el riesgo de desarrollar trastornos hipertensivos en hembras no humanas.

En otra, realizacion se describe un kit de diagnostico para uso para determinar si una mujer embarazada tiene riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, tal como preeclampsia. El kit puede incluir un receptaculo para recibir una muestra de orina, un medio (por ejemplo, reactivos) mediante el cual se pueden detectar factores angiogenicos en la muestra, e instrucciones para evaluar el riesgo de desarrollar trastornos hipertensivos basandose en los valores obtenidos. En una realizacion, el kit incluye reactivos, tales como anticuerpos, utiles para detectar factores angiogenicos, tales como PIGF y sFlt-1, utiles para determinar si una mujer embarazada tiene riesgo de desarrollar preeclampsia, e instrucciones, que pueden incluir una referencia o patron, para evaluar el riesgo de que una mujer desarrollara preeclampsia. En una realizacion particular, el kit incluye al menos un anticuerpo que detecta PIGF, y al menos un anticuerpo que detecta sFlt-1.

Excepto que se defina de otro modo, todos los terminos tecnicos y cientificos usados aqui tienen el mismo significado que el entendido habitualmente por una persona de pericia normal en la tecnica, a la que pertenece esta invencion. Aunque en la practica o en el ensayo de la presente invencion se pueden usar metodos y materiales similares o equivalentes a los descritos aqui, a continuacion se describen metodos y materiales adecuados. Los materiales, metodos y ejemplos son solo ilustrativos.

Otras caracteristicas de la invencion seran manifiestas a partir de la siguiente descripcion detallada y de las reivindicaciones.

BREVE DESCRIPCION DE LOS DIBUJOS

La Figura 1 muestra las caracteristicas maternas, caracteristicas fetales y manifestaciones clinicas de las mujeres embarazadas con trastornos hipertensivos y los controles en la fecha de la entrada a participar en los estudios. El dato se analizo mediante ANOVA de una via (t), ANOVA de Kruskal-Wallis (:), y Chi al cuadrado (m).

La Figura 2 proporciona las caracteristicas de laboratorio clinicas de mujeres embarazadas con diversos trastornos hipertensivos. El dato se analizo mediante la prueba de Mann-Whitney (�) y la prueba de la t de Student (�).

La Figura 3 muestra las concentraciones de factores angiogenicos medidos en miccion aleatoria. El dato se analizo mediante ANOVA de Kruskal-Wallis (:), y los valores se dan por mg de creatinina (mgc).

Las Figuras 4A-4D muestran la degradacion polipeptidica de sFlt-1 y VEGF a lo largo del tiempo sin el tratamiento estabilizante descrito aqui.

Las Figuras 5A-5B muestran resultados de experimentos de ELISA representativos de (A) sFlt-1 y (B) PIGF.

Las Figuras 5C-5D muestran (C) una hoja de analisis representativa usada para el calculo de uFP a partir del dato de ELISA, y (D) uFP medio (+SD) de pacientes con preeclampsia grave (sPE) frente a controles (CRL).

La Figura 6 muestra un dispersograma de la relacion de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario libre (PIGF) en cada grupo de ensayo y de control. NP-CTR: control no embarazada; P-CTR: control embarazada; p-HTN: mujeres hipertensas/proteinuricas que no satisfacen los criterios para preeclampsia grave; sPE: preeclampsia grave.

La Figura 7 muestra el analisis de la curva de caracteristicas operativas del receptor (ROC), que demuestra la capacidad de uFP (log[aFlt-1/PIGF x 100]) para diferenciar mujeres con preeclampsia grave de los controles normotensos.

La Figura 8 muestra un dispersograma del dato de acido urico frente a uFP; r: recta de regresion; PI: intervalo de prediccion (intervalo de confianza para la poblacion). El 73% de los datos de acido urico estuvieron disponibles para el analisis. sFlt-1: tirosina cinasa 1 similar a fms soluble; PIGF: factor de crecimiento placentario.

La Figura 9 muestra las concentraciones sericas y de orina de los factores angiogenicos urinarios, albumina, creatinina, y relacion de proteina total a creatinina, medidas en la miccion aleatoria. Los datos se dan como media � SEM para datos distribuidos de forma normal (t), o como una mediana e intervalo para datos sesgados (:).

Las Figuras 10A-10B muestran (A) la concentracion de VEGF en suero en los grupos de estudio con su nivel de significancia, y (B) concentracion de VEGF en orina en los grupos de estudio con su nivel de significancia. NP-CTR: control no embarazada; P-CTR: control embarazada; mPE: preeclampsia leve; sPE: preeclampsia grave. El dato se presenta como media y SEM.

Las Figuras 11A-11B muestran (A) la concentracion de sFlt-1 en suero en los grupos de estudio con su nivel de significancia, y (B) concentracion de sFlt-1 en orina en los grupos de estudio con su nivel de significancia. NP-CTR: control no embarazada; P-CTR: control embarazada; mPE: preeclampsia leve; sPE: preeclampsia grave. El dato se presenta como media y SEM.

Las Figuras 12A-12B muestran (A) la concentracion de PIGF en suero en los grupos de estudio con su nivel de significancia, y (B) concentracion de PIGF en orina en los grupos de estudio con su nivel de significancia. NP-CTR: control no embarazada; P-CTR: control embarazada; mPE: preeclampsia leve; sPE: preeclampsia grave. El dato se presenta como media y SEM.

La Figura 13 muestra la excrecion fraccionada de los marcadores angiogenicos derivados de mujeres embarazadas que tienen trastornos hipertensivos y sujetos de control en formato logaritmico.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION

La preeclampsia se desarrolla en la segunda mitad del embarazo, y esta asociada con morbimortalidad materna y fetal significativa. Actualmente, no hay ningun ensayo de cribado efectivo para diagnosticar o evaluar el riesgo de desarrollar esta enfermedad y trastornos hipertensivos asociados. El resultado es que las mujeres embarazadas no pueden recibir una monitorizacion o tratamiento efectivo hasta que se han desarrollado complicaciones asociadas con los trastornos, incluyendo tension arterial elevada y proteinuria, mucho tiempo despues. Adicionalmente, las mujeres embarazadas con poco o ningun riesgo de desarrollar tales trastornos deben sufrir un ensayo innecesario en busca de sintomas durante su embarazo, debido a que no hay un medio efectivo mediante el cual los cuidadores de la salud puedan excluirlas del riesgo en las etapas tempranas del embarazo. Como se describe aqui, se teorizo que, debido a que la preeclampsia esta acompanada invariablemente tanto por desajustes funcionales como morfologicos del rinon materno, los niveles urinarios de factores angiogenicos estan alterados en mujeres embarazadas con preeclampsia, y proporcionarian un metodo de identificacion mas efectivo y menos invasivo para identificar o ayudar en la identificacion de mujeres embarazadas con trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia.

Como se usa aqui, "preeclampsia" se define segun criterios bien establecidos, tales como tension arterial de al menos 140/90 mm Hg y excrecion urinaria de al menos 0,3 gramos de proteina en una excrecion de proteina urinaria de 24 horas (o al menos +1 o mayor en la prueba con tira reactiva), cada uno en dos ocasiones separadas 4-6 horas. Como se usa aqui, "preeclampsia grave" tambien se define segun criterios establecidos, como una tension arterial de al menos 160/110 mm Hg en al menos 2 ocasiones separadas 6 horas, y mas de 5 gramos de proteina en una excrecion de proteina urinaria durante 24 horas o proteinuria +3 persistente en la prueba con tira reactiva. La preeclampsia grave puede incluir sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo). Otros elementos de preeclampsia grave pueden incluir restriccion de crecimiento en utero (IUGR) en menos del 10% percentil segun la demografia de los Estados Unidos de America, sintomas neurologicos persistentes (cefalea, trastornos visuales), dolor epigastrico, oliguria (menos de 500 ml/24 h), creatinina serica mayor de 1,0 mg/dl, enzimas hepaticas elevadas (mayor que dos veces lo normal), trombocitopenia ( 100.000 celulas/!l).

Se describen aqui metodos y composiciones relacionadas para la deteccion y/o monitorizacion de los niveles de factores angiogenicos, especificamente VEGF, PIGF y sFlt-1, en muestras de orina obtenidas de mujeres embarazadas y la relacion entre tales niveles y la probabilidad de que una mujer embarazada desarrollara un trastorno hipertensivo, tal como preeclampsia, en un punto particular en la progresion de su embarazo. La "progresion de embarazo" se refiere a las diversas etapas o fases del embarazo, incluyendo embarazo a lo largo de cada trimestre y durante la transicion desde un trimestre al siguiente. La "progresion del embarazo" incluye el transcurso del embarazo tanto en embarazos normales como en embarazos en los que se desarrolla un trastorno hipertensivo. Un "embarazo normal" se refiere a un embarazo que no esta complicado por y en el que la mujer no desarrolla un trastorno hipertensivo.

En los metodos descritos aqui, a las mujeres embarazadas se les puede diagnosticar que tienen un mayor riesgo de desarrollar cualquiera de los siguientes trastornos hipertensivos: preeclampsia, eclampsia, preeclampsia leve, hipertension cronica, gestosis por EPH, hipertension gestacional, preeclampsia sobreimpuesta (incluyendo preeclampsia sobreimpuesta en hipertension cronica, nefropatia cronica o lupus), sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo) o nefropatia. Aunque esta invencion se describe con respecto a mujeres embarazadas, los metodos descritos aqui tambien se pueden utilizar para evaluar el riesgo de mujeres no embarazadas de desarrollar trastornos hipertensivos durante el embarazo.

Los metodos y composiciones descritos aqui permiten a cualquiera evaluar y/o monitorizar el riesgo en una mujer embarazada de desarrollar un trastorno hipertensivo detectando y/o monitorizando los niveles de marcadores angiogenicos en una muestra o muestras de orina obtenidas de la mujer embarazada. Esto se puede llevar a cabo obteniendo una muestra de orina y analizandola para determinar los niveles de factores angiogenicos, como se describe aqui, en diversas etapas durante el embarazo. Los valores resultantes tambien se pueden comparar con un patron conocido. Como se usan aqui, un "patron apropiado" se refiere a los niveles del marcador angiogenico en orina obtenido de un sujeto de referencia. La concentracion del patron apropiado se puede determinar a partir de muestras de orina obtenidas de mujeres embarazadas con embarazos normales, o a partir de mujeres embarazadas que tienen un trastorno hipertensivo confirmado, tal como preeclampsia (sujetos de referencia). Las muestras que forman la base de un patron apropiado se obtienen del sujeto de referencia quien, cuando se obtiene la muestra, esta en la semana de embarazo que corresponde a esa semana de embarazo en la que esta el sujeto de ensayo cuando se obtiene la muestra de ensayo. Las muestras se pueden obtener y analizar al mismo tiempo a medida que las muestras de orina se obtienen de los sujetos de ensayo. Como alternativa, los niveles de expresion del patron se pueden determinar prospectiva o retrospectivamente a la evaluacion de la muestra de orina obtenida de un sujeto de ensayo usando estudios estadisticos con experimentacion habitual. Los niveles de expresion del patron se pueden determinar por una persona que tenga pericia normal en la tecnica, usando metodos bien conocidos.

Una muestra de orina que se puede evaluar mediante los metodos de la presente invencion es aquella que contiene niveles suficientes del marcador o marcadores angiogenicos de interes para la deteccion mediante las tecnicas de evaluacion descritas aqui. En particular, la muestra de orina debe tener niveles medibles de uno cualquiera de VEGF, PIGF y sFlt-1, segun sea aplicable a la tecnica de evaluacion utilizada. Las muestras de orina se pueden analizar inmediatamente despues de recogerlas, o en un tiempo posterior, con la condicion de que, cuando se analizan, la muestra contenga niveles detectables del marcador o marcadores angiogenicos de interes. Por ejemplo, las muestras de orina se pueden congelar a -70DC y/o mezclar, combinar o almacenar en un recipiente previamente tratado con agentes que estabilizan o conservan el marcador o marcadores angiogenicos de interes. En una realizacion preferida, la muestra de orina se recoge de la primera miccion matutina.

Como se usa aqui, la expresion "marcador angiogenico" se refiere a una o mas moleculas, tales como VEGF, PIGF y sFlt-1, que se pueden usar, ya sea solas o en combinacion, para detectar o ayudar en la deteccion de riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, monitorizar la progresion de una complicacion del embarazo asociada con un trastorno hipertensivo, y/o monitorizar la efectividad de un tratamiento para una complicacion de embarazo asociada con un trastorno hipertensivo.

Como se usa aqui, el termino "polipeptido" se refiere a un polimero de aminoacidos, y no a una longitud especifica. De este modo, los peptidos, oligopeptidos y proteinas estan incluidos en la definicion de polipeptido.

Los niveles de un marcador angiogenico que es util en un metodo de la presente invencion se pueden evaluar mediante cualquiera de una amplia variedad de metodos bien conocidos para detectar la expresion de una molecula transcrita, o su proteina correspondiente. Los ejemplos no limitantes de tales metodos incluyen metodos inmunologicos para la deteccion de proteinas segregadas, metodos de purificacion de proteinas, ensayos de la funcion o actividad de proteinas, metodos de hibridacion de acidos nucleicos, metodos de transcripcion inversa de acidos nucleicos, y metodos de amplificacion de acidos nucleicos. En una realizacion, los niveles de un marcador angiogenico se evaluan usando un ensayo ELISA.

En ciertas realizaciones, la invencion comprende tratar la muestra o muestras de orina procedentes de la mujer embarazada con uno o mas agentes estabilizantes, y/o pretratar el recipiente usado para la recogida de tal muestra

o muestras de orina con uno o mas agentes estabilizantes antes de medir los niveles de marcadores angiogenicos. La expresion "agente estabilizante" se refiere a una o mas moleculas, tales como polipeptidos o acidos nucleicos, que se pueden usar para evitar la degradacion de los marcadores angiogenicos. En una realizacion, el agente estabilizante es un inhibidor de proteasas, incluyendo cualquiera de fluoruro de 4-(2-aminoetil)bencenosulfonilo (AEBSF) y Pefabloc SC, antipaina e hidrocloruro de antipaina, aprotinina, benzamidina e hidrocloruro de benzamidina, bestatina, quimostatina, E-64 (L-trans-epoxisuccinil-leucinamida-(4-guanido)-butano o N-[N-(L-transcarboxioxiran-2-carbonil)-L-leucil]agmatina), acido etilendiaminotetraacetico y su sal sodica (EDTA-Na2), leupeptina, etilmaleimida, pepstatina y pepstatina A, fosforamidon, azida sodica, inhibidor de tripsina o acido s-aminocaproico.

Se ha demostrado que sFlt-1 urinaria esta significativamente incrementada y PIGF urinario esta significativamente disminuido en mujeres embarazadas con trastornos hipertensivos. La invencion presenta metodos para medir la concentracion de PIGF y sFlt-1 en una muestra de orina, y utilizar la relacion de tales factores de crecimiento opuestos para diferenciar a mujeres embarazadas con preeclampsia grave de mujeres embarazadas con otras formas de trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia leve con o sin hipertension cronica, o de controles normotensos. Los metodos de la invencion tambien se pueden usar para evaluar el riesgo de una mujer embarazada a desarrollar una concentracion especifica de trastornos hipertensivos, incluyendo preeclampsia. Tales complicaciones pueden incluir parto por cesarea, aumento de acido urico serico, aumento de tensiones arteriales sistolica y diastolica, proteinuria de tira reactiva, embarazo, peso fetal en el parto, desprendimiento placentario, (IUGR), hemolisis, trombocitopenia, enzimas hepaticas elevadas y sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo).

Se usa una formula para analizar los resultados de la determinacion de concentraciones o niveles de marcadores angiogenicos. El valor resultante proporciona informacion con respecto a la probabilidad de que la mujer embarazada desarrollara un trastorno hipertensivo, tal como preeclampsia. Como se usa aqui, el termino "formula" se refiere a cualquier expresion matematica, algoritmo u otra metrica que sea util para evaluar si los niveles de un marcador o marcadores angiogenicos de interes indican que una mujer embarazada tiene o esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo y/o complicaciones especificas de trastornos hipertensivos.

La formula se usa para calcular uFP de la mujer embarazada. Para los fines de esta invencion, el termino "uFP" se refiere al log [sFlt-1/PIFG x 100]. En un aspecto de la invencion, un uFP en exceso de 1,4 es un indicador pronostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada requerira tratamiento para evitar el desarrollo de o empeoramiento de sintomas asociados con trastornos hipertensivos. En otro aspecto de la invencion, un uFP en exceso de 2,1 indica que una mujer embarazada tiene o esta en riesgo de desarrollar preeclampsia grave. En un aspecto adicional de la invencion, un uFP en exceso de 2,1 indica que una mujer embarazada tiene riesgo de alumbrar por cesarea.

En algunas realizaciones, la presente descripcion proporciona kits relacionados con los metodos y/o composiciones de la invencion. Los reactivos pueden ser compuestos marcados o agentes capaces de detectar un polipeptido correspondiente a un marcador angiogenico de la invencion en una muestra de orina, y medios para determinar la cantidad del polipeptido (por ejemplo, un anticuerpo que se une al polipeptido). Los reactivos adecuados para la union con un polipeptido correspondiente a un marcador angiogenico util en un metodo de la presente invencion incluyen anticuerpos, derivados de anticuerpos, fragmentos de anticuerpos, y similares. Para kits a base de anticuerpos, el kit puede comprender, por ejemplo: (1) un primer anticuerpo (por ejemplo, fijado a un soporte solido) que se une a un polipeptido que corresponde a un marcador angiogenico de la invencion; y, opcionalmente, (2) un segundo anticuerpo diferente que se une al polipeptido o al primer anticuerpo, y esta conjugado a un marcador detectable.

La muestra apropiada se usa para comparar los resultados obtenidos de la muestra que se ensaya.

El kit tambien puede comprender otros componentes tales como un agente tamponante, un conservante, o un agente estabilizante de proteinas. El kit puede comprender ademas componentes necesarios para detectar el marcador detectable (por ejemplo, una enzima o un sustrato).

Cada componente del kit se puede encerrar en un recipiente individual, y todos los diversos recipientes pueden estar en un solo envase, junto con instrucciones para interpretar los resultados de los ensayos llevados a cabo usando el kit. El recipiente se puede pretratar con un agente estabilizante, y/o un agente estabilizante puede ser un componente del kit.

La presente invencion tambien se refiere a evaluar si el dano glomerular que se produce en mujeres con preeclampsia grave da cuenta de la liberacion incrementada de marcadores angiogenicos en una muestra de orina. Estudios recientes dados a conocer apoyan el criterio de que la placentacion defectuosa conduce a isquemia placentaria seguida de liberacion sistematica de productos citotoxicos que danan el endotelio vascular materno. Se ha teorizado que tales trastornos en angiogenesis tambien ejercen efectos indirectos sobre la vasculatura materna general, incluyendo aquella del rinon (19, 20, 21, 22, 23). Debido a que la endoteliosis glomerular es una lesion morfologica habitual de la preeclampsia, nos hemos centrado en si los niveles incrementados de los marcadores angiogenicos en una muestra de orina resultaron de la secrecion incrementada de estos marcadores en orina debido al dano glomerular, o si la excrecion urinaria incrementada reflejo sintesis vascular placentaria o sistemica incrementada. Se encontro que los niveles sericos de los factores angiogenicos no se correlacionan consistentemente con el nivel urinario de los factores. Tambien se encontro que las excreciones fraccionadas de VEGF y sFlt-1 estan incrementadas en mujeres con preeclampsia grave en el momento de la enfermedad manifiesta clinica, independientemente de la perdida de integridad glomerular como se refleja por el grado de proteinuria.

Los articulos "un", "una" y "el/la" se usan aqui para referirse a al menos un objeto gramatical del articulo.

El termino "incluyendo" se usa aqui para querer decir, y se usa de forma intercambiable con, la frase "incluyendo pero sin limitarse a".

La expresion "tal como" se usa aqui para querer decir, y se usa de forma intercambiable con, la frase "tal como pero sin limitarse a".

Mientras que la descripcion detallada presentada se refiere a VEGF, PIGF y sFlt-1, estara claro para una persona de pericia normal en la tecnica que la descripcion tambien se puede aplicar a miembros de familia, homologos, variantes alelicas de origen natural, isoformas, precursores y/o variantes de cada factor de crecimiento.

La practica de la presente invencion empleara, excepto que se indique de otro modo, tecnicas convencionales de biologia celular, cultivo celular, biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante, e inmunologia, las cuales estan dentro de la pericia de la tecnica. Tales tecnicas se describen en la bibliografia.

EJEMPLIFICACION

Habiendose descrito ahora generalmente la invencion, se entendera mas facilmente mediante referencia a los siguientes ejemplos, que se incluyen simplemente con fines ilustrativos de ciertos aspectos y realizaciones de la presente invencion, y no pretenden limitar la invencion.

EJEMPLO 1

Niveles incrementados de sFlt-1 y niveles reducidos de PIGF en mujeres embarazadas con trastornos hipertensivos.

Participantes

Se utilizaron muestras de orina procedentes de 68 mujeres admitidas en el Yale New Haven Hospital entre febrero y agosto del ano 2004. Las muestras se recogieron bajo protocolos aprobados por el Human Investigation Committee de la Universidad de Yale. Se obtuvo una autorizacion escrita de todos los pacientes. La edad gestacional se establecio basandose en la fecha menstrual y/o examen ultrasonografico antes de 20 semanas de gestacion. Todas las mujeres invitadas a participar en el estudio estuvieron de acuerdo. Se solicito la participacion de mujeres embarazadas admitidas en la sala de partos, y en las Unidades de Alto y Bajo Riesgo de Anteparto, y admitieron a las pacientes de forma prospectiva. Ninguna de las pacientes que se unieron fue excluida del analisis final.

Se ensayaron los siguientes grupos de mujeres: preeclampsia grave (sPE, n = 17), trastornos hipertensivos/proteinuricos asociados con embarazo que no satisficieron los criterios para preeclampsia grave (pHTN, n = 21), control embarazada sana (P-CTR, n = 16), y mujeres en edad reproductiva no embarazadas sanas (NP-CTR, n = 14). Como se usa aqui, "preeclampsia" se definio segun los criterios establecidos, como una tension arterial diastolica de al menos 140/90 mm Hg y excrecion urinaria de al menos 0,3 gramos de proteina en una excrecion de proteina urinaria durante 24 horas (o proteinuria de al menos +1 en la prueba con tira reactiva), cada uno en dos ocasiones separadas 4-6 horas. Como se usa aqui, "preeclampsia grave (sPE)" se define como sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo), tension arterial > 160/110 mm Hg en al menos 2 ocasiones separadas 6 horas, > 5 gramos en una excrecion de proteina urinaria durante 24 horas, o proteinuria +3 persistente en la prueba con tira reactiva. Otros elementos de la definicion incluyeron restriccion de crecimiento en utero (IUGR) 10% percentil segun la demografia de los Estados Unidos de America, sintomas neurologicos persistentes (cefalea, alteraciones visuales), dolor epigastrico, oliguria (menos de 500 ml/24 h) creatinina serica > 1,0 mg/dl, enzimas hepaticas elevadas (mayor que dos veces lo normal), trombocitopenia (

100.000 celulas/!l). "Hipertension cronica (crHTN)" se refiere a una elevacion sostenida de la tension arterial > 140/90 mm Hg antes del embarazo o antes de las 20 semanas de gestacion. "Proteinuria" se define como > 300 mg de proteina una recogida de orina de 24 horas. Para evaluar cambios histologicos inducidos por trastornos hipertensivos en placenta, se consulto los informes de patologia generados por un patologo clinico que desconocia los resultados del presente estudio. Los informes de patologia estuvieron disponibles en 29 de 38 pacientes hipertensas, y se apartaron en busca de la presencia de corionitis, infartos con volumenes > 3 cc., signos de cambios patologicos consistentes con preeclampsia (vasos deciduales sin signos de invasion trofoblastica o conversion fisiologica), y/o signos de desprendimiento (deposicion de hemosiderina y/o trombo intervelloso).

De 68 pacientes que entraron en este estudio, 17 satisficieron los criterios para sPE. En el momento de su adhesion, solo se sabia si una mujer era o no hipertensa, o si la mujer satisfizo o no los criterios clinicos para sPE. Puesto que no se podria hacer ninguna prediccion con respecto a la naturaleza de la condicion hipertensiva, el grupo de pHTN (n = 21) fue heterogeneo, consistiendo en mujeres con anamnesis previa de crHTN (n = 10), preeclampsia leve (n = 9) o neuropatias proteinuricas hipertensivas (n = 2, lupus y sindrome nefritico).

Comparado con las mujeres con sPE, el grupo de pHTN tenia significativamente mas edad (Student-Newman-Keuls, p = 0,021) (Figura 1). No hubo diferencia en la edad gestacional (GA) entre grupos en el momento de la toma de muestras. De forma similar, no hubo diferencia en gravidez, numero de partos, o peso materno en nuestra cohorte. Las mujeres hipertensas en los grupos tanto de sPE como pHTN tuvieron valores de tension arterial significativamente mayores en comparacion con P-CTR (tension arterial media: sPE: 122, pHTN: 115, P-CTR: 77 mm Hg, p 0,001). Una mayor proporcion de mujeres con sPE manifestaron sintomas neurologicos (Figura 1).

El diagnostico clinico estuvo apoyado por cambios histologicos placentarios y de laboratorio clinico que se produjeron en los grupos hipertensos (Figura 2).

Las mujeres con sPE tuvieron mayores grados de proteinuria cuando se cribaron con la prueba de tira reactiva urinaria rapida. Sin embargo, cuando se analizo la excrecion de proteina urinaria de 24 horas en laboratorio, no se pudieron confirmar diferentes entre los grupos sPE y pHTN. Los pacientes con sPE tuvieron mayores niveles de lactato deshidrogenasa-LDH (indicador de hemolisis intravascular), acido urico, y un menor recuento plaquetario, en comparacion con las mujeres con pHTN. Los signos histologicos de desprendimiento (deposicion de hemosiderina o trombos intervellosos) fueron mas habituales en embarazos complicados por sPE (p = 0,003, test exacto de Fisher).

Recogida de muestras

Se recogio una muestra de orina aleatoria (5-10 ml/muestra) mediante uso estandar de recipientes esteriles. En el momento de su entrada en el estudio, todas las mujeres con sPE tenian colocado una sonda de Foley para permitir la monitorizacion exacta de la diuresis. En ausencia de una sonda de Foley, las muestras de orina se recogieron usando otra tecnica esteril ("sonda recta" o "captura de chorro medio"). La tecnica de "sonda recta" es un procedimiento de "entrada y salida" que usa una sonda recta para recoger orina de manera esteril. La tecnica de "captura de chorro medio" es un metodo para recoger una muestra de orina mientras se minimiza la contaminacion bacteriana procedente de la flora genital. El 60% de las mujeres con sPE entro en el estudio tras iniciar la profilaxis de ataques con sulfato de magnesio. La profilaxis de ataques con sulfato de magnesio son las normas asistenciales para pacientes con preeclampsia clinica, debido a que se ha demostrado que el tratamiento con sulfato de magnesio evita el comienzo de ataques en tales pacientes. Se recogieron muestras de orina de nueve mujeres antes y tambien 2-12 horas despues del inicio de la terapia de profilaxis de ataques. En paralelo, se realizaron analisis bioquimicos de las muestras urinarias. Tras recogerlas, las muestras se hicieron girar a 3000 x g a 4DC durante 20 min., se repartieron en alicuotas y se almacenaron inmediatamente a -80DC hasta que se midieron los niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF mediante inmunoensayos especificos.

Procedimientos de inmunoensayo

Los ensayos de ELISA para VEGF, sFlt-1 y PIGF libres humanos se llevaron a cabo segun las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Las muestras se ensayaron por duplicado en una placa de 96 pocillos prerrevestida con un anticuerpo de captura dirigido contra VEGF, sFlt-1 o PIGF libre. Se llevaron a cabo protocolos de incubacion, seguidos de lavados y lectura a 450 nm segun el sumario del procedimiento. Las dosis detectables minimas en los ensayos para VEGF, sFlt-1 y PIGF fueron 5, 5 y 7 pg/ml, respectivamente. Los coeficientes de variacion de interensayos e intraensayos variaron de 3 a 10%. Puesto que la proteinuria puede sufrir variaciones

diurnas, el dato se calculo y se normalizo basandose en las concentraciones de creatinina y de proteina determinadas a partir de la misma alicuota usando curvas estandar derivadas de concentraciones conocidas. Los niveles o factores angiogenicos se normalizaron para las concentraciones de creatinina y/o proteina total.

Analisis estadfstico

Todos los conjuntos de datos se sometieron a ensayo de normalidad usando el metodo de Kolmogorov-Smirnov, y se dan como media e intervalo de confianza de 95% (95% CI) (para datos distribuidos de forma normal) o como media con intervalo (para datos sesgados). La concentracion de VEGF, sFlt-1 y PIGF se presento como media aritmetica, y el analisis estadistico se completo antes (ANOVA de Kruskall-Wallis) o despues (ANOVA de una via) de la transformacion logaritmica de los datos. Las comparaciones entre dos grupos se realizo usando las pruebas de la t de Student o la prueba de la suma de rangos de Mann-Whitney. Las proporciones se compararon con las pruebas exacta de Fisher o Chi cuadrado. Se aplico analisis uni- y multivariante con un modelo de regresion lineal para identificar asociaciones significativas entre caracteristicas maternas o de laboratorio como variables independientes, y la relacion sFlt/PIGF como variable dependiente. Para medir la colinealidad entre las variables independientes seleccionadas asi como otras correlaciones relevantes entre variables dependientes e independientes se uso una correlacion del producto-momento de Pearson o Spearman. El analisis de la curva de caracteristicas operativas del receptor (ROC) se llevo a cabo usando el software estadistico de MedCalc (Broekstraat, Belgica). La significancia estadistica se juzgo a p 0,05.

Niveles urinarios de VEGF, sFlt-1 y PIGF

No hubo ninguna correlacion entre los niveles urinarios de VEGF, sFlt-1, PIGF y GA en el momento de la toma de muestras (VEGF: r = 0,09, sFlt-1: r = 0,02, PIGF: r = 0,03, p > 0,05). La Figura 3 mas abajo presenta niveles urinarios de factores angiogenicos (en formato no logaritmico).

Las mujeres con sPE tuvieron mayores niveles de orina de VEGF en comparacion con las NP-CTR (StudentNewman-Keuls, p = 0,023). VEGF urinario no vario significativamente entre los grupos embarazados (ANOVA de una via, p = 0,536). La concentracion de PIGF urinario se incremento significativamente en mujeres embarazadas sanas en comparacion con el grupo de NP-CTR (Student-Newman-Keuls, p 0,001). El embarazo normal estuvo asociado con niveles significativamente mayores de PIGF urinario en comparacion con NP-CTR (p 0,001). El resultado de PIGF urinario disminuyo significativamente entre las mujeres con pHTN y sPE, en comparacion con controles embarazadas sanas (p 0,001). Finalmente, se determino que las mujeres con sPE tuvieron niveles urinarios significativamente mayores de sFlt-1 en comparacion con pHTN (p = 0,016) y P-CTR (p 0,001). Las mujeres con pHTN tuvieron un mayor resultado urinario de sFlt-1 en comparacion con el grupo de P-CTR (p = 0,001). No hubo diferencia significativa en los niveles urinarios de sFlt-1 entre los controles sanos de P-CTR y NP-CTR (p = 0,594).

EJEMPLO 2

Degradacion de sFlt-1 y VEGF en muestras de orina

Se llevaron a cabo experimentos para estudiar la estabilidad de los factores angiogenicos en orina. Se ensayaron ocho muestras de orina procedentes de pacientes con preeclampsia (i) como se describe aqui como muestras de orina o (ii) despues de un periodo de 24 horas a temperatura ambiente. La Figura 4 mas abajo muestra el analisis de la concordancia entre los datos de ELISA de las dos muestras usando el metodo de concordancia de Bland-Altman. Este analisis representa el valor diferencial entre las dos medidas (sesgo) frente a su promedio para evaluar si las diferencia entre las dos tecnicas son importantes, ya sea que los dos metodos se puedan usar de forma intercambiable y si la variabilidad de las diferencias aumenta a medida que aumenta la magnitud de la medida. Los resultados demuestran que la perdida mas grande en inmunorreactividad es para sFlt-1 (Figura 4A: promedio: 57,5 pg/ml), seguido de VEGF (Figura 4B: promedio: 41,1 pg/ml). Para PIGF (Figura 4C), el sesgo negativo (-8,8 pg/ml) sugiere que despues de 24 horas a RT se midio un valor ligeramente mayor, sugiriendo que otros factores, tales como la posible evaporacion de la muestra, tambien pueden impactar en los resultados. La Figura 4D ilustra el cambio relativo en inmunorreactividad desde antes como niveles de 100%. Los resultados sugieren que la inmunorreactividad para sFlt-1 disminuyo estadisticamente (pruebas de rangos con signos p = 0,023 para sFlt-1), permanecio sin cambio para VEGF (p > 0,05), y aumento significativamente para PIGF (pruebas de rangos con signos p = 0,023).

EJEMPLO 3

Relacion sFlt-1/PIGF urinaria

Como se descubre aqui, el embarazo normal se caracteriza por una mayor excrecion de PIGF urinario, mientras que los estados hipertensivos se caracterizan por mayor sFlt-1, pero menor PIGF urinario. Las Figuras 5A-5B mas abajo muestran experimentos de ELISA representativos que demuestran el efecto de tales estados hipertensivos en (A) niveles de sFlt-1 en mujeres embarazadas y (B) niveles de PIGF en mujeres embarazadas. A la vista de esto, se razono que la relacion de sFlt a PIGF (uFP) urinaria seria un mejor indicador de la homeostasis urinaria individual de marcadores angiogenicos. El indicador de la relacion se computo usando la siguiente formula: uFP = log [sFlttPIGF x

100]. Las Figuras 5C-5D mas abajo muestran (C) una hoja de analisis representativa usada para el calculo de uFP a partir de los datos de ELISA presentados aqui, y (D) uFP medio (+SD) de pacientes con sPE frente a P-CTR. Los resultados de tales calculos demostraron que uFP fue significativamente elevada en mujeres con sPE en comparacion con pHTN (Student-Newman-Keuls, p = 0,008), P-CTR (p 0,001) o NP-CTR (p 0,001) (Figura 6). El grupo de pHTN tambien tuvo valores de uFP significativamente elevados en comparacion con P-CTR (p 0,001) y NP-CTR (p 0,001).

Se llevo a cabo un analisis de ROC para el uFP. A partir de tal analisis, se determino que un corte de >2,1 tuvo una sensibilidad de 88,2% y especificidad de 100% diferenciando mujeres con sPE de controles normotensos (area bajo la curva, [95% CI]: 0,974 [0,849-0,994]) (Figura 7). El uFP fue significativamente mejor que la proteinuria sola agrupando mujeres con sPE de los controles normotensos (area bajo la curva [95% CI]: 0,809 [0,635-0,924], p = 0,03).

Tambien se examino un posible efecto de la infusion de sulfato de magnesio comparando la relacion de uFP en un grupo de nueve mujeres en las que las muestras de orina estuvieron disponibles antes y despues del inicio del tratamiento. Se determino que uFP (prueba de la t pareada, p = 0,854) no cambio significativamente 2-12 horas en respuesta a la profilaxis de ataques con sulfato de magnesio.

Para investigar las posibles relaciones entre la relacion uFP y varios factores maternos y de laboratorio quimico, se hizo un modelo de la relacion uFP como variable dependiente frente a la edad materna, gravidez, numero de partos, GA, IUGR, tension arterial sistolica y diastolica, proteinuria, sintomas neurologicos (0 = ninguno; 1 = presente), ensayos de funcion hepatica (AST, ALT), recuento plaquetario, modo de dar a luz (parto por cesarea [CD] frente a parto vaginal espontaneo [SVD]), acido urico, LDH serico, y signos histopatologicos de desprendimiento placentario (0 = ninguno; 1 = presente), como variables independientes. Estas variables se introdujeron en un modelo de regresion lineal multiple. Se descubrio que acido urico y el parto mediante CD completaron mejor el modelo (r = 0,628) y se correlacionaron con uFP (p = 0,002 para CS, p = 0,005 para acido urico). No hubo ninguna colinealidad significativa entre los dos parametros (CD y acido urico) que finalmente permanecieron en nuestro modelo (r = 0,143, p = 0,391).

En el analisis univariante, se identifico (r = 0,458 de Pearson, p = 0,003) (Figura 8) una relacion significativa entre uFP y acido urico serico materno, y entre uFP y el parto por CD (r = 0,514 de Spearman, p 0,001). Las mujeres que dieron a luz mediante CD tuvieron relaciones uFP significativamente elevadas en comparacion con mujeres que dieron a luz de forma natural (promedio [95% CI] CS: 2,6 [2,4-2,8] frente a SVD: 1,8 [1,8-2,3], p = 0,007). Se determino ademas que las mujeres con una relacion uFP de alrededor de 2,1 tuvo un mayor riesgo de dar a luz por CD (OR [95% CI]: 6,57 [1,51-28,53]. Otras variables consistentes con la gravedad de la enfermedad se correlacionaron significativamente con uFP: tensiones arteriales sistolica y diastolica, proteinuria en tira reactiva (p 0,001), gravidez, peso fetal en el parto, signos de desprendimiento placentario, numero de partos e IUGR (p 0,05).

EJEMPLO 4

Concentraciones sericas y en orina maternas de factores angiogenicos.

Participantes y recogida de muestras.

Para este estudio, se estudiaron muestras emparejadas en el tiempo pareadas de suero-orina procedentes de 64 mujeres admitidas en el Yale New Haven Hospital entre febrero de 2004 y enero de 2005. Las muestras se recogieron bajo los protocolos aceptados por el Human Investigation Committee de la Universidad de Yale. Todas las participantes proporcionaron una autorizacion escrita antes de su inclusion. Todas las mujeres a las que se les solicito que participaran estuvieron de acuerdo en participar. Los resultados de inmunoensayos de orina, pero o de suero, de 14 mujeres fueron como se dio a conocer previamente. La edad gestacional (GA) se establecio basandose en la fecha menstrual y/o el examen ultrasonografico antes de las 20 semanas de gestacion. Los sujetos se reclutaron de mujeres evaluadas o admitidas en la unidad de partos y en las unidades de riesgo elevado y bajo de anteparto. A los sujetos se les solicito su participacion prospectivamente basandose en la disponibilidad de uno de los investigadores (CSB). Ninguna de las mujeres incluidas se excluyo del analisis final.

A las pacientes se las incluyo en los siguientes grupos: preeclampsia grave (sPE, n = 27), mujeres proteinuricas e hipertensas levemente preeclampsicas que no satisficieron los criterios de preeclampsia grave (mPE, n = 15), mujeres de control embarazadas sanas (P-CTR, n = 13), y mujeres no embarazadas sanas de edad reproductiva (NP-CTR, n = 9). La preeclampsia leve se definio segun el criterio establecido como una tension arterial diastolica de al menos 140/90 mm Hg y una excrecion urinaria de al menos 0,3 gramos de proteina en una excrecion de proteina urinaria de 24 horas (o al menos 1+ o mayor en la prueba en tira reactiva), cada uno en dos ocasiones separadas 46 horas (24). sPE se definio como sindrome de HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, recuento plaquetario bajo), tension arterial > 160/110 mm Hg en al menos 2 ocasiones separadas 6 horas, > 5 gramos en una excrecion de proteina urinaria de 24 horas, y o proteinuria +3 persistente en una prueba de tira reactiva. Otros elementos de la definicion de sPE incluyeron restriccion de crecimiento en utero (IUGR) 10D percentil, sintomas neurologicos persistentes (cefalea, alteraciones visuales), dolor epigastrico, oliguria (menos de 500 ml/24 h), creatinina serica > 1,0 mg/dl, enzimas hepaticas elevadas (mayor que dos veces lo normal), trombocitopenia ( 100.000 celulas/!l). La

hipertension cronica (crHTN) se definio como una elevacion sostenida en la BP >140/90 mm Hg antes del embarazo

o antes de 20 semanas completas de gestacion. La proteinuria se definio como >300 mg de proteina en un periodo de 24 horas de recogida de orina.

Se recogio una muestra de orina aleatoria (5-10 ml) mediante uso estandar de recipientes esteriles. En el momento de su inclusion, a todas las mujeres con sPE se les coloco una sonda de Foley para permitir la monitorizacion exacta de diuresis. En ausencia de una sonda de Foley, las muestras de orina se recogieron usando otras tecnicas (cateterizacion de la vejiga o metodo de "recogida de chorro medio"). Las muestras obtenidas a partir de mujeres mPE, P-CTR, y NP-CTR tambien se recogieron en condiciones esteriles (Foley, cateterizacion de vejiga o tecnica de "recogida de chorro medio"). Setenta por ciento de las mujeres con sPE se incluyeron antes del inicio de la profilaxis de ataques con sulfato de magnesio. Se recogio una muestra de sangre mediante venipuncion en el momento de la recogida de orina, y se dejo coagular. Las muestras se recogieron en el momento de la admision, antes de la induccion del parto o del parto por cesarea. Las muestras de suero y de orina se hicieron girar a 3000 X g a 4DC durante 20 min., el sobrenadante se repartio en alicuotas y se almaceno inmediatamente a -800C hasta que los niveles de sFlt-1, VEGF y PIGF se midieron usando inmunoensayos especificos.

Procedimientos de inmunoensayo para VEGF, sFlt-1 y PIGF

Los ensayos ELISA para VEGF, sFlt-1 y PIGF no unidos humanos se llevaron a cabo segun las instrucciones del fabricante (R&D Systems, Minneapolis, MN). Las muestras de suero y de orina se evaluaron por duplicado en una placa de 96 pocillos revestida previamente con un anticuerpo de captura dirigido frente a VEGF, sFlt-1 o PIGF libre. Se llevaron a cabo protocolos de incubacion, seguidos de lavados y lectura a 450 nm segun el sumario del procedimiento. Las concentraciones detectables minimas en los ensayos para VEGF, sFlt-1 y PIGF fueron 2, 5 y 7 pg/ml, respectivamente. Nuestros datos se dieron a conocer y se representan graficamente usando el software de Softmax Pro 3.1.1 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Este software da a conocer un valor positivo si la densidad optica de los pocillos con muestras esta por encima de la del patron cero (pocillos en blanco). Si la densidad optica de un pocillo de muestras esta por debajo de la del patron cero, se le asigna un valor negativo y automaticamente se convierte en cero por el ordenador. El VEGF serico fue el unico analito en el que hubo casos de niveles indetectables (valores menores que el estandar de cero) en cualquiera de los ensayos. Los coeficientes de variacion interensayos e intraensayos variaron de 3 a 10%. Las placas se leyeron a 450 nm con una correccion de longitud de onda de 570 nm usando un lector de microplacas VERSAmaxTM con el software Softmax Pro 3.1.1.

Procedimiento de inmunoensayo para albumina

Las placas de microtitulacion (Immuno MaxiSorp, Nalge Nunc, Rochester, NY) se revistieron con anticuerpo de captura (10 !g/ml de anticuerpo anti-albumina humana de cabra (Bethyl Laboratories). Las placas se lavaron, se bloquearon y se incubaron con muestras de orina (dilucion 1:1000 o 1:100 para pacientes NP) o de suero (diluida 1:150.000) o calibradores de albumina humana (Bethyl Laboratories) en un intervalo de 6,25 a 400 ng/ml. La deteccion se logro usando un anticuerpo anti-albumina humana de cabra conjugado con peroxidasa de rabano picante (dilucion 1:150.000, Bethyl Laboratories) y 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (Vector Laboratories, Burlingame, CA) como sustrato. El color de la reaccion se detuvo con acido sulfurico 2M, y las placas se leyeron a 450 nm con correccion de longitud de onda de 650 nm. El coeficiente de variacion intraensayo fue menor que 5%. La sensibilidad del ensayo fue 1 ng/ml.

Otras estimaciones bioqufmicas

Los niveles de creatinina en suero y en orina se midieron en la misma alicuota usada para inmunoensayos, usando un ensayo colorimetrico (Stanbio Laboratory, Boerne, TX) frente a curvas patron derivadas de concentraciones conocidas. Tambien se midieron los niveles de proteina total usando un reactivo de acido bicinconinico/sulfato de cobre (kit BCA, Pierce, Rockford, Il). Los niveles urinarios de factores angiogenicos, proteina o albumina se normalizaron a concentraciones de creatinina urinaria.

Analisis estadfstico

Todos los conjuntos de datos se sometieron a ensayo de normalidad usando el metodo de Kolmogorov-Smirnov, y los datos se dieron como media y 95% de intervalo de confianza (95%CI) o error estandar de la media (SEM) (para datos distribuidos normalmente), o como una mediana con intervalo (para datos sesgados). El analisis estadistico de la excrecion fraccionada de factores angiogenicos se completo tras la transformacion logaritmica de los datos. Se llevaron a cabo procedimientos de comparacion multiple por pares usando analisis de varianza de una via o ANOVA de Kruskall-Wallis, segun fuese apropiado. Las comparaciones entre dos grupos se llevaron a cabo usando las pruebas de la t de Student o las pruebas de suma de rangos de Mann-Whitney. Las proporciones se compararon con la prueba exacta de Fisher. Para medir la colinealidad entre las variables independientes seleccionadas, asi como otras correlaciones relevantes entre variables dependientes e independientes, se uso la correlacion de producto-momento de Pearson. Para cada factor angiogenico, se calculo un indicador de excrecion fraccionada usando la siguiente formula [Ua] x [Sc]/[Sa] X [Uc], representando [Ua] y [Sa] la concentracion urinaria y serica del factor angiogenico, respectivamente, y representando [Uc] y [Sc] la concentracion de creatinina urinaria y serica. Se realizaron calculos similares para albumina y proteinas totales. La significancia estadistica se juzgo a p 0,05.

Niveles de suero-orina de factores angiogenicos, protefna, relaci6n de protefna totaltcreatinina aleatoria de orina, albumina y creatinina.

Los resultados de los inmunoensayos se muestran en la Figura 9. Hubo diferencias significativas en las concentraciones sericas y de orina entre los grupos para VEGF, sFlt-1 y PIGF. Las mujeres con sPE tuvieron concentraciones proteicas sericas (ANOVA de Kruskal-Wallis, p 0,05) significativamente menores pero no las urinarias (p = 0,495), en comparacion con mujeres mPE. La relacion de proteina total/creatinina aleatoria de orina se ha propugnado desde hace tiempo como un factor pronostico de una excrecion de proteina total de orina de 24 horas (25). Las mujeres con sPE pero no mPE tuvieron una relacion de proteina total a creatinina aleatoria de orina significativamente mayor en comparacion con los otros grupos del estudio (ANOVA de Kruskal-Wallis, p = 0,007).

Los resultados del analisis de seroalbumina demostraron que no hubo diferencias significativas entre los grupos (Figura 9). Sin embargo, hubo una diferencia significativa en la albuminuria entre grupos segun se evalua en una muestra de orina aleatoria (p 0,001). No hubo ninguna correlacion significativa entre proteinuria y albuminuria para los grupos de mPE (r = 0,477, p = 0,080) o sPE (r = 0,143, p = 0,472). Las concentraciones de creatinina sericas de mujeres con sPE fueron significativamente mayores en comparacion con mPE (ANOVA de una via, p = 0,04) y P-CTR (p = 0,005).

Niveles de VEGF de suero-orina

El embarazo se caracterizo por un nivel serico reducido de VEGF (NP-CTR frente a P-CTR, p 0,001) (Figura 9). Las mujeres con sPE tuvieron una concentracion serica significativamente menor de VEGF libre en comparacion con mujeres P-CTR (ANOVA de Kruskal-Wallis, p 0,05), pero no mPE (p > 0,05) (Figura 10A). No hubo diferencia en las concentraciones urinarias de VEGF entre las mujeres NP-CTR, P-CTR mPE (ANOVA de una via, p = 0,371). Por el contrario, las mujeres con sPE duplicaron mas del doble sus concentraciones de VEGF urinarias en comparacion con el grupo de mPE (p = 0,01) (Figura 10B). No hubo una correlacion significativa entre albuminuria y los niveles urinarios de VEGF para el grupo de sPE (r = 0,083, p = 0,860). Hubo una correlacion significativa entre proteinuria y la concentracion urinaria de VEGF en el grupo de mPE (r = 0,713, p = 0,003), pero no en el grupo de sPE (r = 0,021, p = 0,918) indicando que sPE altera profundamente la concentracion serica y de orina de este factor angiogenico, pero independientemente de proteinuria.

Niveles de sFlt-1 en suero-orina

El embarazo esta asociado con mayores niveles sericos de sFlt-1 (ANOVA de Kruskal-Wallis, NP-CTR frente a PCTR, p 0,001) (Figura 11A). En el momento del diagnostico clinico, tanto el grupo de mPE como de sPE tuvieron niveles sericos medios de sFlt-1 significativamente elevados en comparacion con controles embarazadas sanas (p 0,05). Las mujeres con sPE se distinguieron de mPE puesto que sus concentraciones sericas de sFlt-1 fueron un 47% mayor (sPE frente a mPE, p 0,05). Las concentraciones urinarias de sFlt-1 no se vieron influidas por el embarazo per se (NP-CTR frente a P-CTR, p > 0,05) (Figura 11B). Sin embargo, los sujetos con mPE tuvieron niveles urinarios de sFlt-1 significativamente mayores en comparacion con el grupo de P-CTR (ANOVA de Kruskal-Wallis, p = 0,007). Las concentraciones urinarias de sFlt-1 variaron con el grado de gravedad de la enfermedad (sPE frente a mPE, p 0,05). No hubo ninguna correlacion significativa entre albuminuria y niveles urinarios de sFlt-1 en el grupo de sPE (r = 0,324, p = 0,873). No hubo ninguna correlacion significativa entre proteinuria y concentracion urinaria de sFlt-1 para los grupos de mPE (r = 0,137, p = 0,628) o sPE (r = 0,336, p = 0,087). En resumen, las mujeres preeclampsicas tuvieron concentraciones sericas y urinarias de sFlt-1 significativamente elevadas. Este trastorno varia con la gravedad de los trastornos hipertensivos.

Niveles de PIGF de suero-orina

La concentracion serica y de orina de PIGF fue significativamente elevada durante el embarazo normal (ANOVA de Kruskal-Wallis, P-CTR frente a NP-CTR, p 0,05) (Figura 12A y 12B). Ademas, las mujeres con sPE y mPE tuvieron niveles sericos de PIGF cinco veces menores en comparacion con P-CTR (sPE frente a P-CTR, p 0,05) (mPE frente a P-CTR, p 0,05). Las mujeres con sPE tuvieron niveles sericos de PIGF significativamente menores en comparacion con mPE (sPE frente a mPE, p 0,05) (Figura 12A). Igualmente, esta relacion se mantuvo con respecto a las concentraciones urinarias de PIGF (sPE frente a P-CTR, p = 0,004). No hubo diferencias significativas en la concentracion urinaria de PIGF entre mujeres preeclampsicas (sPE frente a mPE, p = 0,733). No hubo ninguna correlacion significativa entre albuminuria y niveles urinarios de PIGF para el grupo de sPE (r = -0,091, p = 0,653). Hubo una correlacion inversa y significativa entre proteinuria y concentracion urinaria de PIGF en sPE (r = -0,6 de Pearson, p = 0,002). En resumen, las mujeres con sPE tuvieron niveles sericos de PIGF significativamente menores en comparacion con las mujeres con mPE y P-CTR. Los niveles urinarios de PIGF tambien fueron menores en mujeres preeclampsicas, y no variaron con la gravedad de la enfermedad hipertensiva.

Excreciones fraccionadas de factores angiogenicos, albumina y protefnas

Para evaluar si el dano glomerular que se produce en mujeres con preeclampsia grave da cuenta de la liberacion incrementada de marcadores angiogenicos en una muestra de orina, se analizo la excrecion fraccionada de cada uno de los marcadores angiogenicos identificados en relacion con albuminuria, proteinuria no especifica que refleja con probabilidad elevada alteracion de la capacidad de filtracion glomerular del rinon. Para cada uno de los grupos de estudio, tambien se llevaron a cabo analisis de correlacion entre la excrecion fraccionada de marcadores angiogenicos y la relacion de proteina total a creatinina aleatoria en orina. La excrecion fraccionada de una sustancia representa la proporcion de la sustancia excretada en la orina en comparacion con aquella filtrada por los glomerulos. Generalmente se da con relacion al aclaramiento de creatinina, puesto que la creatinina ni se reabsorbe ni se segrega significativamente, y de este modo se neutralizan cualesquiera efectos de la concentracion/dilucion de la orina. Las mujeres embarazadas sanas excretan significativamente mas VEGF en comparacion con NP-CTR (ANOVA p 0,001) (Figura 9). pHTN no impacto sobre la excrecion fraccionada de VEGF en comparacion con P-CTR (p = 0,346). Sin embargo, sPE incremento la excrecion fraccionada de VEGF significativamente en comparacion con mujeres pHTN (p = 0,007) o P-CTR (p 0,001).

El embarazo se caracteriza por una disminucion notable en la excrecion fraccionada de sFlt-1 (P-CTR frente a NP-CTR, p 0,001). pHTN no impacto sobre la excrecion fraccionada de sFlt-1 (P-CTR frente a pHTN, p = 0,43), mientras que sPE revertio los cambios inducidos por el embarazo para provocar una excrecion fraccionada incrementada de sFlt-1 en comparacion con PCTR (p 0,001) y pHTN (p 0,001) (Fig. 4).

La excrecion fraccionada de PIGF siguio un modelo similar a aquel de sFlt-1. Las mujeres P-CTR tuvieron una fraccion de excrecion disminuida de PIGF en comparacion con NP-CTR (PCTR frente a NP-CTR, p 0,001). De forma similar, pHTN no impacta adicionalmente sobre la fraccion de excrecion de PIGF (P-CTR frente a pHTN, p = 0,125), mientras que este efecto se revirtio parcialmente en mujeres con sPE (sPE frente a pHTN, p 0,001).

El embarazo no se caracterizo por un incremento en la excrecion fraccionada de albumina en controles sanas (NP-CTR frente a P-CTR, p = 0,385). Sin embargo, hubo un incremento significativo en la excrecion fraccionada de albumina en sPE en comparacion con los grupos de pHTN y P-CTR (ANOVA de una via, p 0,001).

No hubo ningun cambio significativo de la excrecion fraccionada de proteinas totales en asociacion con embarazo sano (NP-CTR frente a P-CTR, p > 0,05) o pHTN (PCTR frente a pHTN p > 0,05). En su lugar, el presente analisis demuestra un incremento muy significativo en la excrecion fraccionada de proteinas totales en sPE en comparacion con mujeres pHTN en el momento de la manifestacion clinica de la enfermedad (sPE frente a pHTN p 0,001).

No hubo ninguna correlacion significativa entre la excrecion fraccionada de albumina y aquella de cualquiera de los factores angiogenicos, con la excepcion de mujeres que sufren la enfermedad pHTN, y solo para el sFlt-1 (r = 0.639, p = 0,01) y PIGF (r = 0.687, p = 0,004).

No hubo ninguna correlacion entre proteinuria y la excrecion fraccionada de cualquiera de los factores angiogenicos examinados en mujeres NP-CTR (Pearson, VEGF [r = 0,33, p = 0,382], sFlt-1 [r = 0,40, p = 0,296], PIGF [r = 0,59, p = 0,09]). Se identifico una correlacion significativa entre proteinuria y excrecion fraccionada de sFlt-1 en mujeres P-CTR (sFlt-1 [r = 0,59, p = 0,03]). La excrecion fraccionada de PIGF y sFlt-1 no se correlaciono con proteinuria en mujeres P-CTR sanas (p > 0,05). Sin embargo, no hubo ninguna correlacion entre proteinuria y excrecion fraccionada de cualquiera de los factores angiogenicos en mujeres pHTN: VEGF (r = 0,42, p = 0,118), sFlt-1 (r = 0,23, p = 0,414), o PIGF (r = 0,34, p = 0,214). En sPE, no hubo ninguna correlacion entre proteinuria y excrecion fraccionada de VEGF (r = 0,30, p = 0,127) o sFlt-1 (r = 0,35, p = 0,07). Por el contrario, hubo una correlacion significativa entre proteinuria y excrecion fraccionada de PIGF (r = 0.50, p = 0,01). Adicionalmente, en mujeres con sPE, hubo una correlacion significativa entre la relacion de proteina total/creatinina aleatoria urinaria y la excrecion fraccionada de PIGF (r = 0.60, p = 0,002) o sFlt-1 (sFlt-1: r = 0,50, p = 0,007).

Se observo que los niveles sericos de VEGF y PIGF son significativamente inferiores en sPE en comparacion con controles embarazados sanos, mientras que sFlt-1 es significativamente mayor. A diferencia de sFlt-1 y PIGF, las concentraciones urinarias de VEGF siguen siendo significativamente mayores que su nivel serico en todos los grupos de estudio. Sin embargo, incluso cuando se da cuenta del grado de proteinuria como un reflejo de la integridad glomerular alterada, se encontro que sPE esta asociada con excrecion fraccionada incrementada de VEGF y sFlt-1. Por el contrario, PIGF (una proteina de peso molecular mucho menor), previamente propuesto como un marcador para preeclampsia, se correlaciono con proteinuria y la relacion de proteina total/creatinina aleatoria en orina. sPE se distingue como una entidad clinica hipertensiva divergente basandose en el presente hallazgo de que los niveles sericos y urinarios para todos los factores angiogenicos varian con la gravedad de la enfermedad hipertensiva. No obstante, el cambio en las concentraciones serica y de orina no se produce paralelamente.

Se determino ademas que las mujeres con sPE tienen niveles sericos disminuidos de VEGF libre, pero un incremento excepcional en su diuresis. Los niveles sericos disminuidos se pueden explicar via su union sustancial a proteinas plasmaticas, tales como sFlt-1. Como consecuencia, VEGF puede no ser detectado por el ELISA altamente especifico, que solo detecta la forma libre. Se concluye que el incremento dramatico en los niveles urinarios y excrecion fraccionada es probablemente mas el resultado de la produccion renal intrinseca y menos probablemente debido a perdida glomerular (26). El hallazgo expuesto aqui de que el incremento drastico en los niveles urinarios de VEGF es independiente de proteinuria y niveles sericos de VEGF apoya adicionalmente esta teoria. Sin embargo, los mecanismos a traves de los cuales los rinones potencian la produccion de VEGF son actualmente desconocidos, y esto requiere una investigacion posterior.

En resumen, sPE se caracteriza por un incremento drastico en la excrecion fraccionada de VEGF y sFlt-1. La magnitud de tales incrementos no se correlaciona con el grado de proteinuria como se refleja por la excrecion fraccionada de proteinas totales, albuminuria o la relacion de proteina total a creatinina aleatoria de orina. Esto demuestra que los niveles sericos alterados y el dano glomerular no son el unico mecanismo responsable de la produccion incrementada de factores angiogenicos urinarios en preeclampsia.

Referencias

1.

Roberts JM, Cooper DW. Pathogenesis and genetics of pre-eclampsia. Lancet. 2001; 357(9249): 53-56.

2.

MacKay AP, Berg CJ, Atrash HK. Pregnancy-related mortality from preeclampsia and eclampsia. Obstet Gynecol. 2001 ;97:533-38.

3.

Buhimschi IA, Saade GR, Chwalisz K, Garfield RE. The nitric oxide pathway in pre-eclampsia: pathophysiological implications. Hum Reprod Update 1998;4:25-42.

4.

Ward K, Hata A, Jeunemaitre X, Helin C, Nelson L, Namikawa C, Farrington PF, et al.. A molecular variant of angiotensinogen associated with preec- lampsia. Nat Genet 1993;4:59.

5.

Wallukat G, Homuth V, Fischer T, Horstkamp B, Jupner A, Baur E, Nissen E, Vetter K, Dudenhausen

JW, Haller H, Luft FC. Patients with preeclampsia develop agonistic antibodies against the angiotensin AT 1 receptor. J Clin Invest 1999; 103:945-952.

6.

Fass MM, Schinling GA, Baller JFW, Visscher CA, Bakker WW. A new animal model for human preeclampsia: ultra-low dose of endotoxin infusion in pregnant rats. Am J Obstet Gynecol 1994;171: 158-64.

7.

Roberts JM, Redman CW. Preeclampsia: more than pregnancy induced hypertension. Lancet 1993; 341: 1447-51.

8.

Maynard SE, Min JY, Merchan J, Lim KH, Li J, Mondal S et al. Excess placental soluble fins-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. J Clin Invest 2003; 111:649-58.

9.

Volhard F: Die doppelseitigen haematogenen Nierenerkrankungen Beril, Springer. 1918.

10.

Buhimschi IA, Saade GR, Chwalisz K, Garfield RE. The nitric oxide pathway in pre-eclampsia: pathophysiological implications. Hum Reprod Update. 1998;4:25-42.

11.

Takacs P, Kauma SW, Sholley MM, Walsh SW, Dinsmoor MJ, Green K. Increased circulating lipid peroxides in severe preeclampsia activate NF-kap-paB and upregulate ICAM-1 in vascular endothelial cells. FASEB J. 2001;15:279-81.

12.

Lockwood CJ, Peters JH. Increased plasma levels of ED1+ cellular fibronectin precede the clinical signs of preeclampsia. Am J Obstet Gynecol. 1990; 162:358-62.

13.

Levine RJ, Maynard SE, �ian C, Lim KH, England LJ, Yu KF, et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. N Engl J Med 2004:12; 350:672-83.

14.

Maynard SE, Min JY, Merchan J, Lim KH, Li J, Mondal S et al. Excess placental soluble fins-like tyrosine kinase 1 (sFlt1) may contribute to endothelial dysfunction, hypertension, and proteinuria in preeclampsia. J Clin Invest 2003; 111:649-58.

15.

Levine RJ, Maynard SE, �ian C, Lim KH, England LJ, Yu KF, et al. Circulating angiogenic factors and the risk of preeclampsia. N Engl J Med 2004: 12; 350: 672-83.

16.

Thadhani R, Mutter WP, Wolf M, Levine RJ, Taylor RN, Sukhatme VP, Ecker J, Karumanchi SA. First trimester placental growth factor and soluble fms- like tyrosine kinase 1 and risk for preeclampsia. J Clin Endocrinol Metab 2004; 89: 770-5.

17.

Sugimoto H, Hamano Y, Charytan D, Cosgrove D, Kieran M, Sudhakar A, et al. Neutralization of circulating vascular endothelial growth factor (VEGF) by anti-VEGF antibodies and soluble VEGF receptor 1 (sFlt-1) induces proteinuria. J Biol Chem 2003; 278:12605-8.

18.

American Collage of Obstetricians and Gynecologists. Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. Practice Bulletin. Washington, DC: ACOG Practice Bulletin No. 33, 2002.

19.

Caron C, Goudemand J, Marey A, Beague D, Ducroux G, Drouvin F. Are haemostatic and fibrinolytic parameters predictors of preeclampsia in pregnancy-associated hypertension� Thromb Haemost 1991;66:410-14.

20.

Spargo B, McCartney CP, Winemiller R. Glomerular capillary endotheliosis in toxemia of pregnancy. Arch Pathol 1959: 68:593-9.

21.

�hou Y, McMaster M, Woo K, Janatpour M, Perry J, Karpanen T, Alitalo K, Damsky C, Fisher SJ. Vascular endothelial growth factor ligands and receptors that regulate human cytotrophoblast survival are dysregulated in

5 severe preeclampsia and hemolysis, elevated liver enzymes, and low platelets syndrome. Am J Pathol 2002; 160:1405-23.

22. Rodgers GM, Taylor RN, Roberts JM. Preec- lampsia is associated with a serum factor cytotoxic to human endothelial cells. Am J Obstet Gyneco 1988;159:908-14.

23. Ahmed A, Dunk C, Ahmad S, Khaliq A. Regulation of placental vascular endothelial growth factor (VEGF) and 10 placenta growth factor (PlGF) and soluble Flt-1 by oxygen- a review. Placenta 2000;21: S16-24.

24.

American Collage of Obstetricians and Gynecologists. Diagnosis and management of preeclampsia and eclampsia. Practice Bulletin. Washington, DC: ACOG Practice Bulletin No. 33, 2002.

25.

Rodriguez-Thompson D, Lieberman. Use of a random urinary protein to creatinine ratio for the diagnosis of significant proteinuria during pregnancy. Am J Obstet Gynecol 2001 ;185:808-11.

15 26. Roes EM, Steegers EA, Thomas CM, Geurts- Moespot A, Raijmakers MT, Peters WH, Sweep CG. High levels of urinary vascular endothelial growth factor in women with severe preeclampsia, Int J Biol Markers 2004;19:72-5.

Claims (6)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un metodo para diagnosticar que una mujer embarazada tiene, o es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, que comprende medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y el factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF se usa como base para un indicador con respecto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP): log [sFlt-1/PIGF x 100].

2. 2.

   El metodo de la reivindicacion 1, en el que el indicador obtenido se puede utilizar para evaluar el riesgo de una mujer embarazada de desarrollar una afeccion asociada con un trastorno hipertensivo, en el que la afeccion se selecciona del grupo que consiste en: acido urico serico incrementado; parto por cesarea; tensiones arteriales sistolica y diastolica incrementadas; proteinuria en tira reactiva; embarazo; bajo peso fetal en el parto; ruptura de la placenta; restriccion del crecimiento intrauterino (EJGR); hemolisis; trombocitopenia; enzimas hepaticas elevadas y sindrome HELLP (hemolisis, enzimas hepaticas elevadas, bajo recuento plaquetario).

3. 3.

   El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 1,4 es un indicador de pronostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada necesitara tratamiento para prevenir el desarrollo o empeoramiento de sintomas asociados con trastornos hipertensivos.

4. 4.

   El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 2,1 es un indicador de diagnostico de preeclampsia grave.

5. 5.

   El metodo de la reivindicacion 1 o 2, en el que un uFP mayor que 2,1 es un indicador de diagnostico de un mayor riesgo de que una mujer embarazada necesitara alumbrar por cesarea.

6. 6.

   Uso de un kit que comprende:

   (a)

   un receptaculo para recibir una muestra de orina;

   (b)

   un medio para detectar sFlt-1;

   (c)

   un medio para detectar PIGF;

   (d)

   instrucciones para uso del kit para calcular un indicador en cuanto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP) una relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF: log [sFlt-1/PIGF x 100], en un metodo para diagnosticar una mujer embarazada que tiene, o que es susceptible de desarrollar, un trastorno hipertensivo, comprendiendo el metodo medir los niveles de tirosina cinasa 1 similar a fms soluble (sFlt-1) y del factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra de orina obtenida de la mujer, en el que la relacion de la expresion de sFlt-1 a la expresion de PIGF se usa como base para un indicador en cuanto a si la mujer esta en riesgo de desarrollar un trastorno hipertensivo, siendo el indicador (uFP): log [sFlt-1/PIGF x 100].

   P�C_R rta1� d_N rta21 PE rta1 m vd dadd

   C�������� ���� �����t� Edad: anos, media [����I] 26,4 [23,7-29,1] 29,8 [27,2-32,3] 24,4 [21,6-27,2] p=0,021 t Gravidez: mediana [intervalo] 2 [1-6] 2 [1-8] 1 [1-7] p=0,063: Numero de partos: mediana [intervalo] 1 [0-3] 0 [0-5] 0 [0-4] p=0,250 : Peso materno: kg, media [����I] 81,8 [74,0-89,6] 100 [84,7-115,3] 88,8 [74,8-101,6] p=0,166 t Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo]

   28,6 [7,0-39,0] 34,4 [16,6-40,4] 31,3 [24,1-40,2] p=0,304 :

   reclutamiento Edad gestacional: semanas, mediana [intervalo]

   38,5 [37,4-39,6] 34,4 [32,4-36,6] 32 [29,5-1-34,4] p=0,003 :

   parto

   C�������� ���� ������

   Peso del nacido: g, media [����I] 3355 [3093-3617] 2105 [1593-2617] 1622 [1095-2150] p=0,001 t

   M�t��� �����t� ���t��� TA sistolica: mmHg, media [����I] 105,5 [99,1-111,9] 160,0 [149,7-170,4] 162,4 [155,7-169,2] p 0,001 t TA diastolica: mmHg, media [����I] 64,4 [58,9-70,0] 94,6 [89,0-100,3] 101,5 [94,4-108,6] p 0,001 t Sintomas neurologicos n [�] 0,0 [0,0] 3,0 [14,3] 7,0 [41,2] p=0,0081 m

   El dato se analizo mediante ANOVA de una via (t), ANOVA de Kruskal-Wallis (:), Chi cuadrado (m)

   Figura 1

   d_N rta21 PE rta1 m vd da

   Et �� ���t��� �� ������ Proteinuria en tira reactiva: mediana [intervalo] 1,5 [0-4] 3 [1-4] p 0,001 � Proteinuria 24-h: g/dl, mediana [intervalo] 0,9 [0,1-13,1] 3,0 [0,7-5,4] p=0,109 � AST:U/l mediana [intervalo] 20,0 [8,0-59,0] 26,0 [5,0-1380,0] p=0,166 � ALT:U/l mediana [intervalo] 14,0 [4,0-32,0] 25,0 [9,0-550,0] p=0,010 � plaquetas: celulas/ulx103 media [����I] 263,3 [221,5-305,1] 194,3 [149,2-239,4] p=0,035 � LDH: U/l mediana [intervalo] 204,0 [153,0-366,0] 245,0 [184,0-2940,0] p=0,015 �

   �cido urico: mg/dl, mediana [intervalo] 5,8 [5,1-6,4] 6,7 [6,2-7,3] p=0,025 �

   El dato se analizo mediante la prueba de Mann-Whitney (�), prueba de la t de Student (�)

   Figura 2

   NP�C_R rta14 P�C_R rta1 d_N rta21 PE rta1 m vd da

   VEGF: pg/mgc 93,5 [21,2-258,6] 152,0 [26,8-488,3] 140,6 [42,3-483,5] 214,8 [17,1-817,6] p=0,019 :

   mediana [intervalo]

   PLGF: pg/mgc 14,7 [7,3-21,2] 65,7 [8,5-304,1] 22,1 [6,2-255,2] 19,2 [8,0-99,2] p 0,001 :

   mediana [intervalo]

   sFLT: pg/mgc 10,5 [0,4-48,1] 15,6 [0,1-65,8] 56,1 [7,6-453,5] 145,5 [6,4-990,7] p 0,001 :

   mediana [intervalo]

   Proteina: mg/mgc 6,4 [4,3-9,2] 7,3 [2,4-23,4] 7,4 [5,4-32,3] 11,8 [4,3-28,7] p 0,001 :

   mediana [intervalo]

   Creatinina: mg/ml1,3 [0,3-2,5] 1,0 [0,2-2,8] 0,5 [0,1-2,0] 0,7 [0,1-1,6] p=0,032 :

   mediana [intervalo]

   El dato se analizo mediante ANOVA de Kruskal-Wallis (:); los valores se dan por mg de creatinina (mgc) Figura 3

   ��A ��� ELISA� ���1 ELSIA�� PIó_

   Experimentos de ELISA representativos para sFlt-1 (A) y PIGF (B). Los pocillos de la izquierda muestran las curvas patron respectivas. Los pocillos a la derecha de cadaexperimento muestran la inmunorreactividad de 8 muestras de orina. Los cuatro superiores (mostrados en el recuadro) proceden de 4 pacientes diferentes conpreeclampsia grave (sPE), mientras que los cuatro inferiores proceden de 4 pacientes embarazadas normales (CRL).

   CHoja de analisis representativa usada para el calculo de uFP a partir del experimento en la diapositiva previa. : D: uFP media (+SD) de pacientes con preeclampsia grave(sPE) frente a controles (CRL). El asterisco indica significancia estadistica (p 0,001). La linea punteada indica el corte en uFP con valor de diagnostico para sPE a partirde nuestra publicacion [Am � Obstet Gynecol. 00� �ar, 1� � LR - 1].

   NP�C_R P�C_R �PE PE m vd dad

   VE� � ��v d�a��� �d 176,6 [78,7-819,0] 1,6 [0,0-59,8] 0,2 [0,0-123,9] 0,1 [0,0-48,1] P 0,001 : �v�� d�a������d 74,0 [5,4-116,7] 97,6 [21,4-219,3] 45,2 [7,6-231,3] 114,1 [8,2-817,6] p=0,021 :

   � ��v d�a��� �d 31,8 [20,1-64,9] 433,7 [189,0-1992,2] 1618,0 [539,4-3329,9] 2252,6 [1626,8-3328,2] p 0,001 : �v�� d�a������d 2,4 [0,7-35,4] 1,5 [0,3-17,9] 10,9 [1,6-217,7] 81,7 [12,7-990,7] p 0,001 :

   PI� � ��v d�a��� �d 8,3 [5,4-10,0] 330,0 [26,2-933,7] 169,2 [46,4-805,6] 58,5 [4,6-269,8] P 0,001 : �v�� d�a������d 9,9 [4,3-16,8] 55,8 [10,0-476,9] 13,6 [3,9-163,0] 17,3 [7,3-99,2] p=0,001 :

   P�����t�

   � ��v d����� �d 62,8 [45,0-93,6] 60,8 [52,5-81,3] 55,7 [21,5-91,4] 48,6 [29,7-57,2] p 0,001 :

   � ����d dav � �� ��v ����� d5,5 [3,9-8,6] 6,8 [4,5-16,3] 5,7 [2,2-24,8] 10,5 [4,0-38,5] p=0, 007 : �d v�� d��������d

   A��t � ��v d����� �d 23,0 � 1,5 23,1 � 1,5 30,8 � 5,71 19,5 � 1,4 p=0,235 : �v�� dé ������d 2,8 [1,3-7,2] 5,6 [1,7-21,5] 37,4 [7,8-503,6] 173,5 [52,1-3069,0] p 0,001 :

   C�����t�t�� ��v d���� �d 0,81 � 0,1 0,59 � 0,1 0,66 � 0,1 0,80 � 0,1 p=0,013 t �v�� d���� �d 121,5 � 26,1 120,3 � 11,3 136,5 � 24,8 103,9 � 15,7 p=0,634 t

   El dato se analizo mediante ANOVA de una via (t), ANOVA de Kruskal-Wallis (:)

   Figura 9