CN115144595A - Cd147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种CD147作为生物标志物在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平作为子痫前期的早期检测标志物。子痫前期是一种多因素疾病，临床表现多样，发病机制知之甚少。新标志物CD147的应用，提供了一种与传统方法相比(sFlt:PlGF比率，>20怀孕周)检测时间更早的子痫前期检测标志物，最早可于妊娠母体11‑14怀孕周进行子痫前期的检测，有助于对子痫前期进行更具体的早期检测以及临床管理，并为子痫前期的预防和早期干预提供新的科学依据，具有重要的理论意义和重大的社会意义。

Description

CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术以及抗原检测领域，尤其涉及一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用。
背景技术
子痫前期(PE)是导致产妇死亡及新生儿发病和死亡的最主要原因之一，其发病主要与胎盘发育异常有关。至今，胎盘异常诱发PE病发的机制仍不明确。PE的表型通常在妊娠中期的后期或妊娠晚期被检测到，然而PE的病理发生却始于妊娠早期。
许多子痫前期的生物学标记的研究表明，检测血管生成因子例如PlGF(胎盘生长因子)，或者sFlt-1(可溶性fms样酪氨酸激酶-1)与PlGF的比率可作为妊娠早期PE筛查的预测指标。这些标记物的早期(约20周妊娠)和晚期发作子痫前期的检出率分别为87.5％和48.6％，假阳性率为10％。而临床标记物和生物标记物的组合则显示出更高的检测率。然而，目前尚未有能于更早期准确预测PE发生的可靠标志物。在开发新的生物标志物以明确确定子痫前期的早期检测上，仍有改进的空间。
因此，现有技术还有待改进。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，利用CD147作为子痫前期的早期检测标志物，通过检测早期妊娠母体中CD147表达水平作为子痫前期的早期检测，为目前子痫前期早期检测试剂盒提供了一种新的生物标志物。
本发明的技术方案如下：
CD147作为生物标志物在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用。
一种子痫前期早期检测试剂盒，其中，所述试剂盒包括用于检测CD147蛋白含量的物质。
所述的试剂盒，其中，所述试剂盒包括CD147特异性抗体、抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物、显色剂以及洗涤液。
一种子痫前期早期检测试剂盒的应用，其中，将如上任一所述的试剂盒应用于测量人体体液或体外细胞培养上清液中的可溶性CD147蛋白的含量。
所述的子痫前期早期检测试剂盒的应用，其中，测量可溶性CD147蛋白含量的方法包括以下步骤：
1.1取待测样本，离心后获得上清液；
1.2将所述上清液制备成标准和梯度稀释样品；
1.3将CD147特异性抗体预涂在ELISA微孔板上，并将等体积的所述标准和梯度稀释样品分别加入到不同的孔中，密封后在37℃下孵育90min或4℃下孵育过夜；
1.4孵育完成后，向每个孔中加入等体积的抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体，重新密封后在37℃下第二次孵育60min；
1.5第二次孵育完成后，对每个孔进行洗涤；
1.6洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物溶液，重新密封后在37℃下第三次孵育30min；
1.7第三次孵育完成后，对每个孔进行再次洗涤；
1.8再次洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色剂，重新密封后在37℃避光下第四次孵育5-30min；
1.9第四次孵育完成后，加入终止溶液，并在30min内读取光密度；
1.10根据光密度计算所述标准和梯度稀释样品中可溶性CD147蛋白的含量。
有益效果：本发明提供了一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平作为子痫前期的早期检测。子痫前期是一种多因素疾病，临床表现多样，发病机制知之甚少。新标志物CD147的应用，提供了一种与传统方法相比(sFlt:PlGF比率,>20怀孕周)检测时间更早的子痫前期检测标志物(CD147,11-14怀孕周)，有助于对子痫前期进行更具体的早期检测以及临床管理，并为子痫前期的预防和早期干预提供新的科学依据，具有重要的理论意义和重大的社会意义。
附图说明
图1为本发明实施例中CD147在早期妊娠血压正常和子痫前期胎盘绒毛样本中的表达示意图。
图2为本发明实施例中CD147在小鼠(妊娠第16.5天)和人(足月)胎盘中的表达示意图。
图3为本发明实施例中利用ELISA来测量可溶性CD147蛋白含量的原理示意图。
图4为本发明实施例中利用ELISA测定的血压正常妊娠和子痫前期患者的妊娠早期血清中CD147表达水平。
具体实施方式
本发明提供一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
CD147是细胞表面的I型跨膜糖蛋白，可以和其他膜蛋白相互作用形成蛋白复合物，参与多种生理和病理过程。研究发现，CD147基因敲除小鼠的后代数量减少、体型瘦弱，可能与胎盘发育不全相关。在人的整个孕期中，CD147都可以在胎盘中检测到，并且在妊娠晚期PE患者胎盘中CD147呈现低表达。然而，临床上收集早期妊娠胎盘受到极大限制。另一方面，CD147可以在早期妊娠血清中以可溶形式检测到，但早期妊娠母体血清中可溶性CD147与PE之间的关联尚没有报道。本发明的前期初步数据表明，在正常妊娠中，孕早期的胎盘中和早期妊娠母体血清中CD147呈现高表达，而在PE病人胎盘中的CD147则显著下调。如图1所示为CD147在早期妊娠血压正常和子痫前期胎盘绒毛样本中的表达，其中，正常血压N＝8，PE N＝6，比例尺＝100μm。通过Image-Pro Plus软件进行定量分析。可以看出，PE病人胎盘中的CD147含量显著下调。如图2所示为CD147在小鼠(妊娠第16.5天)和人(足月)胎盘中的表达，比例尺＝100μm，其中小鼠胎盘(4×)比例尺＝600μm。可以看出，CD147在人和小鼠胎盘上表达，并主要存在于细胞滋养层和合体滋养层。
基于前期初步数据，本发明实施例提供了一种CD147作为生物标志物在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平进行子痫前期的早期检测。
研究表明，大龄孕妇的糖代谢和高血压风险加大，而糖代谢和高血压与妊娠疾病如PE(子痫前期)、早产、妊娠糖尿病密切相关。虽然目前对PE的发生原因有初步的了解，但对其发病的分子机制仍不明确，且缺乏有效预防和治疗PE的方法。目前，终止妊娠取出胎儿和胎盘仍是唯一有效的方法。但伴随剖腹产次数增加而来的，是剖腹产的风险，例如孕产妇死亡、血栓栓塞、出血、感染等，以及额外医疗费用。连接母体和胎儿的胎盘在整个怀孕期间提供足够的血液灌注。异常的胎盘发育或功能与各种妊娠并发症例如子痫前期有关，并影响母亲和婴儿健康。而CD147可以影响胎盘滋养层细胞的功能和人类妊娠病症的早期胎盘的调节。故而，子痫前期早期检测的研究对提高母胎健康水平，降低妊娠期风险意义重大。
利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平进行子痫前期的早期检测，识别有子痫前期风险的母亲，并在病发之前就能够密切监测，具有极其重要的现实意义。
本发明实施例利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平作为子痫前期的早期检测，将为PE的预防和早期诊治提供新的科学依据，具有重要的理论意义和重大的社会意义。
本发明实施例还提供了一种子痫前期早期检测试剂盒，所述试剂盒包括用于检测CD147蛋白含量的物质。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括CD147特异性抗体、抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物、显色剂以及洗涤液。
本发明实施例还提供了一种子痫前期早期检测试剂盒的应用，将所述的试剂盒应用于测量人体体液或体外细胞培养上清液中的可溶性CD147蛋白的含量。
在一些实施方式中，人体体液包括血液、唾液、尿液和乳汁。
具体的，可以测量妊娠早期母体血液中的可溶性CD147蛋白的含量。
在一些实施方式中，利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来测量可溶性CD147蛋白的含量。
如图3所示，利用ELISA来测量可溶性CD147蛋白含量的原理为：首先提供带有链霉亲和素-生物素检测的夹心人CD147 ELISA试剂盒。其中，CD147特异性小鼠单克隆抗体已预涂在96孔板上。将样品添加到96孔板的孔中并孵育，然后加入对CD147特异的来自山羊的生物素化检测多克隆抗体并孵育，反应完成后PBS缓冲液洗涤。之后，加入抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物，用PBS缓冲液洗去未结合的偶联物。然后利用TMB可视化HRP酶促反应，TMB在HRP的催化下产生蓝色产物。最后，加入酸性终止液后变为黄色，而黄色颜色的密度与96孔板中捕获的人CD147样品量成正比。
在一些实施方式中，测量可溶性CD147蛋白的含量的方法包括步骤：
S01、取待测样本，离心后获得上清液；
S02、将所述上清液制备成标准和梯度稀释样品；
S03、将CD147特异性抗体预涂在ELISA微孔板上，并将等体积的所述标准和梯度稀释样品分别加入到不同的孔中，密封后在37℃下孵育90min或4℃下孵育过夜；
S04、孵育完成后，向每个孔中加入等体积的抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体，重新密封后在37℃下第二次孵育60min；
S05、第二次孵育完成后，对每个孔进行洗涤；
S06、洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物溶液，重新密封后在37℃下第三次孵育30min；
S07、第三次孵育完成后，对每个孔进行再次洗涤；
S08、再次洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色剂，重新密封后在37℃避光下第四次孵育5-30min；
S09、第四次孵育完成后，加入终止溶液，并在30min内读取光密度；
S10、根据光密度计算所述标准和梯度稀释样品中可溶性CD147蛋白的含量。
具体的，步骤S01中，所述待测样本为从妊娠早期(8-12周)母体中采集的血液。血液由血细胞和血浆所组成，采集血液后，在37℃静置半小时以上，让血液凝固并析出血清，之后置于离心机中3500-4000rpm离心5-10min，分离得到血清。分离得到的血清可在-20℃储存。
具体的，步骤S02中，梯度稀释样品的稀释倍数可从2×至100×合理选择，可根据具体情况合理选择。
具体的，步骤S05和S07中，洗涤液为PBS，洗涤步骤为用PBS洗孔五次。
具体的，步骤S08中，向每个孔中加入90μL制备好的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB)显色剂，密封后在37℃避光下孵育5-30分钟来观察HRP(辣根过氧化物酶)酶促反应，TMB被HRP催化生成蓝色产物。
具体的，步骤S09中，加入酸性终止溶液，例如1M HCl，此时反应液的颜色立即变为黄色。
具体的，步骤S09中，光密度为酶标仪在450nm处的吸光度。黄色颜色的密度与ELISA微孔板中捕获的CD147样品量成正比。
具体的，步骤S10中，所述标准和梯度稀释样品中可溶性CD147蛋白的含量可以通过光密度从标准曲线计算出来。梯度稀释样品中蛋白含量的计算需考虑稀释倍数。
下面通过具体实施例对本发明一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用做进一步的解释说明：
实施例1待测样本的收集
经香港大学深圳医院伦理委员会批准以及患者的知情同意之下，对怀孕8-12周的孕妇采集额外的2mL血液，作为待测样本。
实施例2利用ELISA测量待测样本中CD147表达水平
(1)将采集的血液样本在37度℃静置半小时以上，之后放在离心机里3500-4000rpm离心5-10分钟，分离得到血清样品。
(2)CD147特异性小鼠单克隆抗体已预涂在96孔ELISA微孔板上；将100μL的标准和稀释(稀释2-100倍)血清样品添加到适当的孔中，用新的密封板密封并在37℃下孵育90min或4℃下孵育过夜。
(3)取下密封，弃去孔中的溶液，并将板吸到纸巾或其他吸水材料上，任何时候都不要让孔完全干燥。
(4)向每个孔中加入100μL来自山羊的抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体，用新的密封板密封并在37℃下孵育板60min。
(5)用300μL PBS洗涤孔五次，每次让洗涤缓冲液在孔中停留1min，丢弃洗涤缓冲液并将板吸到纸巾或其他吸收材料上。
(6)将100μL抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物溶液加入每个孔中，用新的封板密封板并在37℃下孵育板30min。
(7)用300μL PBS洗涤孔五次，每次让洗涤缓冲液在孔中停留1min，丢弃洗涤缓冲液并将板吸到纸巾或其他吸收材料上。
(8)向每个孔中加入90μL制备好的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物(TMB)显色剂，用新的密封板密封，并在37℃避光下孵育5-30min来观察HRP酶促反应，此时TMB被HRP催化生成蓝色产物。
(9)在每孔中加入100μL的1M HCl作为终止溶液，此时溶液颜色立即变为黄色。
(10)加入终止溶液后30min内读取酶标仪在450nm处的吸光度，即为黄色颜色的光密度。光密度与板中捕获的人可溶性CD147含量成正比。
结果如图4所示，利用ELISA法测定血压正常和子痫前期孕妇早孕期血清CD147水平，其中正常血压N＝52，PE N＝26，早发PE N＝8，晚发PE N＝18，所有数据均表示为平均值±标准差。上述结果可知，血压正常和子痫前期孕妇早孕期血清CD147水平具有显著性差异，证实CD147可以作为一种新的子痫前期的早期检测标志物。
综上所述，本发明提供了一种CD147在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用，利用CD147在早期妊娠母体中的表达水平作为子痫前期的早期检测。子痫前期是一种多因素疾病，临床表现多样，发病机制知之甚少。新标志物CD147的应用，提供了一种与传统方法相比(sFlt:PlGF比率，>20怀孕周)检测时间更早的子痫前期检测标志物(CD147,11-14怀孕周)，有助于对子痫前期进行更具体的早期检测以及临床管理，并为子痫前期的预防和早期干预提供新的科学依据，具有重要的理论意义和重大的社会意义。
应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (5)

1.CD147作为生物标志物在制备子痫前期早期检测试剂盒的应用。
2.一种子痫前期早期检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测CD147蛋白含量的物质。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括CD147特异性抗体、抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体、抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物、显色剂以及洗涤液。
4.一种子痫前期早期检测试剂盒的应用，其特征在于，将如权利要求2-3任一所述的试剂盒应用于测量人体体液或体外细胞培养上清液中的可溶性CD147蛋白的含量。
5.根据权利要求4所述的子痫前期早期检测试剂盒的应用，其特征在于，测量可溶性CD147蛋白含量的方法包括步骤：
1.1取待测样本，离心后获得上清液；
1.2将所述上清液制备成标准和梯度稀释样品；
1.3将CD147特异性抗体预涂在ELISA微孔板上，并将等体积的所述标准和梯度稀释样品分别加入到不同的孔中，密封后在37℃下孵育90min或4℃下孵育过夜；
1.4孵育完成后，向每个孔中加入等体积的抗人CD147特异的生物素化检测多克隆抗体，重新密封后在37℃下第二次孵育60min；
1.5第二次孵育完成后，对每个孔进行洗涤；
1.6洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物溶液，重新密封后在37℃下第三次孵育30min；
1.7第三次孵育完成后，对每个孔进行再次洗涤；
1.8再次洗涤完成后，向每个孔中加入等体积的3,3',5,5'-四甲基联苯胺底物显色剂，重新密封后在37℃避光下第四次孵育5-30min；
1.9第四次孵育完成后，加入终止溶液，并在30min内读取光密度；
1.10根据光密度计算所述标准和梯度稀释样品中可溶性CD147蛋白的含量。
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