KR101075100B1 - 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 및 키트 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 및 키트를 개시한다. 본 발명은 자간전증의 진단마커로 공지된 IHNA, sEng 및/또는 TGF-β1의 조합 값을 이용한 것을 특징으로 한다.

Description

자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 및 키트{Method and Kit for Providing Information Useful for Diagnosis of Preeclampsia}

본 발명은 자간전증의 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 및 키트에 관한 것이다.

자간전증(preeclampsia)은 임신 중 발병하는 임신 합병증으로 고혈압, 부종, 단백뇨 등의 임상적 증상을 보이며, 태아 성장 발육 저하, 태아 사망, 조산, 산모 사망 등을 초래한다.

현재까지 알려진 자간전증의 원인으로는 비정상적인 태반형성이 보고되고 있으나, 아직까지 명확한 원인을 밝혀지지 않았으며, 분만 외에는 뚜렷한 치료방법도 알려져 있지 않다. 자간전증은 가벼운 증상에서부터 생명을 위협하는 정도까지 질병의 중증도가 다양하다. 중증의 경우는 입원이 권장되고 있으며, 발작을 예방하기 위해 혈압제 또는 항경련제가 투여된다. 만약 증상이 임신부나 아기의 생명을 위협하는 정도에 이르면 조기 분만을 통해 임신을 종료시켜야만 한다.

자간전증은 연간 전세계적으로 적어도 이십만명의 임신부 사망의 원인이 되고 있다. 자간전증의 증상은 전형적으로 임신 20주 이후에 나타나고 보통 산모의 혈압 또는 요(urine) 검사에 의해 진단하고 있다.

그러나 이러한 진단을 위한 모니터링 방법은 조기 진단에 있어서는 효과적이지 않다. 자간전증에 있어서는 조기 진단이 중요한데, 그것은 자간전증의 조기 진단이 가능할 경우 환자, 발병 중인 태아에 대한 위험을 감소시킬 수 있고, 고위험 환자는 좀더 구체적으로 모니터링할 수 있기 때문이다.

따라서 자간전증의 조기 진단이 가능한 바이오마커들이 제시되어 왔는데, 샤페로닌(chaperonin), ER-60 프로티아제(ER-60 protease), 이소시트레이트 디하이드로게나제 1(Isocitrate dehydrogenase 1), 알데히드 리덕타제 1(Aldehyde reductase) 등과(국내 공개특허 제2009-0007872호), 콘드로이틴 4-O-설포트랜스퍼라제 1(Chondroitin 4-O-sulfotransferase 1; C4ST), 콘드로이틴 6-설포트랜스퍼라제(Chondroitin 6-sulfotransferase; C6S) 등(국내 공개특허 제공개특허 제2009-0005727호)이 제시되어 있으며, inhibin alpha ("이하 "IHNA"), soluble endoglin (이하 "sEng") 및 transforming growth factor-beta 1 (이하 "TGF-β1") 등이 알려져 있다(Silver H.M. et al., Journal of the Society for Gynecologic Investigation (2002) 9(5):308-312; Venkatesha S. et al., Nature medicine (2006) 12(7):862-862; Benian A. et al., Obstetrics and gynecology (2002) 100(2):327-331).

본 발명은 자간전증의 조기 진단이 가능한 바이오마커 중 IHNA, sEng 및 TGF-β1을 이용하여 자간전증 진단 특히 조기 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 등을 개시한다.

본 발명의 목적은 자간전증의 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 자간전증의 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 키트를 제공하는 데 있다.

일 측면에 있어서, 본 발명은 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명의 특징은 자간전증 진단 마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1의 조합 값을 이용하는 것이다.

구체적으로 본 발명의 방법은 (a) 자간전증 진단 마커인 IHNA, sEng 및/또는 TGF-β1에 특이적인 항체를 이용하여 생체시료로부터 자간전증 진단 마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1를 정량하는 단계, (b) 상기 정량된 값으로부터 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값 또는 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 단계를 포함하여 구성된다.

상기 조합 값은 의사 등 의료 전문가에 의해서 고혈압, 부종, 단백뇨 등의 자간전증의 임상적 증상과 함께, 자간전증의 이환 유무의 판단, 이환 가능성 판단, 자간전증의 조기 진단, 자간전증의 치료 경과의 판단 등에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명자(들)는 아래의 실시예에서 확인되는 바와 같이, 정상 임신부 100명과 자간전증 임신부 40명을 대상으로 임신 20주 이후에 자간전증의 진단 마커로 알려진 IHNA, sEng 및 TGF-β1의 혈중 농도를 측정하고, 이들 진단마커의 혈중 농도 값을 4칙 연산법 등을 이용하여 조합하였을 때, 상기 각 진단마커의 진단 정확도(AUC, Area Under Curve)는 0.78(IHNA), 0.83(sEng) 및 0.27(TGF-β1)이었으나, 4칙 연산법 등으로 조합한 경우의 진단 정확도는 (sEng 혈중 농도 값)/(TGF-β1 혈중 농도 값)의 경우는 0.93이었으며, (IHNA 혈중 농도 값+sEng 혈중 농도 값)/(TGF-β1 혈중 농도 값)의 경우는 0.94로 현저하게 상승함을 확인할 수 있었다. 또한 아래의 실시예에서 확인되듯이(특히 아래의 [표 4] 참조), 컷-오프 값(기준값)을 민감도와 특이도가 함께 높아지도록 설정하였을 때, 조합 값인 (sEng 혈중 농도 값)/(TGF-β1 혈중 농도 값) 및 (IHNA 혈중 농도 값+sEng 혈중 농도 값)/(TGF-β1 혈중 농도 값)의 민감도와 특이도가 각 진단마커의 민감도와 특이도보다 모두 현저하게 상승할 뿐만 아니라, 특히 위험율의 경우 각각 29.75배, 34.67배로 높게 나타났다.

상기에서 진단 정확도(AUC)는 정상군과 환자군의 분류에 따라 진단마커의 정량 값 또는 그 정량 값의 조합 값을 구하고 이에 기초하여 컷-오프 값을 정한 뒤, 질병이 있는 환자를 질병이 있다고 진단할 수 있는 능력인 민감도(sensitivity)와 질병이 없는 환자를 질병이 없다고 진단할 수 있는 능력인 특이도(specificity)를 계산하고, 민감도를 수직축으로 하고 1-특이도를 수평축으로 하여 그려진 ROC(receiver operating characteristic)의 곡선 아래의 면적으로 계산하여 얻은 값이다. 이러한 정확도 즉 곡선 아래의 면적은 그 값이 1이면 완벽한 검사방법이며, 0.5이면 가치가 없는 검사방법이다. 당업계에서 곡선 아래의 면적이 0.9-1이면 매우 우수한 검사방법으로, 0.8-0.9이면 우수한 검사방법으로, 0.7-0.8이면 보통 수준의 검사방법으로 주지되어 있다.

또한 상기에서 위험률은 특정 컷-오프 값 이상을 양성이라고 정의하여, 검사상 양성으로 나왔을 때, 양성으로 나온 집단의 음성으로 나온 집단 대비, 질병의 이환 가능성을 수치적으로 표현한 것이다. 예컨대 위험율이 29배라고 하면 검사상 양성인 집단이 음성으로 나온 집단에 비하여 해당 질병의 이완 가능성은 29배 높다는 것이 된다. 당업계에서는 진단마커의 위험율이 적어도 20배 이상이 되어야 임상적으로 사용가치가 있는 것으로 보고 있다(황상편, 부산의대 "체외진단용의약품의 진단 정확도 평가를 위한 접근방법" 2008년, 대한임상검사정도관리협회 워크샵).

본 발명에서 자간전증의 진단마커로 사용된 IHNA, sEng 및 TGF-β1은 모두 자간전증의 진단마커로서 공지되어 있는 것들인데, 그 중 IHNA는 문헌[Silver H.M. et al., Journal of the Society for Gynecologic Investigation (2002) 9(5):308-312], 문헌[Paiwattananupant Krissada et al., Official journal of the International Society for the Study of Hypertension in Pregnancy (2008) 27(4):337-343], 문헌[Salomon Laurent J. et al., American journal of obstetrics and gynecology (2003) 189(6):1517-1522] 등에서 확인할 수 있고, sEng는 문헌[Berkley, E. et al., American journal of obstetrics and gynecology (2006) 195(6):S154], 문헌[Stepan Holger et al., American journal of obstetrics and gynecology (2008) 198(2)], 문헌[Venkatesha S. et al., Nature medicine (2006) 12(7):862-862] 등에서 확인할 수 있으며, TGF-β1은 문헌[Lim Ji Hyae et al., Prenatal diagnosis (2009) 29(5):471-476], 문헌[Sanchez S. et al., Society for Maternal-Fetal Medicine (2003) 2003:S87], 문헌[Benian A. et al., Obstetrics and gynecology (2002) 100(2):327-331] 등에서 확인할 수 있다.

본 명세서에서, "자간전증의 진단마커"는 그 정량 값이 정상 임신부의 정량 값보다 높거나 낮은 값을 보이는 것으로, 임신부의 자간전증 이환(罹患) 유무의 판단(특히 조기 진단), 이환 가능성의 예측, 치료 경과의 판단 등 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위해 사용되는 조합 값인 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값) 및/또는 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 산출에 필요한 IHNA, sEng 및 TGF-β1를 말한다.

본 발명에서 사용된 진단마커 중 IHNA 및 sEng는 그 정량 값이 환자에서 높고, TGF-β1의 정량 값은 정상인에서 높으며, 그 조합 값인 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)과 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)는 모두 환자에서 높고 정상인에서 낮다.

자간전증의 진단마커의 조합 값인 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)와 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)이 컷-오프 값보다 높거나 낮은 것으로 검사되었을 경우, 그 검사치는 자간전증 이환 유무, 이환 가능성 등의 판단에 유용한 정보로서 사용될 수 있다.

예컨대 조합 값인 (sEng 정량값)/(TGF-β1 정량값)에 대해서 컷-오프 값이 본 발명의 아래 실시예에서처럼 2.0으로 설정되고, 검사상 조합 값인 (sEng 정량값)/(TGF-β1 정량값)이 2.5 이상으로 나왔을 때, 이러한 결과치는 의사 등의 전문가의 자간전증 이환 유무, 이환 가능성, 치료 경과 등에 대한 판단에 있어서 자간전증의 다른 임상적 증상들 예컨대 고혈압, 부종, 단백뇨 등과 함께 유용한 고려 사항이 되는 것이다.

여기서 컷-오프 값은 정상군과 환자군에서 측정한 진단마커의 정량 값으로부터 민감도와 특이도를 계산하고 얻어질 수 있다. 바람직하게는 컷-오프 값으로서 민감도와 특이도 함께 높아지고 위험률이 또한 높아지는 값을 선택하는 것이 바람직하다. 본 발명의 아래의 실시예에서는 조합 값인 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)과 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 컷-오프 값을 각각 2.0 및 1.9로 설정하였을 때 민감도와 특이도가 각 진단마커의 그것들에 현저하게 상승할 뿐만 아니라, 위험률도 현저하게 상승하였다.

또한 본 명세서에서, "생체 시료"란 본 발명의 진단마커의 발현 수준이 정상 대조군과는 다른(즉 높거나 낮은), 생체로부터 채취된 시료를 말한다. 예컨대 상기 생체 시료에는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 양수, 태반조직 등이 포함될 수 있다.

또한 본 명세서에서, "특이적 결합"의 의미는 항체가 그 표적 단백질인 자간전증 진단마커와 항원-항체 결합체를 형성하고, 다른 단백질과는 실질적으로 그러한 결합체를 형성하지 않는 경우를 의미한다. 여기서 "실질적으로"이란 정도는 낮지만 비특이적인 결합체는 형성될 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 비특이적 결합은 통상 정량 전에 제거되어 정량 값에 포함되지 않는다. 상기 "특이적 결합"의 의미는 달리 표현할 경우 그 결합이 단백질의 특정 구조 즉 항원의 결정 부위인 에피토프에 의해서 결정되는 결합이라고 표현될 수도 있다. 에피토프는 항원성 또는 면역원성을 갖는 부분의 아미노산 영역(항원 결정기)을 가리킨다. 에피토프는 통상 적어도 적어도 10개 아미노산을 포함할 것이다. 이러한 에피토프는 당업계의 공지·관용된 에피토프 해석법 예컨대, 파시 제시(phage display)법, 역면역유전학(reverse immunogenetics) 등에 의해서 동정할 수 있다.

본 명세서에서, "자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1에 특이적인 항체"는 본 발명의 자간전증 진단마커에 특이적으로 결합하는 것이면 모든 형태의 것을 포함하는 의미이다. 따라서 모노클로날항체, 폴리클로날항체, 다중특이적 항체(즉 두 개 이상의 항원 또는 두 개 이상의 에피토프를 인식하는 항체로서 예컨대 이특이적 항체 등을 말함)를 포함하는 것 이외에, 본 발명의 자간전증 진단마커에 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 항체의 단편, 재조합 항체, 화학적으로 수식된 항체를 포함한다. 여기서 항체의 단편의 예로서는 Fab, F(ab')₂, scFv(중쇄나 경쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 항체), Fv, Fab/c)(1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 항체), 항체를 단백질 절단 효소 예컨대, 파파인, 펩신으로 처리하여 얻어진 항체 단편, 단편에 대한 유전자를 유전자 재조합 방법으로 숙주세포에 도입·발현시켜 얻어지는 항체 단편(Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem., 192, 767-775, 1990)을 포함하는 의미이다. 상기 항체의 글로불린 유형도 본 발명의 자간전증 진단마커에 특이적으로 결합하는 것이면 특별히 한정되지 않는데, 그 글로불린 유형은 IgG, IgM, IgA, IgE, IgD 중 어느 하나일 수 있다.

상기 항체를 사용하여, 그 항체에 특이적으로 결합된 생체 시료 중의 자간전증 마커는 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 방사 면역 측정법, 발광 면역 측정법 등 다양한 당업계의 공지·관용된 면역학적 측정 방법에 의해서 정량하는 것이 가능하다.

상기 효소면역측정법에는 퍼옥시다제(POD), 알칼리포스파타제, β-갈락토시다제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스옥시다제, 락트산 탈수소 효소, 아밀라제 또는 비오틴-아비딘 복합체 등의 효소가 사용될 수 있고, 형광 면역 측정법의 경우에는 플루오레세인이소티오시아네이트, 테트라메틸로다민이소티오시아네이트, 치환 로다민이소티오시아네이트, 디클로로트리아진이소티오시아네이트, 알렉사(Alexa) 또는 알렉사플루오로(AlexaFluoro) 등의 형광성 물질 또는 형광단이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에는 트리티움, 요오드(¹³¹I,¹²⁵I,¹²³I,¹²¹I), 인(³²P), 황(³⁵S), 금속류(예를 들면, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga, ⁶⁸Ge, ⁵⁴Mn, ⁹⁹Mo, ⁹⁹Tc, ¹³³Xe 등) 등의 방사성 동위원소가 사용될 수 있으며, 발광 면역 측정법에는 루시퍼라제 방법, 루미놀 퍼옥시다제 POD 방법 등이 디옥세탄 화합물 등의 발광성 물질 등과 함께 사용될 수 있다.

아비딘-비오틴 방법, 스트렙토아비딘-비오틴 방법 등을 이용할 때처럼 항체가 필요에 따라서는 표지 물질과 결합될 수도 있다. 표지 물질과 항체의 결합은 효소 면역 측정법에 있어서는 글루타르알데히드법, 말레이미드법, 피리딜디술피드법, 과요오드산법 등의 방법이 사용될 수 있으며, 방사 면역 측정법에 있어서는 클로라민 T법, 볼턴-헌터법 등의 방법이 사용될 수 있다.

면역학적 측정 방법으로는 상기 예시한 4가지 방법 이외에, 면역 침강법, 면역비탁법, 웨스턴 블로팅법, 면역 염색법, 면역 확산법 등을 추가로 예시할 수 있으나 상기 4가지 방법을 사용하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 효소 면역 측정법, 가장 바람직하게는 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하는 경우이다.

본 발명의 방법에서, 생체시료 중의 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1의 정량은 전술한 바의 항체, 진단마커-항체 결합체를 정량하기 위한 면역학적 측정 방법에 필요한 시약 등을 구비하고 있는 시중에 유통되는 키트를 이용함에 의해서도 가능하다. 그러한 키트로서 USCNLIFE 사(China)의 IHNA 키트(Catalog No: E0446h), 아래의 실시예에서 사용된 Diagnostic system laboratories 사(USA)의 IHNA 키트, USCNLIFE 사의 sEng 키트(Catalog No: E0980h), 아래의 실시예에에서 사용된 R&D system 사(USA)의 sEng 키트, R&D system 사(USA)의 TGF-β1 키트 등을 들 수 있다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 키트에 관한 것이다.

본 발명의 키트는 본 발명의 자간전증 마커인 sEng를 정량하기 위한 수단 및 TGF-β1를 정량하기 위한 수단을 포함하거나, 본 발명의 자간전증 마커인 IHNA를 정량하기 위한 수단, sEng를 정량하기 위한 수단 및 TGF-β1를 정량하기 위한 수단를 포함하는 것을 특징으로 한다.

상기 IHNA, sEng 또는 TGF-β1를 정량하기 위한 수단은 통상 그 진단마커들에 특이적으로 결합하는 항체, 그 진단마커-항체 결합체를 정량하기 위한 면역학적 측정 방법 등에 사용되는 2차 항체, 담체, 세정 버퍼, 시료 희석액, 효소 기질, 반응 정지액 등을 포함하게 될 것이다.

또한 본 발명의 키트는 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값 또는 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값이 자간전증 진단에의 사용 방법을 교시하는 설명서를 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 방법은 자간전증 진단마커인 sEng 및 TGF-β1에 특이적인 항체를 이용하여 생체시료로부터 자간전증 진단마커인 sEng 및 TGF-β1를 정량하는 단계, 및 상기 정량된 값으로부터 (sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명은 다른 측면에 있어서, 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 방법은 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1에 특이적인 항체를 이용하여 생체시료로부터 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1를 정량하는 단계, 및 상기 정량된 값으로부터 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 단계를 포함하여 구성된다.

본 발명의 상기 방법들에서 상기 생체 시료는 혈청 또는 혈장이며, 정량 값은 혈중 농도 값인 것이 바람직하다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따르면 자간전증의 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1을 조합하여 자간전증의 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법 및 키트를 제공할 수 있다. 본 발명의 방법 및 키트는 자간전증의 각 진단마커인 IHNA, sEng 또는 TGF-β1만을 이용하는 경우보다 자간전증 진단의 정확도(AUC)가 현저하게 상승한다.

이하 본 발명을 실시예를 참조하여 설명한다. 그러나 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 연구 대상과 연구 방법

<실시예 1-1> 연구 대상

2001년 10월부터 2003년 12월까지 제일병원 산부인과를 내원하여 분만한 100명의 정상 임신부와 40명의 자간전증 임신부를 대상으로 본 연구의 목적을 설명하고 혈액 채취에 동의를 얻었다. 자간전증은 임신 20주 이후에 고혈압 (140/90 mmHg 이상)과 단백뇨 (24시간 뇨중 단백질 300 mg 이상, 또는 dipstick testing 1+ 이상)가 발생한 경우로 정의하였다. 자간전증의 진단은 ACOG (American College of Obstetricians and Gynecologists)의 진단 기준에 근거하였다. 중증인 경우는 이완기 혈압 110 mmHg 이상, 24시간 단백뇨 5 mg 이상(또는 dipstick testing 3+ 이상), 자간증, 또는 HELLP 증후군 (hemolysis, elevated liver enzyme, low platelet count) 중 하나 또는 그 이상이 나타나는 경우로 정의하였다. 조기분만 (preterm delivery)은 임신 기간을 기준으로 하여 임신 37주 이전의 분만한 경우로 정의하였다. 출생체중의 백분위수 (percentile)는 한국인의 임신주수에 따른 출생체중의 분포 (2007년 제4판 산과학, 대한산부인과학회)에 근거하여 산출하였으며 그 해당 주수 체중의 10~90 백분위 사이의 출생체중 미숙아는 정상체중아 (appropriate for gestational age, AGA)로, 10백분위수 미만의 출생체중 미숙아는 저체중아 (small for gestational age, SGA)로 각각 정의하였다. 대조군은 산과 또는 내, 외과적 합병증이 없고 37주 이후에 분만한 산모로 산아가 분만 시 임신 주수를 기준으로 10 percentile 이상에서 90 percentile 이하의 출생 체중을 보인 임신부들을 포함하였다. 다태임신, 만성 고혈압, 신장 질환, 당뇨병, 심혈관계질환, 태아기형, 모체 또는 태아 감염이 있는 경우 연구 대상에서 제외하였다. 본 연구는 제일병원 의학연구심의위원회 (IRB)의 승인을 받아 진행하였다 (SCH-IRB-2005-12).

<실시예 1-2> 연구 방법

<실시예 1-2-1> 임신부의 혈액 채취 및 처리

모든 대상 임신부로부터 본 연구의 목적을 설명하고 동의를 얻은 후 임신 이분기 (14~23주)에 말초혈액을 항응고제가 포함되어 있지 않은 plain 튜브와 EDTA 튜브 (sterile 5ml tube containing 7.5 mg ethylenediamine-tetra-acetic acid and TIU of aprotinin)에 각각 5cc 씩 채취하였다. 채취된 혈액은 2,500 g로 10분 동안 원심분리한 후 분리된 혈청과 혈장을 각각 분석되기까지 -70℃ 에서 보관하였다.

<실시예 1-2-2> 자간전증 진단마커의 측정방법

IHNA의 측정은 효소면역분석법 (enzyme-linked immunosorbant assay; ELISA)으로 Diagnostic systems laboratories (Texas, USA)의 Active^® human Inhibin A kit를 사용하여 측정하였다. 혈청 내에 존재하는 IHNA를 결합시키기 위해 anti-IHNA antibody-coated wells에 혈청 샘플과 표준 시약 50 μL을 첨가한다. 여기에 IHNA sample buffer A를 각각의 well에 50 μL을 첨가한 다음 IHNA sample buffer B를 각각의 well에 50 μL을 첨가한 후 실온에서 3시간 반응시킨다. 결합이 되지 않은 IHNA를 제거하기 위하여 6회 세척하고 다시 각 well에 conjugate solution을 100 μL씩 첨가하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 6회 세척하였다. 각 well에 TMB chromogen solution 100 μL씩 첨가한 후 차광하여 실온에서 15분간 반응시킨다. 마지막으로 각 well에 반응정지용액 (stop solution)을 100 μL 을 첨가한 후 30분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

sEng의 측정은 효소면역분석법으로 R&D system (Minneapolis, MN, USA)의 Quantikine human sEng kit를 사용하여 측정하였다. 혈장 내에 존재하는 sEng를 결합시키기 위해 anti-Eng antibody-coated wells에 Assay Dilutient RD1S를 각각의 100 μL씩 넣고 여기에 다시 혈장 샘플과 표준 시약 50 μL을 첨가하였다. 이것을 실온에서 2시간 반응시킨 후 결합이 되지 않은 Eng를 제거하기 위하여 4회 세척하고 다시 각 well에 sEng conjugate solution을 200 μL씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시킨 후 4회 세척하였다. 여기에 발색시약 (substrate solution)을 200 μL 첨가한 후 차광하여 실온에서 30분간 반응시키고 마지막으로 각 well에 반응정지용액을 50 μL 을 첨가한 후 30분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

TGF-β1의 측정은 효소면역분석법으로 R&D system (Minneapolis, MN, USA)의 Quantikine human TGF-β1 kit를 사용하여 측정하였다. 혈장 내에 존재하는 TGF-β1를 결합시키기 위해 anti-TGF-β1 antibody-coated wells에 Assay Dilutient RD1-73를 각각의 50 μL씩 넣고 여기에 다시 혈장 샘플과 표준 시약 50 μL을 첨가하였다. 이것을 실온에서 2시간 반응시킨 후 결합이 되지 않은 TGF-β1를 제거하기 위하여 4회 세척하고 다시 각 well에 TGF-β1 conjugate solution을 100 μL씩 첨가하여 실온에서 2시간 반응시킨 후 4회 세척하였다. 여기에 발색시약을 100 μL 첨가한 후 차광하여 실온에서 30분간 반응시키고 마지막으로 각 well에 반응정지용액을 100 μL 을 첨가한 후 30분 이내에 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.

사용한 kit의 최저 측정 농도 (Minimum detectable level)는 IHNA는 0.1-1.0 pg/ml, sEng은 1.0-30.0 pg/ml, TGF-β1은 1.7-15.4 pg/ml 이었다. 측정간 (intraassay) 및 측정자간 (interassay) 변이계수 (coefficient of variation)는 각각 10% 미만이었다.

<실시예 1-3> 통계분석

통계분석을 위해 상용 통계 프로그램인 Statistical Package for Social Sciences version 12.0 (SPSS Inc., Chicago, USA)를 사용하였다. 환자군과 대조군간에 임신부의 연령, 미경산 (nulliparity), 체질량지수 (body mass index; BMI), 수축기와 이완기혈압, 샘플링 주수, 분만 주수, 신생아의 출생시 체중의 통계적 차이는 student's t-test 또는 chi-square test를 사용하였고, 두 군간의 IHNA, sEng, 의 농도 차이에 대한 분석은 Mann-Whiney U test를 사용하였다. 자간전증을 진단하기 위한 각 생화학적 표지물질의 최적의 기준값 (optimal cut-off value)을 결정하기 위해 ROC (receiver operator characteristic) 분석을 이용하였다. 각 생화학적 표지물질의 자간전증 진단에 대한 민감도 (sensitivity), 특이도 (specificity), 양성예측도 (positive predictive value, PPV), 음성예측도 (negative predictive value, NPV), 가성양성률 (false positive rate, FPR), 가성음성률 (false negative rate, FNR)은 EpiMax Table Calculator (http://www.healthstrategy.com/epiperl/epiperl.htm)를 사용하여 측정하였다. 각 생화학적 표지물질의 자간전증 발생 위험률 (odds ratio)과 95% 신뢰구간 (confidence interval)을 계산하였다. P값이 0.05 미만인 경우 통계학적 유의성이 있는 것으로 보았다.

< 실시예 2> 연구 결과

<실시예 2-1> 연구 대상군의 임상적 특성

각 군에 포함된 임신부의 임상적 특성을 [표 1]에 요약하였다. 임신부의 연령과 샘플링 주수는 통계학적으로 유의한 차이를 보이지 않았다(P>0.05). 체질량지수, 미경산부 수, 수축기 혈압, 이완기 혈압, 분만 주수, 신생아의 출생시 체중은 통계학적으로 유의한 차이를 보였다(P<0.05).

<임상적 특성>

<실시예 2-2> 자간전증 진단마커의 농도 분석 결과

자간전증 임신부의 혈장내 IHNA, sEng 그리고 TGF-β1의 농도는 각각 451.4±222.1 pg/ml, 11509.2±6108.2 pg/ml 그리고 2901.1±1308.4 pg/ml로 정상 임신부의 290.1±95.9 pg/ml, 4905.9±1332.1 pg/ml 그리고 4718.6±2371.9 pg/ml와 유의한 차이가 있었다(P<0.001, [표 2]).

또한 혈장내 IHNA+sEng, IHNA+TGF-β1, IHNA+sEng+TGF-β1, sEng/TGF-β1 그리고 (IHNA+sEng)/TGF-β1의 농도는 자간전증 임신부에서 각각 11265.5±5858.8 pg/ml, 3324.1±1410.1 pg/ml, 14111.4±6625.9 pg/ml, 4.6±2.6 그리고 4.8±2.9로 정상 임신부의 5101.1±1310.4 pg/ml, 4989.3±2502.7 pg/ml, 9800.3±2858.6 pg/ml, 1.4±0.9 그리고 1.4±0.9와 유의한 차이가 있었다(P<0.01, [표 2]).

<진단마커의 혈중 농도 비교>

<실시예 2-3> 자간전증 진단마커의 자간전증에 대한 진단적 의의

자간전증을 진단하기 위한 각 생화학적 표지물질의 최적의 기준값을 결정하기 위해 ROC 분석을 한 결과, 아래의 [표 3]과 같이 (IHNA+sEng)/TGF-β1 조합 비율이 생화학적 표지물질들 중 가장 높은 정확도를 보였다(AUC 0.94, 95% CI 0.89-0.98, P<0.001, [표 3]).

<진단마커 및 그 조합의 정확도>

AUC 값이 0.70 이상인 생화학적 표지물질의 각 기준치에 따른 자간전증에 대한 진단의 민감도, 특이도, 양성예측도, 음성예측도, 가성양성률, 가성음성률, 위험률을 아래의 [표 4]에 나타내었다. (IHNA+sEng)/TGF-β1 조합 비율의 기준값을 1.9으로 한 경우 민감도는 89.7%로서 가장 높았으며, 특이도는 80.0%, 양성예측도는 65.0%, 음성예측도는 94.9%, 가성양성률은 20.0%, 가성음성률은 10.3%였다. 게다가 (IHNA+sEng)/TGF-β1 조합 비율이 1.90 이상인 임신부에 대한 자간전증 발병 위험률은 34.7 (95% CI 9.2-131.2, P<0.001)로 생화학적 표지물질 중 가장 높은 위험률을 보였다.

<진단마커의 컷-오프, 민감도, 특이도 등>

Claims (10)

1. 삭제
2. 삭제
3. (a) 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1에 특이적인 항체를 이용하여 생체시료로부터 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1를 정량하는 단계, 및
   (b) 상기 정량된 값으로부터 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 단계를 포함하는
   자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법.
   
4. 제3항에 있어서,
   상기 생체 시료는 혈청 또는 혈장이며, 정량 값은 혈중 농도 값인 것을 특징으로 하는 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 방법.
   
5. 삭제
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7. IHNA를 정량하기 위한 IHNA에 대한 특이적인 항체,
   sEng를 정량하기 위한 sEng에 대한 특이적인 항체, 및
   TGF-β1를 정량하기 위한 TGF-β1에 특이적인 항체를 포함하는
   자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 키트.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 키트는 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값이 자간전증의 진단에의 사용 방법을 교시하는 설명서를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위한 키트.
   
9. 삭제
10. 자간전증 진단에 유용한 정보를 제공하기 위하여
    (a) 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1에 특이적인 항체를 이용하여 생체시료로부터 자간전증 진단마커인 IHNA, sEng 및 TGF-β1를 정량하는 단계, 및
    (b) 상기 정량된 값으로부터 (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 단계를 포함하는
    (IHNA 정량 값+sEng 정량 값)/(TGF-β1 정량 값)의 조합 값을 구하는 방법.