KR20100122495A - 급성 신장 장해 및 예후 추정용 바이오마커 및 그 용도 - Google Patents

급성 신장 장해 및 예후 추정용 바이오마커 및 그 용도 Download PDF

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고쿠리츠 다이가쿠 호우징 나고야 다이가쿠
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Abstract

급성 신장 장해의 조기 발증 예측, 신장 기능에 관한 예후 추정, 및 급성 신장 장해의 감별에 유용한 신규 바이오마커를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 상기 신규 바이오마커의 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 미드카인을 바이오마커로서 사용한다. 뇨내 미드카인의 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 발증 가능성 판정, 신장 기능에 관한 예후 추정, 또는 급성 신장 장해의 감별을 행한다.

Description

급성 신장 장해 및 예후 추정용 바이오마커 및 그 용도{BIOMARKER FOR THE ESTIMATION OF ACUTE RENAL DISORDER AND PROGNOSIS OF THE DISORDER, AND USE OF THE BIOMARKER}
본 발명은 급성 신장 장해의 검사, 신장 기능에 대한 예후 추정, 및 급성 신장 장해의 감별에 유용한 신규 바이오마커 및 그 용도에 관한 것이다.
급성 신장 장해(Acute kidney injury, 이하, 「AKI」라고도 함)의 진단은, 뇨량, 혈청 크레아티닌(Cr) 수치, 혈청 요소 질소, 뇨내 NAG, β2-마이크로글로불린 수치 등을 지표로 하고 있지만, 어떠한 지표도 급성기의 병의 용태를 예민하게 진단할 수 있을 때까지는 진단 민감도를 보이지 않아, 검사 소견 및 임상 소견으로 종합적인 진단을 하고 있는 실정이다. 이에, 유효한 치료를 개시하기까지 많은 시간이 소요되어 치료 성적이 불량한 것이 현재의 실정이다.
진단 및 치료의 급속한 진보에도 불구하고, 집중 치료 영역(ICU)에서의 중증 급성 신장병 환자의 사망률은 과거 50년간 크게 진전되지 않고 50% 전후에 머물러 있어, 여전히 극복해야할 과제로 남아있다. AKI를 보이는 질환은 개심술 및 대동맥 치환 수술 후, 패혈증, 장기 이식 후 등, 수술 후 ICU 관리가 필요한 질환이 많으며, 발증 후, 시간 단위로 병의 용태를 파악하여야 하므로, AKI의 조기 진단 및 조기 치료 개입 없이는 생명 예후의 개선은 현재 어려운 실정이다. 이에 대처하기 위해, 급속히 신장 기능이 저하되는 병의 용태를 AKI로서 파악하고, AKI를 스테이지 분류하여, 조기에 진단하고, 치료 개입할 필요성이 최근들어 특히 강조되고 있다.
현 상태에서는, AKI의 진단은 통상 혈청 Cr 상승을 지표로 행해지고 있다. 그러나, 실제로 신장 장해가 발생한 후 혈청 Cr이 상승하기까지 2 내지 3일이 소요되므로, AKI 진단 시점에서는 이미 치료 개입의 타이밍을 놓친 경우가 많다. 따라서, 혈청 Cr은 AKI의 진단 마커로서는 불충분하여, 조기 바이오마커의 확립이 급선무이다.
지금까지, AKI를 치료하기 위해, 항-아포토시스(apoptosis)/항-괴사제, 항-염증제, 항-패혈증제, 각종 성장 인자, 혈관 확장제 등의 신규 치료약에 대한 임상시험이 수행되었지만, 현저한 결과는 달성되지 못하였다. 그 이유로는, 복잡한 환자 배경 또는 매우 다양한 AKI의 병인 뿐만 아니라 AKI 진단의 적절한 조기 바이오마커 부족으로 인한 조기 개입 실패를 들 수 있다.
최근, AKI에 대한 신규한 뇨내 바이오마커로서, 호중구의 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL: neutrophil gelatinase-associated lipocaline, 비특허 문헌 1), 인터루킨 18(IL-18: Interleukin 18, 비특허 문헌 2), 신장 장해 분자-1(KIM-1: kidney injury molecule-1, 비특허 문헌 3), 간형 지방산 결합 단백질(L-FABP: liver type fatty acid-binding protein, 비특허 문헌 4, 5) 등의 유용성이 보고되고 있다(비특허 문헌 6).
Mishra J, et al., Lancet. 2005 Apr 2-8; 365(9466): 1231-8. Prikh CR et al., Kidney Int. 2006 Jul; 70(1): 199- 203. Epub 2006 May 17). Han WK et al., Kidney Int. 2002 Jul; 62(1): 237-44. Nakamura T. et al., American journal of Kidney Diseases, Vol(47), No3 March, 2006: pp439-444. Yamamoto T. et al., J Am Soc Nephrol 18: 2894-2902, 2007. Coca SG. et al., Kidney Int 19: Dec Review, 2007.
이러한 배경하에, 본 발명은 AKI의 발증 가능성을 조기에 파악하기 위한 바이오마커를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, AKI의 검사방법 등의 상기 바이오마커의 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 신장 기능에 관한 예후를 파악하기 위한 유용한 바이오마커 및 그 용도를 제공하는 것을 과제로 한다. 아울러, AKI의 감별 진단에 유효한 바이오마커를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, AKI의 감별법 등, 상기 바이오마커의 용도를 제공하는 것을 과제로 한다.
상기 과제를 감안하여, 본 발명자들은 미드카인(「MK」라고도 함)에 주목하여, 이의 바이오마커로서의 가능성을 검토하였다. 먼저, 각종 신장 질환에서의 뇨내 MK 농도를 조사한 결과, 협의의 AKI인 급성 뇨세관 괴사(ATN) 환자에서 뇨내 미드카인의 농도 상승이 확인되었다. 한편, 복부 대동맥류 수술 후 AKI와 뇨내 MK 농도와의 관련성을 검토한 결과, 수술 중에 뇨내 MK 농도가 상승한 증례(症例)에서 수술 후 AKI가 발병하였다. 즉, AKI가 나중에 발병할 환자에서, 극히 조기 단계에서 뇨내 MK 농도 상승이 이루어진다는, 놀라운 사실을 확인하였다. 이와 같이, 수술 중이라는 극히 조기 단계에서 AKI의 발증을 예측할 수 있음을 보여준다. 또한, 신장 이식 후 이식 신장의 신장 기능과 뇨내 MK 농도와의 관계, 조영제에 의한 신장 장해와 뇨내 MK 농도와의 관계, 신장 부분 절제를 시행한 경우와 뇨내 MK 농도와의 관계, 또한 미소 변화군의 뇨내 MK 농도를 조사한 결과, AKI의 발증을 조기에 예측하는 지표로서 뇨내 MK 농도가 극히 유효한 것으로 나타났다. 다른 AKI 증례에 있어서도 마찬가지의 결과가 나타났다. 이와 같이, 본 발명자들이 예의 검토한 결과, AKI의 발증 가능성을 파악하는데 뇨내 MK가 유용한 지표(바이오마커)임이 명확해졌다.
한편, 신장 부분 절제술을 시행한 경우와 뇨내 MK 농도의 관계를 검토한 실험 결과로부터, 뇨내 MK 농도가 예후 추정의 지표로서 유효한 것으로 판명되었다. 또한, 화학요법 실시 후 또는 네프로제 증후군으로 진행되는 급성 신장 장해와 뇨내 MK 농도와의 관계를 검토한 결과, 신장 부분 절제술로만 한정되지 않고, 광범위한 증례에서, 예후를 추정하는 지표로서 뇨내 MK 농도가 유효하다는 것이 분명해졌다.
또한, 한편, 급성 뇨세관 괴사(ATN)를 조직 진찰을 통해 진단받을 수 있던 환자에서도 뇨내 MK 농도가 현저하게 높은 것으로 판명되었다. 또한, 진찰자 동작 특성 곡선(receiver operating characteristic curve: ROC 곡선)을 분석한 결과, 매우 높은 민감도와 특이도가 확인되었다. 또한, 기존의 바이오마커인 β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG), 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨 18(IL-18)과 비교 검토한 결과, 이들 기존의 바이오마커에 비해 뇨내 MK의 AUC(area under the curve: ROC 곡선하 면적)가 유의적으로 높았으며, AKI 감별용 바이오마커로서는 뇨내 MK가 가장 우수한 것으로 판명되었다. 이상과 같이, 본 발명자들이 연구를 거듭한 결과, AKI 감별용 바이오마커로서 뇨내 MK가 매우 우수하다는 것을 발견하였다.
본원에서는, 주로 이상의 연구 결과에 따라 완성된 이하의 발명을 제공한다.
[1] 미드카인을 포함하는, 급성 신장 장해 조기 검출용 바이오마커.
[2] 뇨내 미드카인의 양을 지표로 하는 급성 신장 장해의 검사방법.
[3] 하기 단계 (1) 및 (2)를 포함하는, [2]에 기재된 검사방법:
(1) 뇨내 미드카인을 검출하는 단계;
(2) 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 발증 가능성을 판정하는 단계.
[4] 급성 신장 장해가 급성 뇨세관 괴사인, [2] 또는 [3]에 기재된 검사방법.
[5] 급성 신장 장해가 허혈성 급성 신장 장해, 중독성 급성 신장 장해 또는 패혈증성 급성 신장 장해인, [2] 또는 [3]에 기재된 검사방법.
[6] 허혈성 급성 신장 장해가 수술 후 허혈성 급성 신장 장해인, [5]에 기재된 검사방법.
[7] 허혈 상태를 일으키는 시술시부터 수술 후 1일까지의 사이에 채취한 뇨를 사용하여 단계 (1)을 실시하는, [6]에 기재된 검사방법.
[8] 허혈 상태를 일으키는 시술 개시부터 3시간 이내에 채취한 뇨를 사용하여 단계 (1)을 실시하는, [6]에 기재된 검사방법.
[9] 수술이 대혈관 수술, 인공 심폐 장치를 사용하는 개심술, 장기 이식술 또는 신장 종양 부분 신장 절제술인, [6] 내지 [8] 중 어느 하나에 기재된 검사방법.
[10] 단계 (1)에 추가로 하기 단계 (1')을 실시하고, 단계 (2)에서 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 발증 가능성을 판정하는, [3] 내지 [9] 중 어느 하나에 기재된 검사방법:
(1') 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨18(IL-18), 뇨내 신장 장해 분자-1(KIM-1), β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG) 및 뇨내 간형 지방산 결합 단백질(L-FABP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
[11] 단계 (1)에서 미소 변화군의 환자의 뇨를 검체로서 사용하여 뇨내 미드카인을 검출하는, [3]에 기재된 검사방법.
[12] 항-미드카인 항체를 포함하는 급성 신장 장해 검사용 시약.
[13] [12]에 기재된 시약을 포함하는, 급성 신장 장해 검사용 키트.
[14] 미드카인을 포함하는, 신장 기능에 관한 예후 추정용 바이오마커.
[15] 뇨내 미드카인 함량을 지표로 하는, 신장 기능의 예후 추정 방법.
[16] 허혈성 급성 신장 장해, 중독성 급성 신장 장해 또는 패혈증성 급성 신장 장해의 예후를 추정하는 방법인, [15]에 기재된 예후 추정 방법.
[17] 신장 이식 후 또는 신장 부분 절제 수술 후 뇨내 미드카인을 검출하고, 이하의 기준에 따라 예후를 추정하는, [15]에 기재된 예후 추정 방법:
수술 후 6시간부터 48시간 동안에 인정되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이면 예후는 양호하고, 수술 후 6시간부터 48시간 동안에 인정되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이 아니고 높은 수치가 지체(遷延) 내지 지속되면 예후는 불량함.
[18] 병에 걸린 신장 유래의 뇨 및/또는 건강한 신장 유래의 뇨를 검체로 하여 뇨내 미드카인을 검출하는, [17]에 기재된 예후 추정 방법.
[19] 항-미드카인 항체를 포함하는 신장 기능에 관한 예후 추정용 시약.
[20] [19]에 기재된 시약을 포함하는, 신장 기능에 관한 예후 추정용 키트.
[21] 미드카인을 포함하는 급성 신장 장해 감별용 바이오마커.
[22] 뇨내 미드카인 함량을 지표로 한 급성 신장 장해의 감별법.
[23] 이하의 단계 (1) 및 (2)를 포함하는, [22]에 기재된 감별법:
(1) 뇨내 미드카인을 검출하는 단계;
(2) 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 원인이 급성의 뇨세관 장해인지 여부를 판정하는 단계.
[24] 급성 신장 장해가 급성 뇨세관 괴사인, [22] 또는 [23]에 기재된 감별법.
[25] 급성 신장 장해가 허혈성 급성 신장 장해인, [22] 또는 [23]에 기재된 감별법.
[26] 허혈성 급성 신장 장해가 수술 후 허혈성 급성 신장 장해인, [25]에 기재된 감별법.
[27] 단계 (1)에 추가로 하기 단계 (1')을 실시하고, 단계 (2)에서 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 원인이 급성의 뇨세관 장해인지 여부를 판정하는, [23] 내지 [26] 중 어느 하나에 기재된 감별법:
(1') 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨18(IL-18), 뇨내 신장 장해 분자-1(KIM-1), β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG) 및 뇨내 간형 지방산 결합 단백질(L-FABP)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
[28] 항-미드카인 항체를 포함하는 급성 신장 장해 감별용 시약.
[29] [28]에 기재된 시약을 포함하는 급성 신장 장해 감별용 키트.
도 1은 각 신질환 환자의 뇨내 MK 농도이다. 가로축은 좌측에서부터 순서대로 급성 사구체신염(AGN) 환자(5명), ANCA 관련 사구체신염(anti­neutrophil cytoplasmic antibody related GN) 환자(41명), 급성 뇨세관 괴사(ATN) 환자(33명), 소장 분절성 사구체 경화증(FSGS) 환자(29명), 자반병성 신장염(HSPN) 환자(10명), IgA 신장병(IgAN) 환자(124명), 미소 변화형 네프로제 증후군(MCNS) 환자(50명), 막성 증식성 사구체신염(MPGN) 환자(9명), 혈전성 미소 혈관증(TMA) 환자(8명), 파라프로테인혈증(paraproteinemia) 관련 신장병 환자((15명), 루프스 신장염(Lupus GN) 환자(42명), 신장 경화증(nephrosclerosis) 환자(15명), 상염색체 우성 다발성낭포 신장병(ADPKD) 환자(8명), 당뇨병성 신장병(Diabetic N) 환자(35명), 뇨세관간질성 신장염(TIN) 환자(15명), 막성 신장병(Membranous GN) 환자(74명), 그 외에 신장염(miscellaneous) 환자(37명), 정상인 자원자(control)(33명)이다. 세로축은 뇨내 MK 농도(pg/ml)이다.
도 2는 뇨내 MK 농도의 ROC(receiver-operating characteristic curve) 곡선을 분석한 결과이다. 가로축은 (1-특이도), 세로축은 민감도이다. ROC 곡선의 아래쪽 면적은 0.965이고, 컷 오프 값을 70 pg/ml로 설정했을 때의 진단 민감도 및 특이도는 각각 97.0% 및 90.3%이다.
도 3은 뇨내 MK 및 기존의 뇨내 바이오마커(NAG, NGAL, IL-18)를 비교한 것이다. 전체 583 증례를 ATN(급성 뇨세관 괴사), 대조군(정상인), 다른 신장 질환으로 3가지 군으로 나누어, 각 뇨내 바이오마커의 농도를 상자 수염도로 나타낸다.
도 4는 각종 뇨내 바이오마커의 ROC 곡선을 비교한 것이다. 각 뇨내 바이오마커의 실측값(뇨내 Cr 농도 보정을 하지 않음)을 사용하여, ATN군과 그 이외의 군(단, 정상인은 제외)의 감별을 행하였다. AUC는 뇨내 MK가 가장 높은 값을 얻을 수 있다.
도 5는 각종 뇨내 바이오마커의 ROC 곡선을 비교한 것이다. 뇨내 Cr 농도 보정 후의 값을 사용하여, ATN군과 그 이외의 군(단, 정상인 제외)의 감별을 행하였다. 실측값을 사용한 경우와 마찬가지로, AUC는 뇨내 MK가 가장 높다.
도 6은 각종 뇨내 바이오마커의 AUC를 비교한 것이다. 뇨내 MK의 AUC와 기존의 뇨내 바이오마커의 AUC를 비교하였다. 상단은 실측값으로 비교한 것이고, 하단은 뇨내 Cr 농도 보정한 값으로 비교한 것이다. 실측값, 뇨내 Cr 보정한 값 모두, 뇨내 MK가 다른 바이오마커보다 우수한 것으로 입증되었다. 그리고, SE는 표준오차이다.
도 7은 복수개의 바이오마커를 조합한 경우의 민감도 및 특이도를 비교한 것이다. 기호 「＋」로 조합을 표현한 것은, 상기 조합에 포함되는 모든 바이오마커가 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정한다. 기호 「/」로 조합을 조합을 표현한 것은, 상기 조합에 포함되는 바이오마커 중 하나에서도 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정한다.
도 8은 복부 대동맥류 치환술을 받은 환자의 백그라운드이다.
도 9는 복부 대동맥류 치환술을 받은 환자의 수술전 검사 소견이다.
도 10은 복부 대동맥류 치환술의 경과와 뇨내 MK 농도의 측정 시기를 나타낸다. 경시적으로 채뇨해(화살표로 나타낸 각 시점), 뇨내 MK 농도를 ELISA로 측정하였다.
도 11은 뇨내 MK 농도(U-MK)와 뇨내 크레아티닌(Cr) 함량의 변동(ΔCr)을 나타낸다. ●; AKI군의 뇨내 MK 농도, ○; non-AKI군의 뇨내 MK 농도이다. ◆; AKI군의 뇨내 Cr의 변동량(%), ◇; non-AKI군의 뇨내 Cr의 변동량(%).
도 12는 뇨내 β2 마이크로글로불린의 농도 변동을 나타낸다. 뇨내 β2 마이크로글로불린으로는 수술 후 발병될 급성 신장 장해(AKI)를 수술 중에 예측할 수 없었다.
도 13은 뇨내 NAG 농도 변동을 나타낸다. 뇨내 NAG로는 수술 후 발병될 급성 신장 장해(AKI)를 수술 중에 예측할 수 없었다.
도 14는 뇨내 시스타틴 C 농도 변동을 나타낸다. 뇨내 시스타틴 C로는 수술 후 발병될 급성 신장 장해(AKI)를 수술 중에 예측할 수 없었다.
도 15는 각종 바이오마커의 농도 변동을 나타낸다. 뇨내 MK(U-MK)와 기존의 바이오마커의 농도의 변동을 비교하였다. 뇨내 MK 농도(U-MK)는, 뇨내 IL-18 농도(U-IL18) 및 뇨내 NGAL 농도(U-NGAL)에 비해, 현저히 빠른 시기에 상승한다.
도 16은 인공 심폐를 사용한 심장 판막 치환술을 시행한 증례에서의 뇨내 미드카인(MK) 농도의 추이를 나타낸 표이다.
도 17은 실험(신장 이식 후의 이식 신장의 신장 기능과 뇨내 미드카인(MK) 농도의 관계)의 프로토콜이다.
도 18은 신장 이식 후 혈청 크레아티닌 농도와 뇨내 미드카인(MK) 농도의 측정 결과를 나타낸 표이다. 상단의 표에 혈청 크레아티닌 함량의 추이와 첫 뇨내의 MK 농도를 나타낸다. 하단의 표에는 이식 수술 후 뇨내 MK 농도의 추이를 나타낸다. PGF: prompt graft function, DGF: delayed graft function.
도 19는 실험 프로토콜(조영제에 의한 신장 장해와 뇨내 미드카인(MK) 농도의 관계)을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 20은 실험 프로토콜(표재성 조기 신장암에 대한 신장 부분 절제술 시술 예와 뇨내 미드카인(MK) 농도와의 관계)을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 21은 실험 프로토콜(표재성 조기 신장암에 대한 신장 부분 절제술 시술 예와 뇨내 미드카인(MK) 농도와의 관계)을 개략적으로 나타낸 것이다.
도 22는 AKI가 아닌 환자의 병에 걸린 신장 유래 뇨(신우의 뇨)의 MK 농도 변화(좌측)와 방광뇨의 MK 농도 변화(우측)를 나타내는 그래프이다.
도 23은 AKI 환자의 병에 걸린 신장 유래 뇨(신우뇨)의 MK 농도 변화(좌측)와 방광뇨의 MK 농도 변화(우측)를 나타내는 그래프이다.
도 24는 AKI 환자의 병에 걸린 신장 유래 뇨(신우뇨)의 MK 농도 변화(좌측)와 방광뇨의 MK 농도 변화(우측)를 나타내는 그래프이다.
도 25는 중증인 사례의 뇨내 MK 농도 변화를 나타낸 표이다.
도 26은 MTX에 의한 화학요법 후 신장 장해 환자의 뇨내 MK 농도 변화를 나타낸 표이다.
도 27은 급성 뇨세관 괴사 환자(ATN)를 조합한 미소 변화형 네프로제 증후군 환자(NCNS)와 조합하지 않는 미소 변화형 네프로제 증후군 환자(MCNS)의 뇨내 MK 농도를 비교한 것이다.
도 28은 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도 관계를 나타내는 그래프이다. ATN군과 그 이외의 신장 질환군(515) 예에서, 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도를 측정하고, 플롯하였다. 피어슨의 적율 상관계수는 0.23(95% 신뢰 구간은 0.15 - 0.31, p< 0.001)이다.
도 29는 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도 관계를 나타내는 그래프이다. 복부 대동맥류 치환술을 시술받은 환자의 뇨내 MK 농도와 혈장중 MK 농도를 측정하고, 플롯하였다.
도 30은 MK 친화성 크로마토그래피의 원리(좌측)와 결과(우측)를 나타낸다. MK 결합 단백질로 예상되는 밴드를 X로 나타낸다. X'는 X의 단편인 것으로 예상된다.
도 31은 아밀로이드 신장 합병증을 가진 만성 관절 류머티즘 환자에게 헤파린을 투여했을 때의 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도를 비교한 것이다. 헤파린 투여로 혈장내 MK 농도는 상승하지만, 그 결과 뇨내 MK 농도가 상승하지는 않는다.
도 32는 혈장내 MK 농도가 높은 것이 뇨내 MK 농도와 무관함을 나타내는 증례를 나타낸다. 증례 1(대조군), 선택성이 상이한 네프로제 증후군으로 이루어진 증례 2-5에서는, 혈장내 MK 농도가 높았지만 뇨내 MK 농도는 측정 민감도 이하였다. 역으로, 증례 6-9의 ATN에서는, 혈장내 MK 농도의 여하에 관계없이 뇨내 MK 농도가 높았다.
1. 급성 신장 장해(AKI)의 조기 검출
본 발명의 제1 측면은 급성 신장 장해의 조기 검출에 관한 것이다. 이러한 측면에서는, 급성 신장 장해 조기 검출용 바이오마커 및 그 용도가 제공된다.
1-1. 급성 신장 장해의 조기 검출용 바이오마커
본 명세서에 있어서, 「급성 신장 장해(이하, 「AKI」라고도 함」) 조기 검출용 바이오마커」는, AKI의 발증 가능성의 지표로 사용되는 생체 분자를 말한다. 「AKI」란, 급속하게 신장 기능이 저하되는 병적 상태를 총칭한다. 따라서, 「AKI」에는, 신전성 신장해, 신성 신장해(급성 뇨세관 괴사(ATN), 뇨세관간질성 신장염, 사구체신염 등) 및 신후성 신장해가 포함된다. 사구체 질환이나 요로 감염증은, 이차적으로 급성 뇨세관 장해를 초래하지 않는 한, 「AKI」에 포함되지 않는 것으로 한다. 따라서, 이차적으로 급성 뇨세관 장해를 초래하는 경우에는, 사구체 질환이나 요로 감염증도 본 발명의 적용 대상이 된다.
좁은 의미의 AKI는 신전성 신장해, 즉, 일차적으로 급성 뇨세관 장해를 초래하는 병적 상태인 ATN를 가리킨다. 본 발명은, 좁은 의미의 AKI를 조기 검출하는데 특히 유용하다. ATN에는 허혈성 AKI, 중독성 AKI 또는 패혈증성 AKI가 포함된다. 허혈성 AKI의 예로서는, 복부 대동맥류 치환술 등의 대혈관 수술, 심장 판막 치환술 등 인공 심폐 장치를 사용하는 개심술, 장기 이식술, 또는 신장 종양 부분 신장 절제술 등의 수술 후 발병하는 AKI, 울혈성 심부전, 조영제 투여(예를 들면, 협심증이나 심근경색 등을 대상으로 조영제 검사시), 간신부전 증후군 또는 혈전성 미소 혈관 장해에 의해 초래되는 AKI, 칼시네우린 저해제, 안지오텐신 변환 효소 저해제·안지오텐신 II 수용체 길항제·비스테로이드성 소염 진통제 등의 약제로 인한 AKI를 들 수 있지만, 이에 한정되지 않는다. 한편, 중독성 AKI의 예로서는, 외인성 인자로서 항균제, 항암제 등의 약제, 내인성 인자로서 헴 색소(헤모글로빈뇨·미오글로빈뇨), 다발성 골수종 등의 비정상적인 단백질, 요산·메토트렉세이트 등의 결정 성분 등으로 인한 AKI가 포함된다.
본 발명의 바이오마커는 미드카인(MK)으로 구성된다. MK는, 레티노인산반응 유전자의 산물로서 발견된 증식 분화 인자로서, 알칼리성 아미노산과 시스테인이 풍부한 분자량 13kDa의 폴리펩티드로 이루어져있다(Kadomatsu, K. et al. : Biochem. Biophys. Res. Commun., (151): 1312-1318; Tomomura, M. et al. : J. Biol. Chem., (265): 10765-10770, (1990)). MK는 세포 증식, 세포주화성, 혈관 신생, 염증 유도, 섬유소용해 등 다양한 활성을 가진다. 또한, 혈청 MK 레벨이 종양 마커로서 유망한 것으로 시사되어 있다(Ikematsu. S et al., Br.J.Cancer. (2000);(83): 701-706.).
공공의 데이터베이스에 등록되어 있는, MK의 아미노산 서열(GenBank, ACCESSION: NP_(001012333), DEFINITION: midkine &Homo sapiens)을 서열목록에 서열번호 1로 나타낸다. 그리고, 생체내 존재하는 MK가 아닌, 생체로부터 채취된(즉, 분리된) 검체내 MK가 본 발명의 바이오마커로서 이용된다.
1-2.급성 신장 장해(AKI)의 검사방법
본 발명은 또한, 본 발명의 바이오마커의 용도 중 하나로서 AKI 검사방법을 제공한다. 본 발명의 검사방법은, AKI의 발증 가능성을 판정(발증의 조기 예측)하는데 이용된다. 바람직하게는, 좁은 의미의 AKI, 즉 급성 뇨세관 괴사(ATN)의 발증 가능성을 판정하는데 이용된다. 본 발명의 검사방법은, 허혈성 AKI, 중독성 AKI 및 패혈증성 AKI의 발증 가능성 판정에 유용하다.
본 발명의 검사방법을 입원시 또는 집중 치료실(ICU) 입실시에 행할 수 있다. 미소 변화군(minimal change)이 AKI로 진행되는지 여부를 판정하기 위해, 본 발명의 검사방법을 수행할 수도 있다. 그리고, 네프로제 증후군의 최대 원인인 「미소 변화군(minimal change」은 10 내지 20%가 빈뇨 급성 신부전인 것으로 알려져 있다.
본 발명의 검사방법에서는 뇨내 MK 함량을 판정 지표로 사용한다. 구체적으로는, 본 발명의 검사방법에서는 다음 단계 (1) 및 (2)를 실시한다.
(1) 뇨내 MK를 검출하는 단계;
(2) 검출 결과에 따라, AKI의 발증 가능성을 판정하는 단계.
단계 (1)
단계 (1)에서는, 피검사자로부터 채취한 뇨 검체를 준비하고, 여기에 존재하는 MK(뇨내 MK)를 검출한다. 본 명세서에 있어서 「뇨내 MK를 검출한다」란, 뇨내 MK 양을 측정하는 일과 동일한 의미이다. 엄밀한 정량은 필수가 아니며, 반정량적으로 뇨내 MK 양을 측정할 수도 있다. 예를 들면, 뇨내 MK 양이 소정의 기준량을 초과하는지 여부를 판별가능하도록 검출을 실시한다.
뇨내 MK 검출 방법은, 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 면역학적 방법을 이용한다. 면역학적 방법에 의하면 신속하고 또한 고민감도로 뇨내 MK 농도를 측정할 수 있다. 또한, 조작도 간편하다. 면역학적 방법에 따른 뇨내 MK 농도 측정에서는, MK에 대해 특이적 결합성을 가지는 물질이 사용된다. 상기 물질로서는 통상적적으로 항-MK 항체가 사용되지만, MK에 대해 특이적인 결합성을 가지고 그 결합량을 측정가능한 물질이라면 항-MK 항체로 한정하지 않고 사용할 수 있다.
측정법으로서 라텍스 응집법, 형광 면역 측정법(FIA법), 효소 면역 측정법(EIA법), 방사 면역 측정법(RIA법), 웨스턴 블로팅법을 예시할 수 있다. 바람직한 측정법으로서는, FIA법 및 EIA법(ELISA법을 포함함)을 들 수 있다. 이들 방법에 의하면, 고민감도로, 신속하게, 또한, 간편하게 검출할 수 있다. FIA법에서는 형광 표지된 항체를 사용하고, 형광을 시그널로서 항원-항체 복합체(면역 복합체)를 검출한다. 한편, EIA법에서는 효소 표지된 항체를 사용하고, 효소 반응에 근거한 발색 내지 발광을 시그널로서 면역 복합체를 검출한다.
MK의 측정에서, 우수한 EIA법(일본 특허출원 공개번호 평 (10-160735)호 공보를 참조) 및 ELISA법(S. Ikematsu, et al. Br. J. Cancer(2000);(83))이 개발되어 있어, 상기 방법 또는 상기 방법에 준하는 방법으로 측정할 수 있다. 당업자라면, 검출 목적에 맞게, 조건이나 단계 일부를 쉽게 개량할 수 있다. ELISA법은 검출 민감도가 높고, 특이성이 높고, 정량성이 우수하며, 조작이 간편하고, 복수의 검체를 동시 처리할 때 적절한 등의 많은 이점을 가진다. ELISA법을 이용하는 경우에 대한 구체적인 조작법의 일례를 이하에 나타낸다. 먼저, 항-MK 항체를 불용성 지지체에 고정한다. 구체적으로, 예를 들면, 마이크로플레이트의 표면을 항-MK 항체로 감작(코팅)한다. 이와 같이 고상화한 항체에 뇨 검체를 접촉시킨다. 이러한 조작으로, 고상화한 항-MK 항체에 대한 항원(MK)이 뇨 검체 중에 존재하면, 면역 복합체가 형성된다. 세정 조작에 의해 비특이적 결합 성분을 제거한 후, 효소를 결합시킨 항체를 첨가함으로써 면역 복합체를 표지하고, 이어서 효소의 기질을 반응시켜 발색시킨다. 그리고, 발색량을 지표로 하여 면역 복합체를 검출한다. 그리고, ELISA법의 상세한 내용은 수많은 테스트북이나 논문에 기재되어 있어, 각 방법의 실험 단계나 실험 조건을 설정할 때는 이것을 참고할 수 있다. 그리고, 비경쟁적인 방법으로 한정되지 않으며, 경쟁적 방법(검체와 함께 항원을 첨가하여 경쟁시키는 방법)을 사용할 수도 있다.
검체 중의 MK를 표지화 항체로 직접 검출하는 방법을 사용할 수도, 또는 샌드위치 방법을 사용할 수도 있다. 샌드위치 방법에서는, 에피토프의 상이한 2종의 항체(포착용 항체 및 검출용 항체)가 사용된다.
뇨 검체를 채취하는 시기(타이밍)는 특별히 한정되지 않지만, AKI가 발병되는 환자의 경우 수술 후 매우 빠른 단계에서 뇨내 MK 양이 상승한다는 사실을 감안하여, 복부 대동맥류 치환술, 심장 판막 치환술, 장기 이식술 또는 신장 종양 부분 신장 절제술 등의 수술 후에 생길 수 있는 허혈성 AKI의 발증 가능성을 판정하는 경우, 바람직하게는, 허혈 상태를 일으키는 시술을 수행한 때부터 수술 후 1일까지 채취한 뇨를 검체로서 단계 (1)을 실시하고, 보다 바람직하게는, 허혈 상태를 일으키는 시술을 수행한 때부터 수술 종료시까지 채취한 뇨를 검체로서 단계 (1)을 실시하고, 가장 바람직하게는, 허혈 상태를 일으키는 시술을 수행한 때부터 3시간 이내(수술 중, 수술 후 중 어느 한 시기)에 채취한 뇨를 사용하여 단계 (1)을 실시한다. 이와 같이 조기에 채취한 뇨 검체를 사용함으로써, AKI의 발증을 조기에 예측할 수 있다. 이때, 「허혈 상태를 일으키는 시술」이란, 혈관의 클램프나 인공 심폐 조작 등이 해당한다. 구체적인 예로, 복부 대동맥류 시술의 경우에는, 대동맥 차단이 「허혈 상태를 일으키는 시술」에 해당된다. 또한, 「수술 종료시」란, 봉합·폐복이 행해지는 시기를 말한다.
협심증이나 심근경색 등을 대상으로 하여 조영제 검사를 실시한 후의 AKI의 발증 가능성을 판정하는 경우, 예를 들면, 조영제 검사 실시 후 4시간 이내(조영제 주입 시기를 기준 0시로 함), 바람직하게는 조영제 검사 실시 후 2시간 이내에 채취한 뇨를 검체한다. 또한, 약제 투여 후에 발생되는 AKI의 발증 가능성을 판정하는 경우, 예를 들면, 약제 투여 후 4시간 이내, 바람직하게는 약제 투여 후 2시간 이내에 채취한 뇨를 검체로 한다. 신장 장해 환자(예를 들면, 미소 변화군의 환자)를 대상으로 하는 경우에는, 예를 들면, 외래 진찰시, 입원시, 신장 생검시 등에 채취한 뇨를 검체로 한다.
본 발명의 일 구현예에서는, 뇨내 MK 뿐만이 아니라, AKI의 지표가 되는 다른 바이오마커도 검출하고, 양자의 검출 결과를 AKI의 발증 가능성 판정에 사용한다. 즉, 이러한 구현예에서, 단계 (1)에 더하여 이하의 단계 (1')도 실시하고, 단계 (2)에서는 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, AKI의 발증 가능성을 판정한다.
(1') 뇨내 NGAL, 뇨내 IL-18, 뇨내 KIM-1, NAG 및 뇨내 L-FABP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
이러한 구현예에서, 상이한 2종 이상의 지표를 이용하여 판정하여 적중률 및/또는 신뢰성이 보다 우수한 검사 결과를 얻을 수 있다. 각 바이오마커(MK를 포함)의 변동에는 각각 고유 특성이 있으므로, 복수개의 바이오마커를 조합함으로써, AKI의 발증 가능성의 적중률이나 신뢰성을 높일 수 있다. 또한, 예후 추정, 급성 뇨세관 괴사(ATN)와 신장염·신부전의 감별 등에 유익한 정보도 수득된다.
적중률 및/또는 신뢰성을 높인다는 관점에서, 원칙적으로, 단계 (1')의 검출 대상이 되는 바이오마커의 수는 많은 것이 좋다. 그래서, 바람직하게는 단계 (1')에서, 2개 이상의 바이오마커를 검출 대상(예를 들면, NGAL 및 IL-18 둘다)으로 한다.
단계 (1')에서, 각 바이오마커의 측정 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, MK를 측정하는 경우와 마찬가지로, 면역학적 측정법을 사용할 수 있다. 각 바이오마커의 측정은 표준 방법 또는 기존의 방법에 준할 수 있다. 예를 들면, 비특허 문헌 (1)에는 NGAL 측정법(웨스턴 블로팅 방법 및 ELISA 방법)이 설명되어 있다. 비특허 문헌 (2)에는 NGAL 측정법(ELISA 방법) 및 IL-18 측정법(ELISA 방법)이 설명되어 있다. 비특허 문헌 (3)에는 KIM-1 측정법(웨스턴 블로팅 방법 및 ELISA 방법)이 설명되어 있다. 비특허 문헌 (4) 및 (5)에는 L-FABP 측정법(ELISA 방법)이 설명되어 있다.
이러한 바이오마커를 측정하는 경우, 뇨 검체를 채취하는 시기(타이밍)는 특별히 한정되지 않는다. 기존 보고를 고려하거나 또는 예비 실험의 결과에 따라, 뇨 검체의 채취하는 시기를 적당히 설정하면 된다.
단계 (2)
단계 (2)에서, 단계 (1)의 검출 결과(단계 (1')도 실시하는 경우에는, 단계 (1) 및 (1') 검출 결과)에 따라, AKI의 발증 가능성을 판정한다. 발증 가능성의 판정은 정성적, 정량적 중 어느 것일 수 있다. 정성적 판정과 정량적 판정의 예를 이하에 나타낸다. 그리고, 여기서 판정은, 그 판정 기준으로부터 명확하고, 의사나 검사 기사 등 전문 지식을 가진 사람의 판단에 의하지 않고도 자동적/기계적으로 행할 수 있다.
(정성적 판정의 예 1)
기준값보다 측정값(MK 양)이 높을 때에는 「발증 가능성이 높은」 것으로 판정하고, 기준값보다 측정값이 낮을 때에는 「발증 가능성이 낮다」고 판정한다.
(정성적 판정의 예 2)
반응성이 인정된 (양성인) 경우에는 「발증 가능성이 높은」것으로 판정하고, 반응성이 인정되지 않을 (음성인) 경우에는 「발증 가능성이 낮다」고 판정한다.
(정량적 판정의 예)
이하에 나타낸 바와 같이, 측정값 범위마다 발증 가능성(%)을 미리 정해 두고, 측정값으로부터 발증 가능성(%)을 판정한다.
측정값 a∼b: 발증 가능성은 10% 이하
측정값 b∼c: 발증 가능성은 10%∼30%
측정값 c∼d: 발증 가능성은 30%∼50%
측정값 d∼e: 발증 가능성은 50%∼70%
측정값 e∼f: 발증 가능성은 70%∼90%
MK 외에도, 다른 바이오마커(뇨내 NGAL, 뇨내 IL-18, 뇨내 KIM-1, 뇨내 NAG 및 뇨내 L-FABP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커)도 이용하는 경우, 판정 방법의 일례를 나타낸다. 먼저 MK의 검출 결과에 따라 발증 가능성을 판정하고, 발증 가능성이 높은 것으로 판정 결과가 나오면 다른 바이오마커의 검출을 추가로 실시하고, 다른 바이오마커의 검출 결과에 따라 발증 가능성을 최종적으로 판정한다. 이러한 예에서, MK의 검출 결과는 1차 판정에 이용하고, 다른 바이오마커의 검출 결과는 최종 판정에 이용하는 판정 방법을 사용한다. 이와는 반대로, 다른 바이오마커의 검출 결과를 1차 판정에 이용하고, MK의 검출 결과를 최종 판정에 이용할 수도 있다.
1-3. 급성 신장 장해(AKI)검사용 시약 및 키트
또한, 본 발명은 AKI 검사용 시약과 키트를 제공한다. 본 발명의 시약은 항-MK 항체를 포함한다. 항-MK 항체는, MK에 대한 특이적 결합성을 가지고 있는 한, 그 종류나 유래 등은 특별히 한정되지 않는다. 또한, 폴리클론 항체, 올리고클론 항체(수 종 내지 수십 종의 항체들의 혼합물), 및 단일클론 항체 중 어느 하나일 수도 있다. 폴리클론 항체 또는 올리고클론 항체로서는, 동물 면역화하여 수득하는 항혈청 유래의 IgG 분획 외에도, 항원에 의해 친화성 정제한 항체도 사용할 수 있다. 항-MK 항체는 Fab, Fab', F(ab')2, scFv, dsFv 항체 등의 항체 단편일 수도 있다.
항-MK 항체는, 면역학적 방법, 파지 디스플레이 방법, 리보솜 디스플레이 방법 등을 이용하여 제조할 수 있다. 면역학적 방법에 의한 폴리클론 항체의 제조는 하기 단계로 행할 수 있다. 항원(MK 또는 그 일부)을 제조하고, 이것을 사용하여 토끼 등의 동물에 면역화를 수행한다. 생체 시료를 정제함으로써 항원을 얻을 수 있다. 또한, 재조합형 항원을 사용할 수도 있다. 재조합형 MK는, 예를 들면, MK를 코딩하는 유전자(유전자의 일부일 수도 있음)를, 벡터를 이용하여 적당한 숙주에 도입하고, 얻어진 재조합 세포에서 발현시킴으로써, 제조할 수 있다.
면역 야기 작용을 증강시키기 위해, 캐리어 단백질을 결합시킨 항원을 사용할 수도 있다. 캐리어 단백질로서는, KLH(Keyhole Limpet Hemocyanin), BSA(Bovine Serum Albumin), OVA(Ovalbumin) 등이 사용된다. 캐리어 단백질의 결합에는, 카르보디이미드 방법, 글루타르알데하이드 방법, 디아조 축합법, MBS(말레이미도벤조일옥시 숙신이미드) 방법 등을 사용할 수 있다. 한편, CD46(또는 그 일부)을, GST, β-갈락토시다제, 말토스 결합 단백 또는 히스티딘(His) 태그 등과의 융합 단백질로서 발현시킨 항원을 사용할 수도 있다. 이와 같은 융합 단백질은 범용적인 방법에 의해 간편하게 정제할 수 있다.
필요에 따라, 면역화를 반복하고, 충분히 항체가가 증가된 시점에 채혈한 다음 원심분리 등에 의해 혈청을 수득한다. 수득된 항-혈청은 친화성으로 정제하여, 폴리클론 항체로 사용한다.
한편, 단일클론 항체는 하기 단계로 제조할 수 있다. 먼저, 상기와 동일한 단계로 면역 조작을 수행한다. 필요에 따라, 면역화를 반복하여, 충분히 항체가가 증가된 시점에 면역 동물로부터 항체를 생산하는 세포를 추출한다. 그런 후, 수득되는 항체 생산 세포를 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마를 얻는다. 이어서, 이 하이브리도마 세포를 단일클론으로 하고, 목적 단백질에 대해 특이성이 높은 항체를 생산하는 클론을 선택한다. 선택된 클론의 배양액을 정제함으로써 목적 항체를 수득할 수 있다. 한편, 하이브리도마 세포를 원하는 수 이상으로 증식시킨 후, 이를 동물(예를 들면, 마우스)의 복강 내에 이식하고, 복수에서 증식시켜, 복수를 정제함으로써, 목적 항체를 취득할 수도 있다. 상기 배양액의 정제 또는 복수의 정제에는, 단백질 G, 단백질 A 등을 사용한 친화성 크로마토그래피가 바람직하게 사용된다. 또한, 항원을 고상화한 친화성 크로마토그래피를 사용할 수도 있다. 또한, 이온 교환 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 암모늄 설페이트 분획화 및 원심분리 등의 방법을 이용할 수도 있다. 이러한 방법들은 단독으로 또는 임의로 조합하여 사용할 수도 있다.
MK에 대한 특이적 결합성을 유지하는 것을 조건으로 하여, 얻어진 항체에 여러가지 변형을 가할 수 있다. 이와 같이 변형시킨 항체는 본 발명의 시약일 수 있다.
항-MK 항체로서 표지된 항체를 사용하면, 표지량을 지표로서 사용하여 결합된 항체 양을 직접 검출할 수 있다. 따라서, 보다 간편한 검사방법을 구축할 수 있다. 그러나, 표지 물질이 결합된 항-MK 항체를 준비하여야할 뿐만 아니라, 검출 민감도가 일반적으로 낮아지는 문제점이 있다. 그래서, 표지 물질이 결합된 2차 항체를 이용하는 방법, 2차 항체와 표지 물질을 결합시킨 폴리머를 이용하는 방법 등의 간접 검출 방법을 이용하는 것이 바람직하다. 여기서, 2차 항체는 항-MK 항체에 대해 특이적인 결합성을 가진 항체로서, 예컨대 토끼 항체로서 항-MK 항체를 제조하는 경우에는 항-토끼 IgG 항체를 사용할 수 있다. 토끼나 염소, 마우스 등 다양한 종으로부터 유래된 항체에 사용할 수 있는 표지 2차 항체가 시판되어 있으므로(예, Funakoshi Corporation, COSMO BIO Co., Ltd.), 본 발명의 시약에 따라 적절한 것을 적절하게 선택하여 사용할 수 있다.
표지 물질의 예로는, 퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제, 서양고추냉이의 퍼옥시다제(HRP), 알칼리 포스파타제, β-D-갈락토시다제, 글루코스옥시다제 및 글루코스-6-포스페이트 탈수소효소 등의 효소, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 테트라메틸로다민 이소티오시아네이트(TRITC) 및 유로피움 등의 형광 물질, 루미놀, 이소루미놀 및 아크리디늄 유도체 등의 화학 발광 물질, NAD 등의 조효소, 바이오틴, 및 131I 및 125I 등의 방사성 물질이 있다.
일 구현예에서, 본 발명의 시약은 그 용도에 따라 고상화시킬 수 있다. 고상화에 사용되는 불용성 지지체는 특별히 한정되지 않는다. 예를 들면, 폴리스티렌 수지, 폴리카보네이트 수지, 실리콘 수지, 나일론 수지 등의 수지나, 유리 등의 물에 불용성인 물질로 이루어진 불용성 지지체를 사용할 수 있다. 불용성 지지체에 항체의 담지는 물리 흡착 또는 화학 흡착에 의해 행할 수 있다.
본 발명의 키트는 주요 구성 요소로서 본 발명의 시약을 포함한다. 검사방법을 실시할 때 사용되는 그 외 시약(완충액, 블록킹용 시약, 효소의 기질, 발색 시약 등) 및/또는 장치 내지 기구(용기, 반응 장치, 형광 리더 등)가 키트에 포함될 수 있다. 또한, 표준 시료로서 MK를 키트에 포함시키는 것이 바람직하다. 또한, MK 이외의 바이오마커(뇨내 NGAL, 뇨내 IL-18, 뇨내 KIM-1, 뇨내 NAG 및 뇨내 L-FABP으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커)를 검출하기 위한 시약이나 상기 시약을 사용할 때 필요한 다른 시약, 기구 등이 키트에 포함될 수 있다. 그리고, 통상적으로, 본 발명의 키트에는 취급 설명서가 첨부된다.
2. 신장 기능의 예후 추정
본 발명의 제2 측면은 신장 기능의 예후 추정에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 신장 기능의 예후를 추정하기 위한 바이오마커 및 그 용도가 제공된다. 이하, 이러하 측면에 대해 상세하게 설명하지만, 제1 측면과 공통되는 내용은 제1 측면의 설명을 원용한다.
2-1. 신장 기능의 예후를 추정하기 위한 바이오마커
본 명세서에 있어서, 「신장 기능의 예후를 추정하기 위한 바이오마커」란, 신장 기능의 예후 추정에 지표가 되는 생체 분자를 말한다. 「신장 기능의 예후」란 신장 기능의 향후 상태를 의미하며, 신장 기능 장해를 일으킬 수 있는 상황을 겪은 환자의 향후 신장 기능 상태와, 신장 기능 장해를 가진 환자의 향후 신장 기능 상태를 포괄한다. 「신장 기능 장해를 일으킬 수 있는 상황」에는, 허혈성 AKI, 중독성 AKI 및 패혈증성 AKI 모두가 포함된다. 허혈성 AKI의 예로서는, 복부 대동맥류 치환술 등의 대혈관 수술, 심장 판막 치환술 등 인공 심폐 장치를 사용하는 개심술, 장기 이식술, 또는 신장 종양 부분 신장 절제술 등의 수술 후에 발병하는 AKI, 울혈성 심부전, 조영제 투여(예를 들면, 협심증이나 심근경색 등을 대상으로 한 조영제 검사시), 간신장 증후군 또는 혈전성 미소 혈관 장해로 인해 발병하는 AKI, 칼시뉴린 저해제, 안지오텐신 변환 효소 저해제 · 안지오텐신 II 수용체 길항제 · 비스테로이드성 소염 진통제 등의 약제에 의하는 AKI를 들 수 있지만, 이들로 한정되는 것은 아니다. 한편, 중독성 AKI의 예로서는, 외인성 인자로서 항균제, 항암제 등의 약제, 내인성 인자로서 헴 색소(헤모글로빈뇨·미오글로빈뇨), 다발성 골수종 등의 비정상 단백질, 요산·메토트렉세이트 등의 결정 성분 등으로 인한 AKI를 포함한다.
2-2. 신장 기능의 예후 추정 방법
또한, 본 발명은 본 발명의 바이오마커의 용도 중 하나로서 신장 기능의 예후 추정 방법을 제공한다. 본 발명의 예후 추정 방법에서는, 뇨내 MK 함량을 판정 지표로 사용하여, 뇨내 MK 검출 단계(단계 (1)) 및 검출 결과에 따른 예후 추정 단계(단계 (2))을 실시한다. 단계 (1)은 제1 측면의 단계 (1)과 동일하므로 설명은 생략한다. 그리고, 병에 걸린 신장으로부터 유래된 뇨 및/또는 건강한 신장으로부터 유래된 뇨가 검체로 사용된다.
계속되는 단계 (2)에서는, 뇨내 MK 함량을 지표로 하여 예후를 추정한다. 예를 들면, 복부 대동맥류 치환술 등의 대혈관 수술, 심장 판막 치환술 등 인공 심폐 장치를 사용하는 개심술, 장기 이식술, 또는 신장 종양 부분 신장 절제술 등의 수술 후의 예후를 추정하는 경우, 하기 기준에 따라 예후를 추정할 수 있다.
(판정 기준)
수술 후 6시간에서 48시간 동안에 관찰되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이면 예후는 양호이고, 수술 후 6시간에서 48시간 동안에 관찰되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이 아니고 높은 수준이 유지되고 지속되면 예후는 불량이다.
그리고, 본 발명에서 예후 추정은, 그 판정 기준으로부터 명확해지며, 의사나 검사 기사 등 전문 지식을 가지는 사람의 판단 없이도 자동적/기계적으로 행할 수 있다.
2-3. 신장 기능에 관한 예후 추정용 시약 및 키트
또한, 본 발명은 신장 기능의 예후를 추정하기 위한 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명의 시약은 항-MK 항체를 포함한다. 항-MK 항체는, 제1 측면의 시약의 경우와 동일하므로 이에 대한 설명은 생략한다. 본 발명의 키트는주요 구성 요소로서 본 발명의 시약을 포함한다. 예후 추정 방법을 실시할 때 사용되는 그 외의 시약(완충액, 블록킹용 시약, 효소의 기질, 발색 시약 등) 및/또는 장치 내지 기구(용기, 반응 장치, 형광 리더 등)을 키트에 포함시킬 수 있다. 또한, 표준 시료로서 MK를 키트에 포함시키는 것이 바람직하다. 그리고, 통상적으로, 본 발명의 키트에는 취급 설명서가 첨부된다.
3. 급성 신장 장해(AKI)의 감별 진단
본 발명의 제3 측면은 AKI의 감별 진단에 관한 것이다. 이러한 측면에서, 급성 신장 장해가 있는 신장을 감별하기 위한 바이오마커 및 그 용도가 제공된다. 이하, 이러한 측면에 대해 상세하게 설명하지만, 제1 측면과 공통되는 사항은 제1 측면의 설명을 원용한다.
3-1. 급성 신장 장해를 가진 신장을 감별하기 위한 바이오마커
본 명세서에 있어서 「급성 신장 장해(AKI)를 가진 신장을 감별하기 위한 바이오마커」란, AKI의 감별(AKI의 원인이, 급성 뇨세관 괴사(ATN)으로 대표되는 급성 뇨세관 장해에 의하는 것인지를 판정)에 지표가 되는 생체 분자를 말한다.
3-2. 급성 신장 장해(AKI)의 감별법
본 발명 또한, 본 발명의 바이오마커의 용도 중 하나로서 AKI의 감별법을 제공한다. 본 발명의 감별법에 따르면, AKI의 원인이 급성 뇨세관 괴사(ATN)로 대표되는 급성의 뇨세관 장해에 의한 것인지를 판정할 수 있다. 전형적으로는, AKI의 원인에 대하여, 「ATN이다」 또는 「ATN 이외의 신장 장해이다」라는 판정 결과를 구할 수 있다.
본 발명의 감별법에서는 뇨내 MK 함량을 판정 지표로 사용한다. 구체적으로는, 본 발명의 감별법에서는 하기 단계 (1) 및 (2)를 실시한다.
(1) 뇨내 MK를 검출하는 단계;
(2) 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 원인이 급성의 뇨세관 장해인지를 판정하는 단계.
단계 (1)은 제1 측면의 단계 (1)과 동일하므로, 그 설명은 생략한다.
본 발명의 일 구현예에서, 뇨내 MK 뿐만 아니라, AKI의 지표가 되는 다른 바이오마커도 검출하여, 양자의 검출 결과를 AKI의 감별에 이용한다. 즉, 이러한 구현예에서, 단계 (1)에 추가하여 하기 단계 (1')도 실시하여, 단계 (2)에서 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, AKI의 원인이 급성 뇨세관 장해인지를 판정한다.
(1') 뇨내 NGAL, 뇨내 IL-18, 뇨내 KIM-1, NAG 및 뇨내 L-FABP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
이러한 구현예에 의하면, 상이한 2종 이상의 지표로 판정하게 되어, 적중률 및/또는 신뢰성이 보다 높은 감별 결과를 얻을 수 있다. 각 바이오마커(MK를 포함함)의 변동에는 각각 고유 특성이 있으므로, 복수개의 바이오마커를 조합함으로써, 감별 결과의 적중률이나 신뢰성을 높일 수도 있다. 또한, 예후 추정 등을 위한 유익한 정보도 수득된다.
적중률 및/또는 신뢰성을 높인다는 관점에서, 원칙적으로, 단계 (1')의 검출 대상인 바이오마커의 수는 많을수록 좋다. 그래서, 바람직하게는 단계 (1')에서, 2개 이상의 바이오마커를 검출 대상(예를 들면, NGAL 및 IL-18 둘다)으로 한다.
단계 (1')에서, 각각의 바이오마커의 측정 방법은 특별히 한정되지 않는다. 각 바이오마커의 표준 방법이나 기존 방법 등은 제1 측면에서 설명한 바와 같다.
단계 (2)
단계 (2)에서는, 단계 (1)의 검출 결과(단계 (1')도 실시한 경우에는, 단계 (1) 및 (1') 검출 결과)에 따라, AKI의 원인이 급성 뇨세관 장해인지를 판정한다. 여기에서 판정은 정성적, 정량적 중 어느 것일 수도 있다. 정성적 판정과 정량적 판정의 예를 이하에 나타낸다. 그리고, 여기서의 판정은, 그 판정 기준으로부터 명확해지며, 의사나 검사 기사 등 전문 지식을 가진 사람의 판단없이도 자동적/기계적으로 행할 수 있다.
(정성적 판정의 예 1)
기준값보다 측정값(MK 함량)이 높을 때 「ATN이다」 또는 「ATN일 가능성이 높다」고 판정하고, 기준값보다 측정값이 낮을 때 「ATN이 아니다」 또는 「ATN이 아닐 가능성이 높다」고 판정한다. 기준값보다 측정값이 낮을 때 「ATN 이외의 신장 장해이다」 또는 「ATN 이외의 신장 장해일 가능성이 높다」라고 판정할 수도 있다.
(정성적 판정의 예 2)
반응성이 관찰되었을 때(양성)에는 「ATN이다」 또는 「ATN일 가능성이 높다」고 판정하고, 반응성이 관찰되지 않았을 때(음성)에는 「ATN이 아니다」 또는 「ATN이 아닐 가능성이 높다」, 또는 「ATN 이외의 신장 장해이다」 또는 「ATN 이외의 신장 장해일 가능성이 높다」고 판정한다.
(정량적 판정의 예)
이하에 나타낸 바와 같이, 측정값 범위에 따라 「ATN 가능성(%)」을 미리 정해 두고, 측정값을 토대로 「ATN 가능성(%)」을 판정한다.
측정값 a∼b: ATN일 가능성은 10% 이하
측정값 b∼c: ATN일 가능성은 10%∼30%
측정값 c∼d: ATN일 가능성은 30%∼50%
측정값 d∼e: ATN일 가능성은 50%∼70%
측정값 e∼f: ATN일 가능성은 70%∼90%
MK에 뿐만 아니라, 다른 바이오마커(뇨내 NGAL, 뇨내 IL-18, 뇨내 KIM-1, 뇨내 NAG 및 뇨내 L-FABP로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커)도 이용하는 경우에 대한 일 예의 판정 방법은, 먼저 MK의 검출 결과에 따라 ATN일 가능성을 판정하고, ATN일 가능성이 높은 것으로 판정 결과가 나오면 다른 바이오마커의 검출을 추가로 실시하고, 그리고, 다른 바이오마커의 검출 결과에 따라, ATN일 가능성에 대한 최종적인 판정을 내린다. 이러한 예에서, MK의 검출 결과는 1차적인 감별로 이용하고, 다른 바이오마커의 검출 결과는 최종 감별로 이용하는, 판정 방법을 채택한다. 반대로, 다른 바이오마커의 검출 결과를 1차적인 감별로 이용하고, MK의 검출 결과를 최종 감별에 이용할 수도 있다.
2개 이상의 바이오마커를 조합 사용하는 경우, 하기 (1) 또는 (2)의 판정 방법을 사용할 수 있다.
(1) 조합에 포함된 바이오마커 모두에 대해 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정하고, 그 외의 경우를 음성으로 판정한다.
(2) 조합에 포함된 바이오마커 중 어느 하나라도 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정하고, 그 그외 경우를 음성으로 판정한다.
본 발명자들의 검토 결과, 조합하는 바이오마커의 종류 및 수에 따라, 진단 민감도 및 진단 특이도가 상이한 것으로 확인되었다(하기 실시예 참조). 따라서, 목적에 따라 최적의 바이오마커 조합을 선택할 수 있다. 예를 들면, 진단 민감도가 높은 조합은 스크리닝 검사에 적합하다. 반대로, 진단 특이성이 높은 조합은, 보다 신뢰성이 높은 판정이 필요한 검사(예를 들면, 2차 검사나 3차 검사)에 적합하다.
진단 민감도와 진단 특이도의 밸런스가 상이한 판정법을 조합함으로써, 효율화나 정확도 내지 신뢰성의 향상을 도모할 수 있다. 예를 들면, 높은 진단 민감도를 부여하는 바이오마커 조합을 사용하여 양성 대상을 좁힌 후(1차 검사, 스크리닝 검사), 높은 진단 특이도를 부여하는 바이오마커 조합을 사용하여 최종적인 판정을 행한다(2차 검사). 이와 같은 2 단계의 판정으로 한정되지 않으며, 3 단계 이상의 판정을 행할 수도 있다.
바이오마커 조합의 예를 나타내면, MK와 NAG의 병용, MK와 IL-18의 병용, MK와 NGAL의 병용, MK와 NAG와 IL-18의 병용, MK와 NAG와 NGAL의 병용, MK, IL-18 및 NGAL의 병용, 및 MK, NAG, IL-18 및 NGAL의 병용이다. 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, MK와 NGAL의 병용(이 경우에는 민감도와 특이도의 밸런스가 좋은 결과로 수득됨)을 제외하고는, 이들 병용에 의해 진단 특이도의 향상을 기대할 수 있다.
3-3. 급성 신장 장해(AKI) 감별용 시약 및 키트
본 발명은 또한, AKI 감별용 시약 및 키트를 제공한다. 본 발명의 시약은 항-MK 항체를 포함한다. 항-MK 항체는 제1 측면의 시약의 경우와 동일하므로 그 설명은 생략한다. 본 발명의 키트는 주요 구성 요소로서 본 발명의 시약을 포함한다. 감별법을 실시할 때 사용되는 그 외의 시약(완충액, 블록킹용 시약, 효소의 기질, 발색 시약 등) 및/또는 장치 내지 기구(용기, 반응 장치, 형광 리더 등)를 키트에 포함할 수 있다. 또한, 표준 시료로서 MK를 키트에 포함시키는 것이 바람직하다. 그리고, 통상적으로, 본 발명의 키트에는 취급 설명서가 첨부된다.
실시예
1. 각종 신장 질환에서의 뇨내 미드카인(MK)의 농도
(1) 대상
MK는 헤파린 결합성 성장 인자이며, 허혈성 장해시 근처 뇨세관에서의 발현이 증강된다(Sato W. et al., J Immunol. 2001 Sep 15;167(6): 3463-9.). 583건을 대상으로 뇨내 MK 농도와 AKI와의 관련성을 검토하였다. 583건의 내역은, AKI의 주된 원인인 급성 뇨세관 괴사(ATN) 환자 33명, ATN 이외 환자 517명, 정상인 자원자 33명이다.
(2) 방법
서면 동의를 구한 후, 각 대상의 뇨를 채취하여, 뇨내 MK 농도를 측정하였다. 구체적으로는, 뇨 검체(0.01 ml)를 사용하고, 2종의 폴리클론 항-MK 항체(닭 항체, 토끼 항체)에 의한 샌드위치 ELISA에 의해, 뇨내 MK 농도를 측정하였다.
(3) 결과
뇨내 MK 농도의 측정 결과(실측값)를 도 1에 나타낸다. 또한, ROC 곡선(receiver-operating characteristic curve) 분석 결과는 도 2에 나타낸다. 대조군이나 AKI 이외의 신장 장해 환자의 뇨내 MK 농도와 비교하여, AKI의 주된 원인인 급성 뇨세관 괴사(ATN) 환자에서, 뇨내 MK 농도의 유의한 상승이 관찰되었다(도 1). 바이오마커의 민감도 및 특이도 지표인, ROC 곡선의 AUC(area under the curve)는 0.965로, 단일의 바이오마커에서는 볼 수 없는 우수한 결과가 나타났다(도 2). 기존의 뇨내 바이오마커(β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG), 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨18(IL-18))에서는, 뇨내 MK와 같은 AKI 특이적인 농도 변화는 관찰되지 않았다(도 3). 그리고, 도 4(실측값 비교), 도 5(뇨내 크레아티닌(Cr) 보정값 비교) 및 도 6(비교의 정리)에 나타낸 바와 같이, 뇨내 MK 농도의 AUC는, 뇨내 NAG, 뇨내 IL-18, 뇨내 NGAL에 비해 유의하게 높았다. 뇨내 MK 농도의 컷 오프 값을 70 pg/ml으로 설정하면, 뇨내 MK 농도 사용시의 ATN 진단 민감도는 97.0%, 특이도는 90.3%로, 기존의 뇨내 바이오마커(NAG, NGAL, IL-18)를 사용한 경우를 능가하였다.
이상과 같이, 뇨내 MK 농도는 AKI에 대한 민감한 바이오마커이며, 또한 기존의 바이오마커를 뛰어넘는 유용성을 발휘하는 것으로 판명되었다. 즉, AKI 감별 진단에 있어, 뇨내 MK 농도가 가장 우수한 바이오마커라고 할 수 있다.
그런데, 급성 신장 장해의 증례들 상당수는 허혈성 AKI이었지만, 그 외에 패혈증성 AKI(septic AKI), 항암제 투여에 따른 중독성 AKI(toxic AKI), 조영제 신장병(radiocontrast nephropathy)(허혈성 AKI에 포함되는 것도 있음)인 카테고리도 있었다. 이하에 나타낸 바와 같이, 이들 급성 신장 장해에서도 뇨내 MK 농도는 상승하는 것으로 확인되었다.
패혈증성 AKI: 710 pg/ml(38세 여성), 750 pg/ml(75세 남성), 502 pg/ml(74세 남성)
중독성 AKI: 141 pg/ml(13세 여성)
조영제 신장병: 272 pg/ml(41세 남성)
2. 복수의 바이오마커를 조합한 AKI 진단
뇨내 MK 농도와 다른 바이오마커를 조합하여 AKI를 진단하였을 때의 민감도와 특이도를 산출하였다. 각 바이오마커의 값은 Cr 보정값(도 5에 나타낸 ROC 곡선에 대응함)을 사용하였다. 또한, ROC 곡선 분석에 따라, 각 바이오마커의 컷 오프 값은 다음과 같이 설정하였다.
뇨내 MK 농도의 컷 오프치: 75.1 pg/mgCr
뇨내 NAG 농도의 컷 오프치: 31.0 U/gCr
뇨내 IL-18 농도의 컷 오프치: 173.6 pg/mgCr
뇨내 NGAL 농도의 컷 오프치: 26.7 ng/mgCr
각종 조합에 대해 통계 처리하고, 민감도 및 특이도를 비교하였다(도 7의 표). 기호 「＋」로 조합을 표현한 것은 상기 조합에 포함되는 모든 바이오마커가 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정하여, 민감도 및 특이도를 산출하였다. 예를 들면, MK + IL-(18)+ NGAL이면, 뇨내 MK 농도, 뇨내 IL-18 농도 및 뇨내 NGAL 농도 모두가 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정하고, 나머지 경우는 음성으로 판정하였을 때, 민감도(48.5%) 및 특이도(97.8%)를 나타낸다. 한편, 기호 「/」으로 조합을 표현한 것은 상기 조합에 포함되는 바이오마커들 중 임의의 1개에서라도 양성(컷 오프치 이상)인 경우를 양성으로 판정하여, 민감도 및 특이도를 산출한다. 예를 들면, MK / IL-18/ NGAL이면, 뇨내 MK 농도, 뇨내 IL-18 농도 및 뇨내 NGAL 농도 중 1개라도 양성(컷 오프치 이상)이면 양성으로 판정하고, 그 이외의 경우를 음성과 판정하였을 때, 민감도(100%) 및 특이도(53.2%)를 산출한다.
도 7의 표에 나타낸 바와 같이, 조합한 바이오마커의 종류 및 수에 따라 민감도와 특이도의 밸런스가 달랐다. 이는, 목적에 따라 바이오마커의 조합을 선택함으로써, 목적에 일치되는 진단을 행할 수 있음을 의미한다. 일반적으로, 민감도가 높은 조합(예를 들면, MK / NGAL, MK / IL-18/ NGAL, MK / NAG / IL-18/ NGAL)은 스크리닝 검사에 적합하고, 반면에, 특이도가 높은 조합(예를 들면, MK + NAG, MK + IL-18, MK + NAG + IL-18, MK + NAG + NGAL, MK + IL-(18)+ NGAL, MK + NAG + IL-(18)+ NGAL)은 2차 검사나 3차 검사 등, 보다 신뢰성이 높은 판정이 필요한 검사에 적합하다. 예를 들면, 전자를 사용한 검사를 행하여 양성 대상을 좁힌 후, 후자를 사용한 검사를 행하여 최종적인 판정을 하면, 효율적으로, 또한, 신뢰도가 높은 AKI 진단(AKI의 감별)을 행할 수 있다.
3. 복부 대동맥류 수술 후의 급성 신장 장해(AKI)와 뇨내 미드카인(MK) 농도
(1) 대상
2005년 12월부터 2007년 5월까지 나고야 대학 의학부 부속 병원에서 대기적 복부 대동맥류술을 시행하고, 문서로 동의한 하기 32가지 사례를 대상으로, 뇨내 MK 농도와 수술 후 AKI와의 관련성을 조사하였다. 그리고, 환자 배경의 상세내용을 도 8에, 수술전 검사 소견을 도 9에 각각 나타낸다.
성별: 남성 29건, 여성 3건
연령: 72 ± 8 세
질병의 형태: 신장 동맥상 2건, 신장 동맥하 30건
인공 혈관: I형 11건, Y형 21건
추산 GFR: 56.9 ± 21.8 (ml/min/1.73 m2)
(2) 방법
전향적 관찰시험(prospective study)을 실시하였다. 경시적으로 일반 검사와 함께 뇨내 MK 농도를 ELISA(S. Ikematsu, et al. Br. J. Cancer(2000);83)로 측정하였다(도 10 참조). AKI군(ΔCr≥ 50%로 정의됨)과 non-AKI군을 비교 및 평가하였다.
(3) 결과
시험 결과를 도 11에 나타낸다. 수술 후 2일째(POD2), 3일째(POD3)에 피크를 보이는 Cr 상승에서부터, 5건(16%)을 AKI로 진단하였다. AKI군에서는 Cr에 선행하여 뇨내 MK 농도가 실시간으로 상승하였고(Two-way ANOVA군간 차 p = 0.001), 대동맥 차단시부터 수술 후 1일(POD1)까지 높은 수치를 보였다. 특히, 대동맥 차단시부터 수술 종료시(대동맥 차단시부터 약 3)까지 매우 높은 수치가 나타났다(피크는 대동맥 차단시부터 약 1시간까지의 대동맥 개방시였음).
이상의 결과로부터, 수술 중에 뇨내 MK 농도가 상승하는 증례는, 수술 후 AKI가 될 가능성이 극히 높다는 것이 분명해졌다. 환언하면, 뇨내 MK를 마커로 이용하면, 수술 중이라는 극히 조기에 AKI 발증을 예측할 수 있는 것으로 판명되었다. 한편, 기존 마커인 뇨내 NAG, 뇨내 β2 마이크로글로불린(β2 MG), 뇨내 시스타틴 C(Cys-C)와 비교한 결과, 이들 마커에서는 발증 예측을 조기에 할 수 없었다(도 12 - 14). 또한, 급성 신장 장해의 조기 진단 마커로서 보고된 뇨내 IL-18 및 뇨내 NGAL의 농도는, 수술한 후에 상승되는 것으로 확인되었다(도 15). 이와 같이, 기존의 바이오마커(보험 적용되는 것을 포함함)로는, 뇨내 MK 농도를 사용한 경우와 같은 조기 예측이 불가능하다. 그리고, 뇨내 NAG, 뇨내 β2 마이크로글로불린은 외부 기관에서 측정하였다. 또한, 혈청 시스타틴 C, 뇨내 IL-18 및 뇨내 NGAL는 시판 중인 ELISA 측정 키트(뇨내 시스타틴 C는 Mescoat GC 시스타틴 C 키트(금 콜로이드 응집법, Alfresa Pharma Corporation), 뇨내 NGAL은 NGAL ELISA Kit(CircuLex NGAL/Lipocalin-2ELISA Kit/Cat#CY-8070/CircuLex), 뇨내 IL-18은 Human IL-18 ELISA Kit(CODE No 7620, MBL)를 이용하여, 뇨 검체(0.01 ml)로부터 측정하였다.
그리고, 인공 심폐를 사용한 심장 판막 치환술을 시행한 후 AKI가 발병하는 증례에서도, 수술 중에 뇨내 MK 농도의 현저한 상승이 확인되었다(도 16). 이와 같이, AKI의 조기 발증 예측에서의 뇨내 MK의 유용성을 뒷받침는 결과를 수득할 수 있었다.
4 .신장 이식 후의 이식 신장의 신장 기능과 뇨내 미드카인(MK)의 농도
(1) 대상 및 방법
생체 신장 이식을 시술한 2건에서, 도 17의 프로토콜에 나타낸 바와 같이, 이식편(graft)으로 혈류를 재개한(0시간) 후, 최초 배뇨시, 1시간 후, 2시간 후, 6시간 후, 8시간 후 및 그 후 수일간 경시적으로 채뇨하여, 혈중 크레아티닌과 뇨내 MK 농도를 측정하였다.
(2) 결과(도 18)
증례 1은, 이식 후 생착이 양호였고, 다음날부터 혈청 크레아티닌은 순조롭게 회복되었다. 이 증례의 경우, 이식 직후부터 배뇨 개시 후 8시간까지 뇨내 MK는 0 pg/ml이었다. 반면, 증례 2는, 수술 후 이식 신장의 생착이 불량하여, 이식 후 4일째까지 신부전 상태가 나빴다. 이 환자의 뇨내 MK 농도는, 이뇨 개시 직후에는 MK 농도 442 pg/ml로 높았고, 이후 감소하여 4시간 후에는 민감도 보다 낮아졌다.
(3) 고찰
이식 신장의 생착의 양호 또는 불량 여부를, 배뇨 개시 직후의 뇨내 MK 농도 측정에 의해, 예측할 수 있다(급성 신장 장해(AKI)의 초조기진단제). 특히 해외에서는, 시체의 신장 이식 증례가 많고, 수술 후 생착 불량이 지체되는 증례가 많아, 이들 증례에서, 시술 직후부터 생착 불량을 예상하여, 이식한 신장 생착을 위한 치료를 일반적인 프로토콜 보다 적극적인 치료 방법으로 변경하여, 이식된 신장의 생착률을 높일 수 있다.
5. 조영제에 의한 신장 장해와 뇨내 미드카인(MK)의 농도
(1) 대상 및 방법
조영제를 사용하는 검사는, 일상적인 진료에 널리 사용되어 있지만, 조영제에 의한 신장 장해가 임상적으로 크게 문제가 되고 있어, 보다 조기에 진단 가능한 바이오마커의 필요성이 높아지고 있다. 그 중에서도 협심증·심근경색에서의 관동맥 조영·관동맥 재건 방법이 증례 수가 많다. 도 19의 프로토콜에 나타낸 바와 같이, 심장 카테터 검사 직전, 직후, 다음날에, 채혈·채뇨를 행하고, 혈청 크레아티닌, 뇨내 MK 농도, 뇨내 IL-18 농도 및 뇨내 NGAL 농도를 측정하였다.
(2) 결과
만성 신장병 환자에게 조영제를 사용한 직후(혈청 크레아티닌은 7.62 mg/dl)의, 최초 배뇨한 뇨내 MK 농도, 뇨내 IL-18 농도 및 뇨내 NGAL 농도는, 각각 272 pg/ml, 18.69 pg/ml 및 68.88 ng/ml과 같이 높은 수치였다.
(3) 고찰
심장 카테터 검사는, 전세계에서 널리 행해지고 있는 진단적·치료적 전략이다. 검사 직후의 뇨내 MK를 측정함으로써, 조영제 신장 손상(toxic AKI)을 예측할 수 있으며, 검사 후의 예후를 개선시킬 수 있으며, 즉 급성 신장 장해(AKI)의 초조기 진단 마커로서 뇨내 MK 농도가 유용한 것으로 보인다.
6. 표재성 조기 신장암으로 신장 부분 절제술을 시술한 예와 뇨내 미드카인(MK)의 농도
(1) 대상 및 방법
표재성 조기 신장암에 대한 신장 부분 절제술에서는, 신장 암부분을 절제하는 동안 병에 걸린 신장 동맥을 차단하고, 절제한 후 신장 혈류를 재개시킨다. 이 수술에서는, 종양을 부분 절제하는 사이의 대략 30분간 신장 동맥과 신장 정맥이 완전하게 차단되기 때문에, 병에 걸린 신장에 허혈성 신장 손상이 발생하게 된다. 원래 신장은 예비 능력이 높아, 통상적으로 한쪽 신장 전체를 없애더라도, 다른 한쪽의 신장이 이를 보상하기 위해, Cr 상승은 한정적이지만, 일부의 증례에 있어서는, 이 수술에 의한 신장 손상은 지체한다. 이 수술에서, 수술 후 출혈의 관찰이나 뇨량 확인 등을 위해, 병에 걸린 신우내에 카테터를 삽입하여 병에 걸린 쪽의 뇨를 채취하고, 다른 방광에 삽입한 카테터로부터 주로 건강한 신장 유래의 뇨를 채취하는 것이, 기본적인 수술의 처치로 되어 있다. 도 20 및 21에 나타낸 프로토콜에 따라, 수술 전 및 수술 후의 혈액 및 뇨를 채취하여, 뇨내 MK 농도를 조사하였다.
(2) 결과
절제한 신장으로부터 유래한 뇨에서는 2상성의 뇨내 MK 농도 피크가 확인되었는데, 수술 개시 후 1시간 이내에 제1 피크와 수술 후 6시간에서 48시간 사이에 제2 피크가 확인되었다. 제2 피크는, 병에 걸린 신장과 건강한 신장 유래의 뇨에서도 확인되었다. 이것은 병에 걸린 신장에서 발생된 허혈성 손상이 건강한 신장을 포함한 전신 장기까지 확장되어, 양쪽의 신장으로부터 새롭게 단백질 합성이 항진된 MK를 반영하는 것으로 여겨진다. 따라서, 신장 기능이 경미한 증례에서는, 제1 피크 및 제2 피크 모두 일과성 상승을 보였다(도 22). 한편, 신장 기능이 저하되어 있는 고령자나, 만성 신장병 환자에서는 신장 기능 장해가 지체되었다(도 23, 24). 이 경우의 뇨내 MK 농도의 제2 피크는 일과성의 상승에 머무르지 않고, 높은 수치에서 지체 및 지속하였다. 이는, 허혈에 의한 스트레스에 반응하여, HIF-1이라는 전사 인자에 의해 새롭게 MK 단백질의 생산 및 분비가 촉구된 결과인 것으로 생각되었고, 제2 피크가 지체되는 것으로 나타난 증례(증례 2 및 3)에서는, 스트레스가 지속하고 있으며, 즉 신장 장해가 강함을 나타낸다. 이로써, 제2 피크에 주목하면 예후를 추정할 수 있다고 할 수 있다.
(3) 고찰
이상과 같이, 이 질환군에서도 뇨내 MK 농도가 급성 신장 장해의 조기 마커로서 유용한 것으로 나타났다. 또한, 급성 신장 장해의 「조기 진단용 마커」 뿐만 아니라, 「예후 예측 인자로서의 바이오마커」로서도 뇨내 MK 농도가 유용한 것으로 판명되었다.
7. 화학요법 시술 후 또는 네프로제 증후군 시술 후, 신장 장해로의 진행과 뇨내 미드카인(MK) 농도
(1) 대상 및 방법
메토트렉세이트(MTX) 등의 화학요법 시술 후 및 네프로제 증후군 치료 경과 중에, 신장 기능 장해가 진행·지체하는 증례에 대해 뇨내 MK 농도를 측정하였다.
(2) 결과
네프로제 증후군의 치료 경과 중, 신장 기능 장해가 지체되는 기간에, 뇨내 MK 농도는 높은 값으로 지속되었지만(신장 생검 후 7일째 - 9일째; 뇨내 MK 730 - 770 pg/ml), 신장 기능의 개선과 동시에 뇨내 MK 농도는 저하되었다(도 25의 상단). 패혈증성 AKI의 환자에서도 마찬가지의 경향이 확인되었다(도 25의 하단). 또한, 도 26에 나타낸 바와 같이, MTX에 의한 화학요법 후의 신장 장해에서도, 신장 기능 장해가 지속되는 기간(2일째 - 6일째)에, 뇨내 MK 농도는 높은 값으로 지속되었다.
(3) 고찰
전술한 신장 암부분 절제술과 더불어, 화학요법 후의 AKI·네프로제 증후군 등의 1차성·2차성 사구체신염으로 향후 발생되는 AKI에서도, 「예후 예측 인자로서의 바이오마커」로서 뇨내 MK가 유용한 것으로 확인되었다.
8. 미소 변화형 네프로제 증후군과 뇨내 미드카인(MK)의 농도
네프로제 증후군의 가장 높은 빈도를 보이는 원인인 「미소 변화군(minimal change)」은 10% 내지 20%가 급성 뇨세관 괴사(ATN)되는 것으로 알려져 있다. 미소 변화군의 주로 신장 생검 시에 채취한 뇨 샘플에서 MK 농도를 조사한 결과, 급성 뇨세관 괴사(ATN) 합병증에서 유의하게 높은 수치가 확인되었다(도 27). 이와 같이, 미소 변화군 중에서 ATN(협의의 AKI)으로 진행되는 증례의 조기 검출에, 뇨내 MK 농도가 유용한 것으로 보인다.
9. 뇨내 MK 농도와 혈중 MK 농도의 관계 1
(1) 대상 및 방법
신장염 환자 515건의 증례에서, 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도를 측정하였다(크로스-섹션 스터디). 또한, 복부 대동맥류 치환술을 시술받은 환자 32명에서, 여러번 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도를 측정하였다(케이스 컨트롤 스터디). 한편, MK의 친화성 컬럼을 제작하여, 혈청내 MK와 결합하는 단백질을 동정하고자 시도하였다.
(2) 결과
뇨내 MK 농도와 혈중 MK 농도의 측정 결과는 도 28 및 29에 나타낸다. MK는 사구체 여과를 받지 않은 것을 알 수 있었다. 한편, MK의 친화성 컬럼에 결합된 혈청내 성분을 전기 영동으로 조사한 결과(도 30), 분자량 약 250 kDa의 고분자량 단백질(도에서 X로 나타낸 밴드. 도에서 X'로 나타낸 밴드는 X의 단편으로 예상됨)이 MK에 결합하는 것으로 예상되었다. 이 단백질을 TOF-MAS로 분자의 동정을 수행하였다. 이러한 결과로부터, 혈중 MK는 대부분 혈관내피 세포의 헤파린 체인에 결합하고 있으며, 가용성 MK는 있더라도 혈중의 250 kDa의 단백질에 결합하여 존재하고 있으므로, 거의 뇨로 누출되지 않은 것으로 생각된다(사구체 기저막의 사이즈·배리어(콜라겐 섬유로 구성된 네트워크 구멍, 반경 약 70Å임)가 있어, 분자량이 250 kDa이면 여과되지 못함).
10. 뇨내 MK 농도와 혈중 MK 농도의 관계 2
(1) 대상 및 방법
아밀로이드 신장 합병증을 가진 만성 관절 류머티즘 환자에 대한, 헤파린 투여의 유무시의 뇨내 MK 농도와 혈장내 MK 농도를 비교하였다.
(2) 결과
MK 농도는 확실히 헤파린 투여로 상승되었지만(도 31), 아밀로이드 신장에 의한 네프로제 상태(사구체 기저막 손상 정도가 크고, alb 뿐만 아니라 IgG 등의 고분자 단백질이 누출됨)에서도 MK는 뇨내에서 검출되지 않는다. 즉, 사구체로부터 MK의 누출은 기본적으로 없다고 생각된다.
도 32의 증례 1 - 5는 혈장내 MK 농도가 높음에도 불구하고, 뇨내에서 MK가 검출되지 않았다. 특히, 증례 2, 3, 5는 단백질 선택성이 낮은 질환(즉, 사구체 기저막의 손상이 강해, 투과성이 항진되고, 이로써 고분자까지 뇨내로 누출되는 대표적인 질환)으로, 주목할만하다. 증례 6 - 9는, 뇨내 MK 농도가 높은 ATN(협의의 AKI) 증례이지만, 혈장내 MK 농도가 낮은 것에서 높은 것까지 여러가지였다. AKI는 기본적으로 전신에 스트레스가 부과되는 기초 질환으로 인해 발생하는 경우가 많아(예를 들면, 패혈증이나 수술 후 등), 당연히 혈장내 MK도 상승하는 경우가 많다. 이상과 같이, MK가 사구체 여과를 받지 않은 것으로 증명되었다.
본 발명의 검사방법에서는 뇨내 MK 함량을 지표로 AKI의 발증 가능성을 판정한다. 본 발명의 검사방법에 의하면, 기존의 바이오마커(NGAL나 IL-18 등)에서는 실현할 수 없는, 극히 조기의 발증 예측이 가능하다. AKI의 조기 예측이 가능하게 되면, 빠른 단계에서 적극적으로 치료 개입할 수 있어 예후가 개선된다. 뇨내 MK 함량은 신장 기능에 관한 예후 추정에도 유용하다. 뇨내 MK 함량을 지표로 하면, AKI의 발증 가능성 뿐만 아니라, 신장 기능에 관한 예후 추정도 가능해진다. 뇨내 MK는 기존의 바이오마커와는 응답성이 상이하였다. 이러한 응답성 차이를 이용하고, 뇨내 MK와 기존 바이오마커를 병용하면, 보다 정확도가 높고 신뢰성이 우수한 판정을 내릴 수 있다.
한편, 본 발명의 감별법에서도 뇨내 MK 함량을 지표로 AKI 감별을 수행한다. 본 발명의 감별법에 의하면, 극히 높은 민감도 및 특이도로 AKI를 감별할 수 있다. 뇨내 MK와 기존 바이오마커를 병용하여, 정확도 및 신뢰도를 향상시킬 수도 있다.
본 발명은, 상기 발명의 실시형태 및 실시예의 설명으로만 한정되는 것은 아니다. 특허청구 범위에 기재된 바로부터 벗어나지 않으면서, 당업자가 용이하게 달성할 수 있는 범위내에서의 각종 변형 구현예도 본 발명에 포함된다.
본 명세서에 명시된 논문, 공개 특허 공보, 및 특허 공보 등의 내용은, 그 모든 내용을 원용에 의해 인용하는 것으로 한다.
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Claims (29)

  1. 미드카인을 포함하는 급성 신장 장해(acute kidney injury) 조기 검출용 바이오마커.
  2. 뇨내 미드카인의 양을 지표로 하는 급성 신장 장해의 검사방법.
  3. 제2항에 있어서, 하기 단계 (1) 및 (2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 검사방법:
    (1) 뇨내 미드카인을 검출하는 단계;
    (2) 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 발증 가능성을 판정하는 단계.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 급성 신장 장해가 급성 뇨세관 괴사인 것을 특징으로 하는 검사방법.
  5. 제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 급성 신장 장해가 허혈성 급성 신장 장해, 중독성 급성 신장 장해 또는 패혈증성 급성 신장 장해인 것을 특징으로 하는 검사방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 허혈성 급성 신장 장해가 수술 후 허혈성 급성 신장 장해인 것을 특징으로 하는 검사방법.
  7. 제6항에 있어서, 허혈 상태를 일으키는 시술시부터 수술 후 1일까지의 사이에 채취한 뇨를 사용하여 단계 (1)을 실시하는 것을 특징으로 하는 검사방법.
  8. 제6항에 있어서, 허혈 상태를 일으키는 시술시부터 3시간 이내에 채취한 뇨를 사용하여 단계 (1)을 실시하는 것을 특징으로 하는 검사방법.
  9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한항에 있어서, 상기 수술이 대혈관 수술, 인공 심폐 장치를 사용하는 개심술, 장기 이식술 또는 신장 종양 부분 신장 절제술인 것을 특징으로 하는 검사방법.
  10. 제3항 내지 제9항 중 어느 한항에 있어서, 상기 단계 (1)에 추가하여, 하기 단계 (1')을 실시하고, 단계 (2)에서 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 발증 가능성을 판정하는 것을 특징으로 하는 검사방법:
    (1') 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨18(IL-18), 뇨내 신장 장해 분자-1(KIM-1), β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG) 및 뇨내 간형 지방산 결합 단백질(L-FABP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
  11. 제3항에 있어서, 단계 (1)에서 미소 변화군의 환자의 뇨를 검체로서 사용하여 뇨내 미드카인을 검출하는 것을 특징으로 하는 검사방법.
  12. 항-미드카인 항체를 포함하는 급성 신장 장해 검사용 시약.
  13. 제12항에 기재된 시약을 포함하는 급성 신장 장해 검사용 키트.
  14. 미드카인을 포함하는 신장 기능에 관한 예후 추정용 바이오마커.
  15. 뇨내 미드카인 함량을 지표로 하는, 신장 기능의 예후 추정 방법.
  16. 제15항에 있어서, 허혈성 급성 신장 장해, 중독성 급성 신장 장해 또는 패혈증성 급성 신장 장해의 예후를 추정하는 방법인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제15항에 있어서, 신장 이식 후 또는 신장 부분 절제 수술 후 뇨내 미드카인을 검출하고, 이하의 기준에 따라 예후를 추정하는 것을 특징으로 하는 방법:
    수술 후 6시간부터 48시간 동안에 확인되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이면 예후는 양호하고, 수술 후 6시간부터 48시간 동안에 확인되는 뇨내 미드카인 함량의 상승이 일과성이 아니고 높은 수치가 지체(遷延) 내지 지속되면 예후는 불량함.
  18. 제17항에 있어서, 병에 걸린 신장 유래의 뇨 및/또는 건강한 신장 유래의 뇨를 검체로 하여 뇨내 미드카인을 검출하는 것을 특징으로 하는 방법
  19. 항-미드카인 항체를 포함하는 신장 기능에 관한 예후 추정용 시약.
  20. 제19항에 기재된 시약을 포함하는 신장 기능에 관한 예후 추정용 키트.
  21. 미드카인을 포함하는 급성 신장 장해 감별용 바이오마커.
  22. 뇨내 미드카인 함량을 지표로 하는 급성 신장 장해의 감별법.
  23. 제22항에 있어서, 하기 단계 (1) 및 (2)를 포함하는 것을 특징으로 하는 감별법:
    (1) 뇨내 미드카인을 검출하는 단계;
    (2) 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 원인이 급성의 뇨세관 장해인지 여부를 판정하는 단계.
  24. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 급성 신장 장해가 급성 뇨세관 괴사인 것을 특징으로 하는 감별법.
  25. 제22항 또는 제23항에 있어서, 상기 급성 신장 장해가 허혈성 급성 신장 장해인 것을 특징으로 하는 감별법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 허혈성 급성 신장 장해가 수술 후 허혈성 급성 신장 장해인 것을 특징으로 하는 감별법.
  27. 제23항 내지 제26항 중 어느 한항에 있어서, 단계 (1)에 추가하여 하기 단계 (1')을 실시하고, 단계 (2)에서 단계 (1)과 단계 (1')의 검출 결과에 따라, 급성 신장 장해의 원인이 급성의 뇨세관 장해인지 여부를 판정하는 것을 특징으로 하는 감별법:
    (1') 뇨내 호중구 젤라티나제 결합성 리포칼린(NGAL), 뇨내 인터루킨18(IL-18), 뇨내 신장 장해 분자-1(KIM-1), β-N-아세틸-D-글루코스아미니다제(NAG) 및 뇨내 간형 지방산 결합 단백질(L-FABP)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 바이오마커를 검출하는 단계.
  28. 항-미드카인 항체를 포함하는 급성 신장 장해 감별용 시약.
  29. 제28항에 기재된 시약을 포함하는 급성 신장 장해 감별용 키트.
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