CN116953255A - 血清中总IgM和/或总IgG在子痫前期预测或诊断中的应用 - Google Patents
血清中总IgM和/或总IgG在子痫前期预测或诊断中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及血清中总IgM和/或总IgG在子痫前期预测或诊断中的应用。本发明发现了妊娠早期(妊娠11‑13周)血清中总IgM(AUC:0.878,95％CI:0.786‑0.969,P<0.001)和总IgG(AUC:0.856,95％CI:0.767‑0.946,P<0.001)水平与妊娠子痫前期的发生密切相关并均对子痫前期有良好的预测价值。本发明发现总IgM和总IgG的应用可以构建出有效的子痫前期早期预测模型，提高了现有诊断标记物对妊娠早期子痫前期预测效果，特异性更强，灵敏度更高(AUC:0.954,95％CI:0.896‑1.000,灵敏度:94.1％，特异性：91.2％)。本发明首次发现自身免疫抗体(IgM和IgG)的联合分析相较于PlGF对子痫前期有更高的预测价值，这为子痫前期的潜在机制提供了新的见解，有助于子痫前期高危妇女的早期筛查和管理。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及血清中总IgM和/或总IgG在子痫前期预测或诊断中的应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
子痫前期(pre-eclampsia,PE)是一种妊娠特异性疾病，其特点为妊娠20周后并发高血压(≥140/90mm Hg)和蛋白尿(≥300mg/L/24小时)，或伴有肾脏、眼等器官损害。作为全球孕产妇和围产期患病率和死亡率的主要原因，该疾病在辅助生殖人群中的发病风险更高。然而，由于子痫前期疾病的复杂混合性质以及缺乏有效的妊娠早期生物标志物，很多患者错过了早期干预的关键时机。目前，子痫前期的临床干预仍然停留在症状出现后的被动治疗阶段，以症状管理为主，并以适时分娩为最有效的治疗手段。因此，迫切需要筛选有效的早期预测筛查生物学标志物并提出相应方法策略。这将有助于为子痫前期高危人群提供更早、更及时有效的治疗手段，从而改善患者的预后，提高母婴健康。
子痫前期的发病机制尚未完全阐明，最近的研究支持母体-胎儿界面免疫适应不良假说，即孕早期胚胎和母体之间免疫适应不良会诱发胎盘早期发育及功能障碍，从而导致子痫前期发生。同时，一些免疫细胞，如调节性T细胞、巨噬细胞、NK细胞和中性粒细胞，通过调节细胞因子和血管生成因子的分泌，促进胎盘滋养细胞入侵子宫蜕膜组织，支持母体螺旋动脉的改造以适应妊娠建立和维持，从而参与母体-胎儿界面的调节。母体-胎儿界面的免疫耐受对建立和维持成功的妊娠至关重要，胎盘的异常植入也可能引起母体的异常免疫反应和全身炎症反应。在子痫前期的临床表现出现之前，就可以检测到免疫功能紊乱。因此，在妊娠早期检测子痫前期的潜在血清免疫学标志物具有相当的临床意义。胎盘生长因子(PlGF)是临床中应用较广的评估子痫前期患者病情的常见指标，但在早期阶段准确预测子痫前期的能力有限。在临床上，为提高早期预测效果，常采用多指标联合检测。血清中的IgA、IgM和IgG在广泛的免疫反应中具有关键作用，其水平从妊娠早期(怀孕前三个月)就开始升高，但目前尚无其用于预测子痫前期的相关研究。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供血清中总IgM和/或总IgG在子痫前期预测或诊断中的应用。本发明首次发现自身免疫抗体(IgM和IgG)的联合分析相较于PlGF对子痫前期有更高的预测价值，这为子痫前期的潜在机制提供了新的见解，有助于子痫前期高危妇女的早期筛查和管理。
为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：
第一方面，本发明提供了血清中总IgM和/或总IgG作为标志物在制备用于子痫前期预测或诊断的产品中的应用，所述产品的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
第二方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
第三方面，本发明提供了一种试纸，所述试纸包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
第四方面，本发明提供了一种用于子痫前期预测或诊断的装置，所述装置包括：
a)分析器单元，其包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂，适配于检测妊娠11-13周孕妇的血清中总IgM浓度和/或总IgG浓度；和，
b)评估单元，其包括已经实现用于实施以下步骤的算法的数据处理器：
通过判定血清中总IgM的浓度是否达到36.04g/L以上或血清中总IgG抗体的浓度是否达到11.21g/L以上，预测或诊断妊娠妇女在孕后期是否将发生子痫前期。
上述本发明的一种或多种技术方案取得的有益效果如下：
子痫前期病因和发病机制不清，缺乏早期预测靶标及有效临床干预措施，一旦病情进展，除提前终止妊娠外无其他有效措施。本发明发现了妊娠早期(妊娠11-13周)血清中总IgM(AUC:0.878,95％ CI:0.786-0.969,P<0.001)和总IgG(AUC:0.856,95％ CI:0.767-0.946,P<0.001)水平与妊娠子痫前期的发生密切相关并均对子痫前期有良好的预测价值。
通过比较分析目前研究较广泛接受的子痫前期生物学标志物PlGF(AUC＝0.825)和新发现的子痫前期生物标志物总IgM和总IgG，本发明发现总IgM和总IgG的应用可以构建出有效的子痫前期早期预测模型，提高了现有诊断标记物对妊娠早期子痫前期预测效果，特异性更强，灵敏度更高(AUC:0.954,95％ CI:0.896-1.000,灵敏度:94.1％，特异性：91.2％)，此外该预测模型在验证队列中也表现出良好的预测效果(AUC:0.747,95％ CI:0.571-0.923,灵敏度:94.0％，特异性:61.1％)，提供了一种通过新型妊娠早期血清生物标志物有效预测子痫前期的新方法，在未来有望对子痫前期的发生进行早期预测和诊断。
附图说明
构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。
图1为子痫前期患者组和健康孕妇对照组之间妊娠早期血清生物标志物(A)IgM、(B)IgG和(C)PlGF的显著差异小提琴图(正常妊娠对照组N为34例vs.子痫前期PE为34例)，注：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；
图2为血清中(A)IgM、(B)IgG和(C)PlGF水平对子痫前期的预测、诊断效能(N为34vs.PE为34)的ROC曲线；
图3中A为血清中IgM和IgG联合分析对子痫前期的预测、诊断效能(N为34vs.PE为34)的ROC曲线，其中联合分析回归方程为Exp(Y)＝-31.08+0.43*IgM+1.33*IgG；B为血清中IgM和IgG联合分析预测模型在验证队列中对子痫前期的预测、诊断性能(N为18vs.PE为18)的ROC曲线。
具体实施方式
目前的研究表明，母胎界面的免疫耐受是建立和维持成功妊娠的关键。这包括胎盘细胞与母体免疫系统之间的相互作用，从而促进母胎免疫对话正常进行。有研究认为，在子痫前期出现临床症状之前就可以发现免疫功能紊乱；因此，妊娠早期检测子痫前期的血清免疫学标志物具有重要的临床意义。越来越多的证据表明，Igs(包括IgA、IgM和IgG)在广泛的免疫反应中起着至关重要的作用。血清中IgA、IgM和IgG水平在妊娠前3个月增高，突出了其在妊娠适应性调节中的重要性。
B细胞也参与了子痫前期的免疫调节。活化后，B细胞会产生抗体和细胞因子，与T细胞相互作用，调节免疫反应。调节性B细胞可以与T细胞相互作用，调节T细胞的亚群平衡，促进调节性T细胞的生成和功能，进而维持免疫平衡，在子痫前期发病机制中发挥关键作用。我们的研究提示，血清中IgM和IgG水平的改变可能是由于B淋巴细胞的数量或功能改变所致，B淋巴细胞在子痫前期中的作用需要进一步研究。
本发明通过检测子痫前期患者妊娠早期(孕11-13周)血清中自身免疫抗体(IgM和IgG)的表达水平，旨在探索新的妊娠早期血清生物标志物，并建立有效的早期预测模型，在独立的验证队列中进行预测效果的检验，体外定性检测人血清中的总Ig类抗体，这可以促进早期诊断策略的发展，并为进一步探索子痫前期的机制提供免疫学见解。
本发明的第一种典型实施方式，血清中总IgM和/或总IgG作为标志物在制备用于子痫前期预测或诊断的产品中的应用，所述产品的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述产品通过以下方法进行子痫前期预测或诊断：
检测血清中总IgM浓度和/或总IgG浓度；
当血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
在实验过程中，由于总IgM和总IgG的浓度可能会随孕周的改变而改变。在妊娠11-13周时，子痫前期患者组血清中总IgM的浓度平均值为40.4953g/L，最大值为46.2492g/L，最小值为34.0605g/L；健康孕妇对照组血清中总IgM的浓度平均值为32.9782g/L，最大值为44.6991g/L，最小值为21.1498g/L。设定的患有子痫前期的标准线以包含75％的样本数为标准，因此血清中总IgM浓度的判定标准定在36.04g/L；
在妊娠12周时，子痫前期患者组血清中总IgG的浓度平均值为12.0619g/L，最大值为14.4288g/L，最小值为9.9443g/L；健康孕妇对照组血清中总IgG的浓度平均值为10.2695g/L，最大值为13.5375g/L，最小值为7.6624g/L。设定的患有子痫前期的标准线以包含75％的样本数为标准，因此血清中总IgG浓度的判断标准定在11.21g/L。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述产品包括试剂盒、试纸或具有分析和评估功能的装置。
本发明的第二种典型实施方式，一种试剂盒，所述试剂盒包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述试剂盒的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述试剂盒检测到血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
本发明的第三种典型实施方式，一种试纸，所述试纸包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述试纸的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
该实施方式的一种或多种实施例中，所述试纸检测到血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
本发明的第四种典型实施方式，一种用于子痫前期预测或诊断的装置，所述装置包括：
a)分析器单元，其包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂，适配于检测妊娠11-13周孕妇的血清中总IgM浓度和/或总IgG浓度；和，
b)评估单元，其包括已经实现用于实施以下步骤的算法的数据处理器：
通过判定血清中总IgM的浓度是否达到36.04g/L以上或血清中总IgG抗体的浓度是否达到11.21g/L以上，预测或诊断妊娠妇女在孕后期是否将发生子痫前期。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例与对比例详细说明本发明的技术方案。
实施例1
选取经体外受精治疗后11-13周的子痫前期患者34例和健康孕妇对照34例，采用静脉穿刺法采集孕妇空腹静脉血6ml至真空管中。全血经凝血、离心后制备血清。所有血清样本保存在-80℃直到检测。
采用人PlGF ELISA试剂盒(R&D，DPG00)对采集的子痫前期孕妇和健康孕妇的血清样本进行ELISA测定。具体根据ELISA试剂盒生产商的说明书进行检测。在美国MolecularDevices公司的SpectraMax Plus酶标仪上，从450nm处读数减去540nm处读数，即可测得最终的吸光度值。上述样品的血清PlGF水平可通过将吸光度值带入标准曲线的拟合公式(具体依据ELISA试剂盒生产商的说明书实施)计算得出。
检测妊娠早期(孕11-13周)子痫前期患者组与健康孕妇对照组血清中总IgG和总IgM的浓度，包括以下步骤：
1、收取血清标本：用真空促凝剂采血管采集血液标本，收集34例来自山东大学临床研究中心的子痫前期患者和34例匹配(年龄、BMI、受精方式等)的健康孕妇的新鲜空腹静脉血样本(孕11-13周)，将样本上下混匀后在室温静置30分钟，以3000rpm离心5分钟，吸取上层血清检测，得到血清样品。样品按照1：200的比例用PBS稀释并保存备用。
2.抗原包被：向Purified anti-human IgG Fc Recombinant Antibody(BioLegend,California,USA，410701)100ug加入PBS，按照1:1000比例进行稀释；稀释后的抗原按照60ul/孔加入至ELISA板(514201.NEST)内；密封96孔板防止蒸发，放入4℃冰箱孵育过夜；
3.封闭非特异性结合位点：取出96孔板并置于室温平衡，弃去孔内液体，每孔加入含0.05％ Tween20(Shanghai Macklin BiochemicalCo.,Ltd.)的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
准备含0.5％明胶(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.)和0.5％牛血清白蛋白(Beijing Solarbio Science&Technology Co.,Ltd.)的PBST封闭液，每孔加入100ul封闭液，密封板并在室温放置1h；弃去孔内液体，每孔加入含0.05％ Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
4.添加待测样本：将血清样品室温融化，并用PBS稀释至1：200浓度，设置样本孔和空白孔，样本孔中加入50ul待测样本，空白孔加入50ul PBS；密封板并在室温孵育2-4小时，每孔加入含0.05％Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次。
5.添加抗体：将Biotin-IgM抗体(BioLegend,California,USA，314504)和Biotin-IgG抗体(BioLegend,California,USA，410718)置于冰上，并用PBS稀释至1：2000的浓度，每孔加入60ul稀释后抗体，室温孵育1小时；弃去孔内液体，每孔加入含0.05％ Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤3次；将链酶亲和素-辣根过氧化物酶(BioLegend,California,USA)用PBS稀释至1：2000的浓度，每孔加入60ul，避光室温孵育30分钟；弃去孔内液体，每孔加入含0.05％ Tween20的PBST洗涤液200ul，洗涤5次。
6.TMB显色：每孔加入TMB显色液(Beijing Solarbio Science&Technology Co,Ltd)100ul，37度孵育15分钟；每孔加入50ul TMB终止液(J&L Biological Company,Shanghai,China),终止显色反应。
7.读数：总IgG标准抗体由在PBS中以不同浓度梯度稀释的人IgG(SP001,Solarbio)获得。采用阴性对照(无抗原包衣缓冲液制备)和阳性对照(系统性红斑狼疮血清)，排除非特异性结合和假阳性结果。利用BioTek Epoch多波长光谱微孔板在450nm处读取每个孔的光密度值(OD)，计算血清样品对应的OD值。
8.计算：Y＝0.0151x-0.0035,R2＝0.9956为由标准曲线导出的回归方程，利用标准曲线测定ELISA中子痫前期血清生物标志物水平。
如图1中A和B所示，血清中总IgM和总IgG水平在子痫前期患者中相较正常孕妇显著升高(P<0.05)。如图1中的C所示，血清PlGF水平在子痫前期患者组中相较于健康孕妇对照组中显著降低(P<0.05)。
在实验过程中，由于总IgM和总IgG的浓度可能会随孕周的改变而改变。在妊娠11-13周时，子痫前期患者组血清中总IgM的浓度平均值为40.4953g/L，最大值为46.2492g/L，最小值为34.0605g/L；健康孕妇对照组血清中总IgM的浓度平均值为32.9782g/L，最大值为44.6991g/L，最小值为21.1498g/L。设定的患有子痫前期的标准线以包含75％的样本数为标准，因此血清中总IgM浓度的判定标准定在36.04g/L；
在妊娠12周时，子痫前期患者组血清中总IgG的浓度平均值为12.0619g/L，最大值为14.4288g/L，最小值为9.9443g/L；健康孕妇对照组血清中总IgG的浓度平均值为10.2695g/L，最大值为13.5375g/L，最小值为7.6624g/L。设定的患有子痫前期的标准线以包含75％的样本数为标准，因此血清中总IgG浓度的判断标准定在11.21g/L。
如图2中的A和B所示，通过ROC曲线进一步分析血清中总IgM和总IgG水平对子痫前期的诊断效果，结果显示IgM(AUC：0.878)和总IgG(AUC：0.856)均对子痫前期有极佳的预测效果。如图2中的C所示，通过ROC曲线进一步分析血清PlGF水平对妊娠早期子痫前期的预测效果，结果显示血清PlGF对子痫前期有良好的预测效果(AUC：0.825)。血清中总IgM和总IgG的独立预测效果均优于PlGF。
如图3中的A所示，通过联合分析子痫前期生物标志物IgM和IgG，构建出子痫前期早期预测模型，优于二者的独立预测效果，提高了现有诊断标记物对妊娠早期子痫前期预测效果，特异性更强，灵敏度更高(AUC:0.954，95％ CI:0.896-1.000,灵敏度：94.1％，特异性：91.2％)。
此外，按照相同的筛查纳入标准，收集了18例子痫前期患者和18例匹配的健康孕妇的新鲜空腹静脉血样本(孕11-13周)，作为该预测模型的验证队列。如图3中的B所示，采用上述相同的步骤方法对血清中总IgM和总IgG水平进行检测，并对该模型的预测效果进行验证，发现该预测模型在验证队列中也表现出良好的预测效果(AUC:0.747,95％ CI:0.571-0.923,灵敏度:94.0％，特异性:61.1％)。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.血清中总IgM和/或总IgG作为标志物在制备用于子痫前期预测或诊断的产品中的应用，其特征在于，所述产品的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过以下方法进行子痫前期预测或诊断：
检测血清中总IgM浓度和/或总IgG浓度；
当血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括试剂盒、试纸或具有分析和评估功能的装置。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
6.如权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒检测到血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
7.一种试纸，其特征在于，所述试纸包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂。
8.如权利要求7所述的试纸，其特征在于，所述试纸的检测对象为妊娠11-13周孕妇的血清。
9.如权利要求7所述的试纸，其特征在于，所述试纸检测到血清中总IgM的浓度在36.04g/L以上时或血清中总IgG抗体的浓度在11.21g/L以上时，预测或诊断妊娠妇女在孕后期将发生子痫前期。
10.一种用于子痫前期预测或诊断的装置，其特征在于，所述装置包括：
a)分析器单元，其包含用于检测血清中总IgM和/或总IgG的试剂，适配于检测妊娠11-13周孕妇的血清中总IgM浓度和/或总IgG浓度；和，
b)评估单元，其包括已经实现用于实施以下步骤的算法的数据处理器：
通过判定血清中总IgM的浓度是否达到36.04g/L以上或血清中总IgG抗体的浓度是否达到11.21g/L以上，预测或诊断妊娠妇女在孕后期是否将发生子痫前期。
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