ES2279911T3 - Procedimientos y composiciones para la estabilizacion del peptido natriuretico cerebral (bnp) en muestras de sangre. - Google Patents
Procedimientos y composiciones para la estabilizacion del peptido natriuretico cerebral (bnp) en muestras de sangre. Download PDFInfo
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Abstract
Un procedimiento para estabilizar el péptido natriurético cerebral (BNP) en una muestra de sangre o plasma, que comprende introducir en la muestra una cantidad estabilizadora de al menos un componente estabilizador seleccionado de acetil-leu-leu-arginal (leupeptina), N-(Nalfa-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe (antipaína), H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona (PPACK), D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona (PPRACK), diisopropilfluorofosfato (DFP) y combinaciones de los mismos.
Description
Procedimientos y composiciones para la
estabilización del péptido natriurético cerebral (BNP) en muestras
de sangre.
La presente invención se refiere a
procedimientos, composiciones y equipos para reducir la degradación
proteolítica del péptido natriurético cerebral (BNP), estabilizando
por consiguiente este péptido, en muestras de sangre, tales como
plasma y suero.
El péptido natriurético cerebral (BNP) es un
indicador específico y sensible de insuficiencia cardiaca
congestiva. BNP es una hormona peptídica cardiaca vasorreactiva que
se sintetiza y secreta hacia el torrente sanguíneo principalmente
desde los ventrículos cardiacos. (H. Shimizu y col., 2001, Clinica
Chimica Acta, 305:181-186; H. Shimizu y col., 1999,
Clinica Chimica Acta, 285:169-172). Esta hormona
peptídica promueve la natriuresis y la diuresis, actúa como un
vasodilatador y antagoniza los efectos vasocronstrictores del
sistema
renina-angiotensina-aldosterona.
(A. Goginet-Georges y col., 2000, Clin. Chem. Lab.
Med., 38(6):519-523).
Dado que la concentración plasmática de BNP
aumenta con el deterioro de la función cardiaca, particularmente la
función ventricular, la medición de la concentración de BNP en
sangre es útil para el diagnóstico y pronóstico del infarto agudo
de miocardio (IAM) o de la insuficiencia cardiaca. (E. Morita y
col., 1993, J. Am. Coll. Cardiol., 88:82-91; T.
Tsutamoto y col., 1989, Am. Heart J., 117:599-606;
M. Mukoyama y col., 1990, Lancet, 335:801-802; T.
A. McDonagh y col., 1998, Lancet, 351:9-13; T.
Omland y col., 1996, Circulation, 93:1963-1969; T.
Tsutamoto y col., 1997, Circulation, 96:509-516).
Puesto que la enfermedad cardiaca y la insuficiencia cardiaca son
problemas importantes de salud en todo el mundo, se ha propuesto al
BNP como un marcador bioquímico para usar en la selección de
pacientes para otras investigaciones y/o tratamientos cardiacos. (A.
Goginet-Georges y col., 2000, Clin. Chem. Lab.
Med., 38(6):519-523).
La aplicación de BNP como un marcador de
diagnóstico para identificar pacientes con enfermedad cardiaca, por
ejemplo, disfunción sistólica ventricular izquierda, es complicada
por la baja estabilidad del péptido en las muestras de sangre. (A.
Goginet-Georges y col., 2000, Clin. Chem. Lab. Med.,
38(6):519-523; H. Shimizu y col., 2001,
Clinica Chimica Acta, 305:181-186; H. Shimizu y
col., 1999, Clinica Chimica Acta, 285:169-172; D.
R. Murdoch y col., 1999, Heart, 81:212-213; T. Tsuju
y col., 1994, Clin. Chem., 40(4):672-673).
Tanto el BNP endógeno como las formas sintéticas del péptido son
susceptibles de sufrir descomposición relativamente rápida en
plasma y suero sanguíneos como resultado de la proteolisis. Además,
se produce una rápida degradación de BNP tras la separación del
plasma a partir de sangre completa. Esta degradación progresa
incluso en muestras almacenadas bajo condiciones de refrigeración,
haciendo por ello difícil medir el BNP con precisión en muestras que
no sean muestras de sangre fresca, a menos que la muestra fresca se
congele inmediatamente.
Aunque se han indicado en la técnica enfoques
para estabilizar el BNP en muestras de sangre, ninguno es
completamente satisfactorio, y la mayoría son ineficaces. Por
ejemplo, los intentos para estabilizar el BNP en muestras de sangre
de pacientes han incluido el uso de tubos de recogida de composición
particular (H. Shimizu y col., 1999, Clinica Chimica Acta,
285:169-172); el agregado de EDTA a las muestras de
sangre (D. R. Murdoch y col., 1999, Heart,
81:212-213); y el agregado de una combinación de
aprotinina y benzamidina a las muestras de sangre (T. Tsuju y col.,
1994, Clin. Chem., 40(4):672-673).
El problema de prevenir o reducir
significativamente la degradación de BNP en muestras de sangre es un
problema aún vigente en el área de la hematología y son necesarios
mejores procedimientos y soluciones para estabilizar el BNP. La
presente invención provee una solución a la dificultad existente de
estabilizar BNP para reducir o prevenir su degradación proteolítica
en muestras de sangre.
La Fig. 1 muestra el efecto de inhibidores para
reducir la degradación de BNP nativo (endógeno) en una muestra de
paciente almacenada a 4ºC a través del tiempo. En estos estudios, se
usó PPACK en una concentración de 35 \mug/ml y se usó leupeptina
en una concentración de 50 \mug/ml. En la muestra que contenía
inhibidores, se detectó significativamente más BNP tras
aproximadamente 25 horas de almacenamiento a 4ºC en comparación con
la muestra sin inhibidores.
La Fig. 2 muestra el efecto de inhibidores para
reducir la degradación de BNP exógeno sintético (10.000 pg/ml)
añadido en una combinación de plasmas humanos (Intergen, Milford,
MA). El BNP en plasma humano permaneció estable durante casi 30
días en presencia de inhibidores en comparación con el plasma con
agregado de BNP en ausencia de inhibidores. En estos estudios se
usó la siguiente combinación de inhibidores: AEBSF, es decir,
[4-(2-aminoetil)-bencensulfonilfluoruro]),
(200 \mug/ml), antipaína (100 \mug/ml), benzamidina (14 mM) y
PPACK (35 \mug/ml).
En uno de sus aspectos, la presente invención
provee un procedimiento para estabilizar BNP en una muestra de
fluido corporal, particularmente, una muestra basada en sangre, tal
como plasma o suero, de preferencia una muestra de plasma. De
acuerdo con la invención, la estabilización de BNP reduce su
degradación por parte de proteasas endógenas en la muestra. El
procedimiento de la invención comprende la adición de componentes
estabilizadores a las muestras de sangre que contienen BNP, ya sea
BNP añadido de manera exógena o BNP endógeno, o a tubos o
recipientes que recibirán muestras de sangre que contienen BNP. Los
componentes estabilizadores comprenden uno o más compuestos
inhibidores de proteasas que reducen, protegen contra, o previenen
la degradación proteolítica de BNP. Los compuestos inhibidores
incluyen
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína) y
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK), así como también
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK) y diisopropilfluorofosfato (DFP). De acuerdo con esta
invención, los compuestos pueden usarse solos o en combinación. Las
combinaciones pueden comprender una mezcla de dos, tres, o más
componentes estabilizadores. Además, el inhibidor
4-(2-aminoetil)bencenesulfonilfluoruro
(AEBSF) puede usarse solo o en combinación con los inhibidores
anteriores. Los ejemplos de combinaciones de inhibidores para
estabilizar BNP de preferencia incluyen leupeptina y PPACK;
antipaína y PPACK; leupeptina y PPRACK; antipaína y PPRACK;
leupeptina, antipaína y PPACK; y leupeptina, antipaína, PPRACK y
DFP. Los inhibidores de preferencia, especialmente para aplicaciones
prácticas, son PPACK o PPRACK. Los inhibidores para estabilizar BNP
que se describen este documento ofrecen mejor estabilización de BNP
con relación a los compuestos usados previamente.
En otro aspecto, la invención provee una
composición estabilizada de BNP que comprende componentes
inhibidores estabilizadores, solos o en combinación. Más
específicamente, la composición puede comprender componentes
seleccionados de PPACK solo; antipaína sola, o leupeptina sola; una
combinación de leupeptina y PPACK; una combinación de antipaína y
PPACK; una combinación de leupeptina y antipaína; una combinación de
leupeptina, antipaína y PPACK; y una combinación de leupeptina,
antipaína, PPACK y DFP, o análogos, variantes, o derivados de los
mismos, o inhibidores que están estructural y/o funcionalmente
relacionados con los mismos. Por ejemplo, cuando se usa PPACK,
deberá entenderse siempre que PPRACK puede usarse también solo o en
las combinaciones mencionadas anteriormente. De preferencia, la
combinación estabilizadora de componentes incluye leupeptina y
PPACK (o PPRACK). Los componentes estabilizadores tal como se
describen en este documento pueden agregarse a, es decir, añadirse
en, una muestra de sangre para estabilizar el BNP endógeno en la
muestra, y/o para estabilizar BNP exógeno que puede también
añadirse en la muestra. Los procedimientos y composiciones descritos
en este documento ofrecen una mejora significativa de la
estabilidad de BNP en muestras de sangre, que incluyen muestras de
plasma y de suero (por ejemplo, el Ejemplo 5).
En otro de sus aspectos, la presente invención
provee un procedimiento para estabilizar muestras de sangre que
contienen BNP agregando directamente los componentes inhibidores
mencionados anteriormente, y combinaciones de los mismos, a
muestras de sangre recogidas, de preferencia muestras de plasma,
previo a, en el momento de, o enseguida tras la recogida y previo a
la realización de pruebas en un laboratorio o clínica, o previo al
almacenamiento. Estos componentes sirven como aditivos inhibidores
de BNP para muestras frescas, así como para muestras descongeladas,
particularmente muestras frescas descongeladas, de sangre, plasma o
suero. Resulta de preferencia el uso de PPACK en una composición
acuosa para estabilizar BNP en plasma fresco o descongelado.
En otro aspecto más, la presente invención
provee un tubo o recipiente para recoger sangre, tal como un tubo
de vacío (por ejemplo Vacutainer^{TM}) usado en la recogida de
sangre completa, que comprende uno, o una combinación de, por
ejemplo, un cóctel de los componentes inhibidores seleccionados de,
por ejemplo, antipaína, leupeptina, PPACK, PPRACK y DFP. Las
muestras de sangre, particularmente, muestras que contienen BNP, se
recogen en tubos y recipientes para sangre que tienen en su
interior uno o más de los inhibidores descritos. En este aspecto,
los componentes inhibidores previamente añadidos, tales como
leupeptina y PPACK, están presentes para estabilizar BNP en una
muestra de sangre o plasma recogida inmediatamente tras la
introducción de la muestra en el recipiente o tubo.
En otro aspecto, la presente invención provee
controles estables de plasma para la determinación de BNP. De
acuerdo con este aspecto de la invención, los controles pueden
generarse añadiendo una cantidad fijada de BNP añadido de manera
exógena, por ejemplo, un BNP producido por técnicas recombinantes o
una forma sintética de BNP, tal como BNP-32, (D. R.
Murdoch y col., 1999, "Disparity between studies of the stability
of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous
peptide", Heart, 81:212), en una matriz basada en sangre humana,
por ejemplo, una matriz plasmática, en la que la matriz contiene uno
o más de los componentes inhibidores añadidos de acuerdo con la
presente invención, por ejemplo, leupeptina, antipaína, PPACK,
PPRACK, DFP, o combinaciones de los mismos. Este aspecto de la
invención soluciona dificultades previas en la preparación de
controles de matriz plasmáticos por causa de la rápida degradación
por las proteasas endógenas del BNP añadido, durante la preparación
y el procedimiento de asignación del valor para tales controles.
En otro aspecto más, la presente invención
incluyen la introducción de al menos uno, o un cóctel de una
combinación, de los componentes inhibidores antipaína, leupeptina,
PPACK, PPRACK, y/o DFP dentro de muestras de sangre, que incluyen
muestra de plasma y de suero, que contienen BNP. La invención provee
composiciones estables que comprenden BNP y los componentes
inhibidores. Como un ejemplo de preferencia, la inclusión de una
combinación de leupeptina y PPACK a matrices basadas en sangre
previo al agregado de BNP exógeno, por ejemplo, sintético, provee
una preparación estable de material de control, por ejemplo para
controles comerciales de BNP que son estables en una matriz de
plasma humano o animal.
Tras leer la descripción detallada de la
invención se apreciarán otros aspectos, características y ventajas
de la presente invención.
La presente invención se refiere a
procedimientos y composiciones que comprenden uno o más componentes
inhibidores de proteasas que inhiben o reducen la degradación de la
hormona peptídica cardiaca BNP en muestras de sangre,
particularmente muestras de plasma y suero. La degradación de BNP
durante la recogida de la muestra, almacenamiento y durante las
pruebas puede causar resultados falsamente disminuidos o pruebas
negativas, y una clasificación de las muestras errónea, para
muestras de pacientes sometidas a pruebas clínicas o médicas. De
acuerdo con la presente invención, la adición a la sangre,
particularmente plasma sanguíneo, de uno o más de los componentes
estabilizadores de BNP determinados recientemente como se describen
en este documento, reduce significativamente o inhibe la
degradación de BNP y permite una interpretación más precisa y fiable
de las muestras. Los procedimientos y composiciones que incluyen
materiales estabilizadores de BNP de acuerdo con la presente
invención proveen mediciones más precisas de la concentración de
BNP en ensayos rutinarios para el diagnóstico y gestión de
pacientes a los que se les realizan las pruebas, o pacientes en los
que se sospecha la presencia de insuficiencia cardiaca y/o
enfermedad cardiaca.
Los componentes que se ha visto que tienen
propiedades estabilizadoras de BNP superiores, solos o en
combinación, por ejemplo, como un cóctel de más de un componente,
de acuerdo con esta invención incluyen los inhibidores de proteasas
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína), (Sigma Aldrich, St. Louis, MO; Calbiochem, San Diego,
CA); y
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK), (Bachem-Penninsula Labs, San Carlos, CA),
así como
H-D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK), (Calbiochem, San Diego, CA) y diisopropilfluorofosfato
(DFP), (Calbiochem, San Diego, CA). Además, el inhibidor
4-(2-aminoetil)bencensulfonilfluoruro
(AEBSF), o compuestos estructuralmente relacionados con AEBSF,
pueden usarse solos o en combinación con los inhibidores
anteriores. Estos componentes estabilizadores, o composiciones que
comprenden estos componentes, pueden usarse para estabilizar el BNP
endógeno en muestras de sangre, así como BNP que se añade de manera
exógena a, por ejemplo, añadido dentro, de muestras de sangre.
De acuerdo con la presente invención, uno o más
de los inhibidores anteriores estabiliza(n) el BNP y
reduce(n) o previene(n) su degradación por proteasas
en una muestra de sangre (plasma). Recientemente se ha descubierto
que PPACK solo, y en combinación con antipaína, leupeptina o ambas,
mejora notablemente la estabilidad de BNP. Cuando se añade
directamente a las muestras de plasma sanguíneo de animales
(mamíferos), de preferencia seres humanos, los inhibidores,
preferiblemente, leupeptina y PPACK, o antipaína y PPACL, en
combinación, estabilizaron el BNP en las muestras a temperatura
ambiente y a 4ºC, incluso tras repetidas congelaciones y
descongelaciones. (Ejemplo 1).
La capacidad estabilizadora de los inhibidores
anteriores se determinó en base a una evaluación de la estructura
del BNP, que comprende regiones que podrían ser específicamente
sensibles a proteolisis, por ejemplo, una región de la porción
circular de BNP-32 maduro que comprende los restos
-Phe-Gly-Arg-. En consecuencia, los
inhibidores de la presente invención, por ejemplo, PPACK y PPRACLK
sin limitación, con similitud estructural con los restos
Phe-Gly-Arg que comprende el BNP,
son especialmente adecuados para estabilizar el BNP. Sin el deseo
de estar ligado a la teoría, tener una similitud estructural con BNP
provee a un inhibidor una función estabilizadora de BNP
preferiblemente mejor. Además, en los materiales de control y
composiciones estabilizadas como se describe a continuación en este
documento, puede modificarse el BNP para proteger a sus restos
arginina (Arg) intrínsecos y fragmentos relacionados de la
degradación, por ejemplo, por reemplazo del resto aminoácido
natural involucrado en la degradación de BNP-32 por
moléculas que puedan aumentar la resistencia de BNP a la
proteolisis. Como ejemplo no limitante, un BNP más estable puede
contener D-Arg en vez de L-Arg
nativa. Además, pueden diseñarse compuestos estabilizadores de BNP
más eficaces usando este fundamento.
La presente invención también abarca
procedimientos o composiciones estabilizadoras que además comprenden
uno o más análogos, variantes, o derivados de PPACK para
estabilizar el BNP. Un ejemplo de un compuesto relacionado con
PPACK que es adecuado para el uso de acuerdo con la presente
invención es PPRACK
(D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona),
(Calbiochem, San Diego, CA).
En una forma de realización particular
relacionada de la presente invención, los inhibidores
diisopropilfluorofosfato (DFP), (Calbiochem, San Diego, CA) y
PPRACK han demostrado estabilizar el BNP tan eficazmente como la
antipaína, leupeptina y PPACK. (Ver, Ejemplo 5, Tabla 11). En
consecuencia, la invención abarca DFP y/o PPRACK usados solos o en
combinación con uno o más de antipaína, leupeptina y PPACK en las
composiciones y procedimientos descritos en este documento.
Esta invención abarca numerosas aplicaciones
prácticas, que incluyen, (i) añadir los inhibidores de degradación
de BNP descritos en el procedimiento de recogida de muestras de
sangre o plasma para prevenir la degradación del BNP de la muestra
durante las manipulaciones previas a las pruebas; (ii) añadir los
inhibidores a muestras de sangre o plasma tras la recogida para
prevenir la degradación de BNP durante la preparación para las
pruebas y durante las pruebas; y (iii) añadir los inhibidores al
plasma o una base exenta de sueros para la preparación de controles
o combinaciones para decisiones médicas usando BNP endógeno o
sintético. Estas aplicaciones se describirán a continuación en este
documento.
En una forma de realización de acuerdo con esta
invención, se provee un procedimiento en el que se introducen uno o
más de los componentes estabilizadores leupeptina, antipaína, PPACK,
PPRACK y/o DFP en muestras de sangre humana o de animal para
estabilizar el BNP en las mismas. De preferencia, la muestra es una
muestra de plasma. De más preferencia, la muestra es una muestra de
plasma humano. También está prevista la estabilización de BNP en
muestras de sangre de animales (mamíferos) diferentes de seres
humanos, por ejemplo, perros, gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas
o cerdos, por ejemplo para aplicaciones veterinarias.
Los componentes estabilizadores de BNP de la
presente invención incluyen los inhibidores de proteasas leupeptina,
antipaína, PPACK, PPRACK, y/o DFP, que se usan solos o en
combinación, para estabilizar el BNP, por ejemplo, reducir o
eliminar su degradación, en una muestra de sangre o plasma. Aunque
cada componente inhibidor muestra eficacia para estabilizar el BNP
en muestras de plasma a través del tiempo, las combinaciones de los
componentes inhibidores, tales como, por ejemplo, una combinación
de leupeptina y PPACK, o una combinación de antipaína y PPACK, dan
efectos estabilizadores de BNP significativos a través del tiempo a
temperatura ambiente y a 4ºC, y tras el descongelamiento de
muestras congeladas. (Ver, por ejemplo, Ejemplos 1-3
y 7). Por ello, los procedimientos y composiciones de la presente
invención permiten analizar de manera precisa muestras de sangre
que contienen BNP, obteniéndose valores fiables para BNP, bajo
condiciones habituales en la práctica médica, tales como en
clínicas, laboratorios clínicos, salas de hospitales y consultorios
médicos. Además, la presente invención provee composiciones y
procedimientos ventajosos para permitir una recogida de sangre y
transporte más eficaz y fácil de muestras de sangre a una clínica o
laboratorio para realizar análisis de BNP.
Para uso como un componente estabilizador en
muestras de sangre y plasma, los inhibidores de proteasas como se
describen en este documento están presentes en la muestra en una
cantidad estabilizadora de BNP. Por ejemplo, y sin limitación,
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina) está presente en una muestra en una cantidad desde
aproximadamente 0,5 \mug/ml hasta aproximadamente 55 \mug/ml,
de preferencia desde aproximadamente 5 \mug/ml hasta
aproximadamente 50 \mug/ml y de más preferencia desde 45
\mug/ml hasta aproximadamente 55 \mug/ml;
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK) o
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK) está presente en una muestra en una cantidad desde
aproximadamente 0,35 \mug/ml hasta aproximadamente 38 \mug/ml,
de preferencia desde aproximadamente 3,5 \mug/ml hasta
aproximadamente 35 \mug/ml, y de más preferencia desde
aproximadamente 32 \mug/ml hasta aproximadamente 38 \mug/ml; y
antipaína está presente en una muestra en una cantidad desde
aproximadamente 0,5 \mug/ml hasta aproximadamente 55 \mug/ml,
de preferencia desde aproximadamente 5 \mug/ml hasta
aproximadamente 50 \mug/ml, y de más preferencia desde
aproximadamente 45 \mug/ml hasta aproximadamente 55 \mug/ml.
DFP está presente en una muestra de preferencia en una cantidad
desde aproximadamente 2 \mug/ml hasta aproximadamente 200
\mug/ml; de preferencia, en una cantidad de aproximadamente 18
\mug/ml (100 \muM).
Otra forma de realización de la invención
incluye una composición estabilizada que comprende los componentes
estabilizadores de BNP descritos en este documento, solos o en
combinación, en una matriz de plasma, de preferencia, una matriz de
plasma humano. La composición estabilizada, que es adecuada para
usar como un control para uso clínico y médico, comprende uno o más
de leupeptina, antipaína y/o PPACK que reducen o previenen la
degradación proteolítica del BNP en la muestra, por ejemplo, la
matriz de plasma. Además, la composición estabilizada puede
comprender DFP y/o PPRACK solo, en combinación entre ellos, o en
combinación con otros inhibidores de acuerdo con esta invención.
Cuando se usan combinaciones de componentes estabilizadores, la
composición estabilizadora puede comprender, como ejemplos no
limitantes, leupeptina y PPACK en combinación; leupeptina y
antipaína en combinación; antipaína y PPACK en combinación;
antipaína, leupeptina y PPACK en combinación; leupeptina y PPRACK
en combinación; antipaína y PPRACK en combinación; antipaína,
leupeptina y PPRACK en combinación; DPF y PPACK en combinación; DFP
y PPRACK en combinación; DFP y antipaína en combinación; DFP y
leupeptina en combinación; DFP, antipaína, leupeptina y PPACK en
combinación; DFP, antipaína, leupeptina y PPRACK en combinación;
DFP, antipaína, leupeptina, PPACK y PPRACK en combinación, de
manera de proveer un cóctel de estos ingredientes
estabilizadores.
Los ingredientes estabilizadores pueden
formularse o combinarse solos o juntos, liofilizados si se desea, o
disueltos en solución acuosa o tampón previo al uso, e introducirse
como un aditivo a las muestras de laboratorio recién preparadas.
Como alternativa, el o los ingredientes estabilizadores que
comprenden uno o más de antipaína, leupeptina, PPACK, PPRACK, o
DFP, pueden proveerse solos o en combinación directamente como una
solución acuosa, de la que puede agregarse una cantidad
estabilizadora de BNP eficaz a la muestra de plasma o sangre, como
sea necesario o deseado, previo a la medición inicial de BNP. De
preferencia, aunque sin limitación, el/los inhibidor(es) de
acuerdo con la presente invención se agregan dentro de
aproximadamente 5 a 30 minutos o menos tras la separación del
plasma de la sangre completa por centrifugación; de preferencia las
muestras se congelan para el almacenamiento. Si el tipo de muestra
a usar es suero, los inhibidores se agregan al tubo de recogida
previo a la extracción de sangre completa ya que el proceso de
coagulación destruye el BNP.
Los componentes estabilizadores pueden proveerse
en forma concentrada, de forma tal que la preparación concentrada
de inhibidores de proteasas pueda agregarse simplemente con un
gotero, por ejemplo a una muestra de sangre o plasma sin causar una
dilución significativa de la sangre o plasma. En consecuencia, los
componentes estabilizadores pueden proveerse en un vial o
recipiente con gotero, por ejemplo, un recipiente adecuado para
recibir un gotero o un dispositivo similar, incluso una jeringa,
para facilitar la administración de los componentes dentro de la
muestra. De preferencia, los componentes están en combinación, por
ejemplo, una combinación de leupeptina y PPACK, o una combinación
de antipaína y PPACK, en la formulación concentrada que se añadirá a
la muestra. Además, puede incluirse un vial o recipiente que
contenga una composición inhibidora de proteasas de la invención,
con gotero, en un equipo para llevar a cabo un ensayo de detección
de BNP en muestras de sangre o plasma. Tal aspecto para proveer BNP
estable es particularmente ventajoso para aplicaciones comerciales,
ya que el plasma se separa rutinariamente en intervalos variables
previo a la medición analítica real de BNP como un analito en la
muestra del paciente.
Como guía, pueden proveerse el/los
inhibidor(es) concentrado(s) en una concentración de
aproximadamente 5-10 mg/ml en forma congelada, como
ejemplo no limitante; o como un polvo seco, con aproximadamente
5-10 mg/vial como un ejemplo no limitante, de forma
tal de permitir la simple dilución hasta aproximadamente
5-10 mg/ml. Una(s) solución(es) de
5-10 mg/ml representa(n) típicamente un
material de partida concentrado 100 a 200 veces para agregarse
posteriormente a muestras que contienen BNP, por ejemplo, en una
relación de 1 volumen a 99-199 volúmenes.
En otra forma de realización, los materiales de
control, tales como combinaciones de plasmas para decisión médica,
abarcan materiales elaborados en la misma matriz basada en sangre,
por ejemplo, plasma, como la muestra sometida a análisis, por
ejemplo, una muestra de plasma humano. Tales materiales de control
deben ser precisos y contener componentes estables, ya que sirven
como patrones frente a los que se toman decisiones clínicas
relacionadas con el tratamiento y resultados de los pacientes. A
manera ilustrativa, los controles tienen valores o niveles
establecidos de materiales incluidos, tales como BNP; los valores o
niveles establecidos corresponden a un valor de corte, por ejemplo,
un valor que se usa para tomar determinaciones o decisiones médicas
que involucran a un paciente, por ejemplo, la cantidad o nivel de
BNP presente en la muestra de un paciente. Pueden prepararse
controles que tengan intervalos particulares de niveles establecidos
de BNP basados en puntos de corte particulares para diversos usos,
por ejemplo, para seleccionar una muestra de un paciente para
determinar el riesgo de ataque cardiaco, infarto cardiaco, otra
enfermedad cardiaca y similares; para controlar el tratamiento de
un paciente cardiaco; y/o para clasificar el grado o la gravedad de
la enfermedad cardiaca de un paciente cardiaco.
En esta forma de realización de la presente
invención, los componentes estabilizadores, por ejemplo, leupeptina,
antipaína, PPACK, PPRACK, DFP y combinaciones de los mismos, son
ventajosos para producir tales materiales de control que incluyen
BNP en una matriz de sangre para prevenir o reducir
significativamente la degradación de BNP con el tiempo, y/o tras
congelar y descongelar. El uso de uno o más de los inhibidores
estabilizadores de BNP de acuerdo con la presente invención para
preparar materiales de control permite la elaboración de grandes
cantidades de muestras de control (por ejemplo, en el orden de
miles) usando grandes cantidades de material (por ejemplo, plasma).
Además, estos materiales de control pueden almacenarse y permanecer
estables a lo largo del tiempo. Además, los valores del BNP, tales
como BNP añadido o agregado exógenamente, no varían
significativamente del valor establecido inicial o punto de corte
del control de modo que los valores de lectura permanecen
virtualmente sin cambios de manera constante y fiable en los
materiales de control almacenados. De acuerdo con esta forma de
realización, pueden agregarse los inhibidores, solos o en
combinación, a las matrices basadas en sangre (por ejemplo, plasma)
previamente o en el momento del agregado del BNP exógeno (por
ejemplo, BNP sintético), para preparar los materiales de control
para usar en análisis y cuantificación de BNP en muestras de sangre
de pacientes.
En otra forma de realización, esta invención
provee una composición de componentes estabilizadores, a saber, uno
o más de los inhibidores leupeptina, antipaína, PPACK, PPRACK, DFP,
o combinaciones de los mismos, presentes en un tubo de recogida de
sangre o tubo vacutainer para usar en el momento de la recogida de
sangre completa. Con la adición de los componentes estabilizadores
previo a la recogida de sangre, cualquier BNP presente en la
muestra se estabiliza en el momento de la recogida. La composición
estabilizadora de la invención puede comprender los inhibidores de
proteasas como los descritos, por ejemplo, leupeptina, antipaína,
PPACK, PPRACK y/o DFP solos o en combinación en el tubo de
recogida, ya sea en una pequeña cantidad de solución acuosa
concentrada, o en forma liofilizada que se disuelve tras el
agregado de la muestra de sangre, o que se disuelve con una pequeña
cantidad de solución acuosa justo antes de la recogida de la muestra
de sangre. Con el fin de evitar dilución de la muestra recogida, se
recomienda usar un volumen de la solución de inhibidor(es)
concentrada que no exceda el 1% del volumen de la muestra. Por
ejemplo, no debería agregarse más de 60 \mul de
inhibidor(es) concentrado(s), o mezcla de los mismos,
a un tubo de recogida típico de 6 ml.
En una forma de realización particular, se
agrega una combinación de leupeptina y PPACK a matrices basadas en
sangre, por ejemplo, plasma humano, previo al agregado de BNP
exógeno sintético para preparar combinaciones de materiales de
control, combinaciones para decisión médica, y similares. Las
combinaciones para controles y decisiones médicas pueden también
prepararse usando una combinación de componentes estabilizadores y
BNP endógeno.
En otra de sus formas de realización, la
presente invención incluye un procedimiento para estabilizar
muestras de sangre que contienen BNP añadiendo directamente los
componentes inhibidores, y combinaciones de los mismos, a las
muestras de sangre recogidas, de preferencia muestras de plasma,
previo, al mismo tiempo, o enseguida tras la recogida y previamente
a la realización de pruebas en una clínica o laboratorio. Estos
componentes sirven como aditivos inhibidores de BNP para muestras
frescas, así como para muestras descongeladas, particularmente,
muestras frescas descongeladas, de sangre, plasma o suero. Resulta
de preferencia el uso de una combinación de leupeptina y PPACK, o
leupeptina y PPRACK, en una composición acuosa para estabilizar BNP
en plasma fresco o descongelado.
Se ha visto que algunas muestras tienen
diferente agresividad hacia el BNP de modo que el BNP se degrada muy
rápidamente. Esto podría deberse a la descomposición inusualmente
rápida de BNP en ciertas series de muestras como resultado de
proteasas más activas o más fuertes presentes en una muestra frente
a otra. Por ejemplo, como se muestra en la Tabla 1, una muestra de
un paciente exhibió una degradación proteolítica agresiva de BNP (es
decir, pérdida >50% dentro de las 24 horas tras el almacenamiento
a 4ºC); sin embargo, con la adición de proteasas de acuerdo con la
presente invención, tal proteolisis se redujo
significativamente.
| *: \begin{minipage}[t]{145mm} Esta muestra representa una muestra humana de Insuficiencia Cardiaca Congestiva (CHF), Asociación Cardiológica de Nueva York (NYHA) clase III de ProMedDx (Norton, MA).\end{minipage} |
Por consiguiente, el agregado de
inhibidor(es) a una muestra se realiza de preferencia lo
antes posible (por ejemplo, dentro de minutos; de preferencia
dentro de 5 minutos o menos) tras la recogida. El uso de los
inhibidores de acuerdo con la presente invención proporciona buena
recuperación (por ejemplo, aproximadamente 90%) de BNP exógeno en
plasma humano almacenado a temperatura ambiente (aproximadamente
20ºC) durante aproximadamente 44 horas. Además, la siguiente Tabla
2 muestra una recuperación de dosis de BNP sintético (2000 pg/ml)
añadido en muestras de plasma humano (Intergen), con y sin
leupeptina (50 \mug/ml) y PPACK (35 \mug/ml) como inhibidores
añadidos.
Sin embargo, para muestras con tasas de
degradación de BNP mayores, un tiempo de almacenamiento adecuado
puede ser mucho más corto. Por ello, el almacenamiento de muestras
(y BNP) es de preferencia durante un tiempo que minimiza la
exposición de BNP a temperaturas superiores a 0ºC inclusive en
presencia de inhibidor(es).
En otro aspecto, la presente invención provee
controles de plasma estables para la determinación de BNP. De
acuerdo con este aspecto de la invención, los controles pueden
elaborarse añadiendo una cantidad fijada de BNP añadido
exógenamente, por ejemplo, un BNP producido por técnica recombinante
o una forma sintética de BNP, tal como BNP-32, (D.
R. Murdoch y col., 1999, "Disparity between studies of the
stability of BNP in blood: comparison of endogenous and exogenous
peptide", Heart, 81:212), en una matriz basada en sangre humana,
por ejemplo una matriz de plasma, en el que la matriz contiene uno
o más de los componentes inhibidores añadidos de acuerdo con la
presente invención, es decir, leupeptina, antipaína y PPACK, o
combinaciones de los mismos. Esta característica de la invención
soluciona dificultades previas en la preparación de controles de
matriz de plasma debidas a la rápida degradación del BNP añadido
por las proteasas endógenas durante la preparación y procedimiento
de asignación de valor para tales controles. Con uno o más de los
componentes inhibidores y estabilizadores, por ejemplo, leupeptina,
PPACK (o PPRACK), en la muestra de matriz de plasma, la muestra ha
demostrado estabilidad, por ejemplo, a 4ºC durante al menos 17
horas, sin pérdida de actividad.
Por ejemplo, la Tabla 3 a continuación presenta
los resultados de estabilidad de BNP-32 sintético
agregado a plasma humano normal que contenía leupeptina (50
\mug/ml) y PPACK (35 \mug/ml) de acuerdo con la invención:
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 4 muestra que a temperatura ambiente
(TA), (22ºC), la estabilidad del BNP-32 en la
muestra de plasma que contenía la combinación de inhibidores como
se describió anteriormente con respecto a la Tabla 3, fue sólo
ligeramente inferior a su estabilidad a 4ºC.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se realizaron experimentos para probar la
eficacia de los compuestos inhibidores estabilizadores de BNP como
los descritos en este documento, solos o en combinación, usando un
inmunoensayo para detectar BNP-32 sintético en las
muestras.
Los experimentos descritos en este Ejemplo
probaron la estabilidad del BNP-32 sintético en
plasma. Para realizar estos experimentos, se agregaron al
(añadieron dentro del) plasma humano normal, inhibidores de
proteasas, seguidos por la adición de una cantidad conocida de BNP.
Como control se usó plasma humano normal sin inhibidores añadidos.
La señal generada por el BNP presente en las muestras de plasma con
y sin inhibidores se midió inmediatamente tras ser añadidos y tras
el almacenamiento de las muestras a 4ºC.
Para generar una señal analítica para
cuantificar la concentración de BNP en la muestra, se usaron dos
anticuerpos monoclonales específicos para BNP (Shionogi & Co.,
LTD, Osaka, Japón; EP542255A1/B1; JP 3297392). El primer anticuerpo
se marcó con éster de acridinio (EA) y el segundo anticuerpo se
marcó con biotina. Los dos anticuerpos se unieron a las moléculas
de BNP presentes en las muestras de plasma para formar un complejo;
el complejo formado fue capturado por medio de partículas
paramagnéticas (PMP) recubiertas con estreptavidina. Las PMP se
separaron mediante un campo magnético y se lavaron para lavar el
material unido de manera no específica. Los complejos
BNP-EA retenidos en las PMP se trataron con solución
alcalina para producir una señal quimioluminiscente que fue
proporcional a la cantidad de BNP capturado; la señal se midió en
unidades de luz relativas o "URL". El ensayo se llevó a cabo
en un sistema quimioluminiscente automatizado ADIVA: Centaur™ (Bayer
Corporation, Tarrytown, NY) usando reactivos para detección de BNP,
tales como los que se han descrito. (Por ejemplo, B. Bluestein y
col., 2002, "Development of an automated test for BNP as an aid in
the diagnosis and evaluation of CHF on the Bayer ADVIA Centaur
ACS", Clinical Chemistry, 48(S6):A85, Abstract C37). Los
resultados de estos experimentos se presentan en la Tabla 5.
En la Tabla 5, los patrones de control
(S1-S7) se congelaron en tampón fosfato hasta su
uso. Estos patrones se prepararon gravimétricamente añadiendo BNP
sintético dentro de solución tampón fisiológica. La columna 1 de la
Tabla 5 indica las muestras probadas: Patrones,
S1-S7; Combinación de Plasmas Humanos de Intergen
(IHPP), disponible comercialmente en Intergen (Milford, MA), que
comprende plasma normal recogido en EDTA de donantes humanos sanos
y con pruebas negativas para el virus de la hepatitis B, virus de la
hepatitis C y VIH por medio de procedimientos aprobados por la
FDA; inhibidor AEBSF (es decir,
[4-(2-aminoetil)bencensulfonilfluoruro]);
inhibidor antipaína; inhibidor benzamidina; inhibidor PPACK; y
Combinación de Plasmas KCBB (Kansas City Blood Bank), que
comprendía plasma normal con EDTA combinado de donantes humanos
sanos y con pruebas negativas para el virus de hepatitis B, virus
de la hepatitis C y VIH por medio de procedimientos aprobados por
la
FDA.
FDA.
La columna 2 de la Tabla 5 indica la
concentración de BNP, [BNP], si está presente. Las columnas
3-8 de la Tabla 5 muestran el perfil de estabilidad
del BNP en las muestras de plasma e indican los tiempos en que se
ensayaron las muestras para BNP. "ULR" indica unidades de luz
relativa o cuentas de fotones como se cuantifican en el ensayo. La
columna 9 de la Tabla 5 indica el porcentaje de señal
recuperada.
La Tabla 5 anterior presenta datos de
comparación de dos muestras de plasma, plasma de Intergen y plasma
de KCBB. Se añadió a muestras de plasma una dosis extremadamente
alta de BNP sintético con el fin de facilitar el control de la
concentración de BNP. El plasma con BNP, pero sin inhibidores
añadidos, sirvió como un control negativo. En las muestras de KCBB
sin inhibidores, el BNP fue prácticamente indetectable tras 72 horas
de almacenamiento; sin embargo, el mismo plasma con inhibidores
demostró sólo una disminución gradual de la concentración de BNP,
es decir, hasta aproximadamente 92% de su valor inicial tras la
primera semana de almacenamiento. Se probó la potencia de los
inhibidores individuales sólo para IHPP. PPACK pareció ser el más
potente de los inhibidores probados y proveyó un grado de
protección suficiente para BNP exógeno durante al menos 3 días, es
decir, se recuperó aproximadamente 95,9% de BNP. La antipaína
también demostró buena capacidad protectora (recuperación de
aproximadamente 90% tras 3 días de almacenamiento). En esta serie de
experimentos la actividad de antipaína duró más tiempo que la de
PPACK. El efecto de antipaína pudo observarse durante 4 semanas,
mientras que la actividad de PPACK estuvo esencialmente ausente.
Sin embargo, como apreciarán los técnicos expertos, no es poco
común que los inhibidores sean inestables en algunas muestras de
sangre; por consiguiente la actividad inhibidora de inhibidores
típicamente buenos, por ejemplo, PPACK, puede deteriorarse con el
tiempo en algunas muestras de plasma, pero no en todas las
muestras.
muestras.
Los hallazgos anteriores, junto con la dinámica
de las diferencias de muestras de sangre, determinan que una
combinación de antipaína y PPACK es muy adecuada en la presente
invención, y puede resultar deseada en algunos casos en vez de un
solo inhibidor. Pero para fines prácticos, PPACK o antipaína solos
proveerán también una estabilidad aceptable al BNP. Dado que la
antipaína generalmente exhibe un espectro de actividad similar al de
leupeptina, no se incluyó leupeptina en otras pruebas. (Ver Tabla 7,
Ejemplo 2).
La Tabla 6 a continuación presenta datos que
muestran que PPACK solo estabilizó satisfactoriamente el BNP en una
muestra a un nivel que es aceptable para reducir o inhibir la
degradación de BNP. Por ello, de acuerdo con la presente invención,
la actividad inhibitoria de una combinación de inhibidores, con
PPACK incluido en la mezcla, permite una longevidad de la actividad
inhibitoria para estabilizar el BNP.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Este Ejemplo presenta datos de ensayos
adicionales realizados para evaluar el efecto de los componentes
inhibidores PPACK, leupeptina y antipaína, solos y en combinación,
en la estabilidad de BNP-32 sintético en plasma a lo
largo del tiempo. Se añadió BNP-32 sintético a las
muestras de plasma y se almacenaron a 4ºC durante diversos períodos
de tiempo, es decir, Día 0, 24 horas y aproximadamente 90 horas,
previo a la realización de la prueba. El ensayo para detectar y
cuantificar la presencia de BNP en un momento particular fue el
mismo que se describió en el Ejemplo 1. Se usaron muestras de
plasma humano de Intergen (PHI) que contenían EDTA (K_{2} EDTA o
K_{3} EDTA, en una cantidad de aproximadamente de 1,8 g /l de
sangre, o equivalente a aproximadamente 10,8 mg por tubo de
recogida de 6 ml), (Intergen Nº 01D1707, Intergen, Milford, MA). Los
patrones fueron como los descritos en el Ejemplo 1. Los resultados
de los experimentos realizados en este Ejemplo se presentan en la
Tabla 7.
\newpage
Como puede verse a partir de los resultados
presentados en la Tabla 7, la inclusión de los componentes
estabilizadores, leupeptina, antipaína, o PPACK (50 \mug/ml solos
o juntos, mejoró notablemente la estabilidad del BNP tras el
almacenamiento refrigerado de las muestras de plasma a 4ºC durante
diferentes cantidades de tiempo, seguido por la realización de las
pruebas en las muestras. En particular, la última columna en la
Tabla 7 muestra los cambios totales en la concentración de BNP
durante el estudio de estabilidad. Un número negativo, por ejemplo,
-14,3% en el caso de antipaína, indica que la pérdida de BNP resultó
del 14,3% de la cantidad inicial de BNP. Aunque los resultados
avalan el uso de PPACK solo para estabilizar BNP en las muestras, la
estabilidad de BNP puede mejorar de acuerdo con esta invención
combinando uno o más de los inhibidores descritos en este
documento, especialmente para la estabilidad a largo plazo como está
representada en la Tabla 7 anterior.
Los experimentos realizados en este Ejemplo
evalúan la estabilidad del BNP endógeno en muestras de plasma (es
decir, plasma humano CHF (NYHA clase III). Las muestras de plasma
que contenían BNP endógeno se adquirieron en ProMedDx (Norton, MA)
y se almacenaron congeladas. En el día del ensayo, las muestras se
descongelaron previamente a su uso. Las muestras descongeladas se
usaron en aproximadamente 1 hora tras la descongelación. Los
inhibidores se agregaron inmediatamente después de que las muestras
se descongelasen. Los resultados se presentan en la Tabla 8.
En la Tabla 8, la Columna 2 refleja la
cantidad de BNP presente en una muestra de plasma descongelada y
probada en el Día 0. La Columna 3 de la Tabla 8 presenta la cantidad
de BNP presente en la muestra de plasma del Día 0 ensayada tras
aproximadamente 4 horas de almacenamiento a 4ºC. La Columna 4 de la
Tabla 8 presenta la cantidad de BNP presente en la misma muestra
de plasma del Día 0 ensayada tras aproximadamente 24 horas de
almacenamiento a 4ºC. El ensayo se realizó como se describió en los
Ejemplos anteriores.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados de los Ejemplos anteriores
confirman que se confiere una mejor estabilidad a las muestras de
plasma sanguíneo en presencia de componentes
estabilizadores/inhibidores de BNP de acuerdo con la presente
invención.
Los experimentos se realizaron para evaluar la
estabilización de BNP en suero animal y suero humano frente a
plasma humano. Las Tablas 9 y 10 a continuación ilustran la eficacia
de PPACK y leupeptina como estabilizadores de BNP en tres medios
diferentes, a saber, suero bovino fetal (Biocell Labs, Rancho
Dominguez, CA), suero humano normal (Biocell Labs), y plasma humano
normal (Intergen). Los resultados indican que tanto el suero humano
como el suero animal se comportan mucho más agresivamente que el
plasma con respecto a la degradación de BNP; incluso con las
mayores concentraciones de inhibidores probadas, la degradación del
péptido fue rápida. A pesar de todo, en todas las condiciones, se
vio que la adición de PPACK y leupeptina inhibió significativamente
la degradación del BNP:
El Ejemplo 5 presenta una evaluación comparativa
de varios inhibidores diferentes. La Tabla 11 a continuación
compara inhibidores de serina proteasas asociados con actividad
trombolítica. Los inhibidores se aplicaron en sus concentraciones
funcionales usuales. Todos los inhibidores excepto PPACK se
adquirieron en Calbiochem (San Diego, CA). Inhibidores tales como
aprotinina y benzamidina, que otros investigadores probaron
previamente para estabilización de BNP, se usaron con el fin de
compararlos con los compuestos inhibidores nuevos descritos en este
documento. AEBSF
([4-(2-aminoetil)bencenesulfonilfluoruro)])
representa un inhibidor relacionado con fenilmetilsulfonilfluoruro
(PMSF). Los datos indican la baja eficacia de aprotinina y la
eficacia intermedia de AEBSF y benzamidina en la estabilización de
BNP. Sin embargo, como se describe de manera novedosa en este
documento, se descubrió que DFP (diisopropilfluorofosfato) y PPRACK
(D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona)
actúan de forma tan eficaz como la antipaína, leupeptina y PPACK en
la estabilización de BNP.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Los experimentos mostrados en este ejemplo
presentan los resultados de la valoración de PPACK (Tabla 12) y
antipaína y leupeptina (Tabla 13) en diferentes lotes de plasma
humano. Los datos se recogieron tras la valoración de PPACK,
antipaína, o leupeptina en muestras de plasma humano normal
(Intergen) con el añadido de BNP sintético. Para PPACK, se usaron
tres muestras de plasma humano normal (A, B y C). Los resultados de
la valoración de PPACK confirman una recuperación de
aproximadamente 90% o más de BNP almacenado en plasma con PPACK en
una concentración de aproximadamente 3,9 \mug/ml y superior.
(Tabla 12). Los resultados de la valoración de leupeptina y
antipaína indican que estos inhibidores proveen buena protección
para la estabilidad de BNP en plasma en concentraciones de
aproximadamente 50 \mug inhibidor/ml.
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\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
El Ejemplo 7 presenta los resultados de diversos
experimentos para determinar el efecto de PPACK en la estabilidad de
BNP endógeno. Para determinar la estabilidad de diferentes muestras
de pacientes bajo diversos tiempos de almacenamiento refrigerado, se
mantuvieron 5 muestras de pacientes bajo refrigeración durante 0, 1,
8, 24, 48 y 144 horas. A una serie de muestras acompañantes se les
añadió PPACK hasta una concentración final de 35 \mug/ml para
evaluar la capacidad de este inhibidor de reducir la degradación de
BNP. Como se muestra en la Tabla 14 a continuación, PPACK retrasó
marcadamente la degradación, incluso en el tiempo 0. Los resultados
se calcularon como recuperación absoluta frente a la medición en el
tiempo 0 (1ª determinación).
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados presentados en la Tabla 14
muestran que a las 24 horas, la pérdida promedio de BNP fue de 28%
en muestras sin inhibidor en comparación con una pérdida promedio de
sólo 6,2% con la adición de PPACK. A las 48 horas, la pérdida
promedio de BNP en las muestras sin PPACK aumentó hasta 40%,
mientras que las muestras que contenían PPACK mostraron una
recuperación de 100% en comparación con la medición inicial de BNP.
Los valores iniciales de BNP en las muestras en el tiempo 0 fueron,
en promedio, 31% superiores con la adición de PPACK. Estos
hallazgos sugieren que la adición de inhibidor de proteasas
inmediatamente tras la centrifugación del plasma ofrece un
procedimiento valioso para estabilizar las muestras de pacientes y
para incrementar la caducidad de las muestras refrigeradas sin
degradación de BNP. Además, los datos demuestran la capacidad de
PPACK para prevenir la degradación de BNP, inclusive tras el
almacenamiento durante 6 días a 4ºC.
La Tabla 15 a continuación presenta datos
adicionales para muestras de pacientes analizadas anteriormente
(Tabla 14) y demuestran la capacidad de PPACK para prevenir la
degradación de BNP tras el almacenamiento durante 6 horas a
temperatura ambiente. Sin PPACK en los tiempos respectivos mostrados
en las Tablas 14 y 15, virtualmente no queda BNP inmunorreactivo.
Como se muestra en la Tabla 14, los resultados se calculan como
recuperación absoluta frente a la 1ª determinación de medición
(tiempo 0). CLAVE: 1 = paciente número 1; 1p = paciente número 1
con adición de inhibidor de proteasas PPACK, etc.
\vskip1.000000\baselineskip
| *: Volumen de muestra insuficiente para evaluar las muestras de pacientes 2 y 3. |
En estos análisis, se añadieron dos niveles de
BNP sintético en diferentes diluyentes basados en suero o plasma
disponibles comercialmente para comparar la estabilidad de BNP en
los diversos diluyentes. Todos los diluyentes estaban originalmente
libres de BNP. Los diluyentes usados fueron los siguientes: el
diluyente 1 era suero filtrado de caballo; el diluyente 2 era suero
de cabra inactivado por calor; el diluyente 3 era plasma humano
desfibrinado con carbón vegetal; el diluyente 4 era plasma
desfibrinado (Irvine); el diluyente 5 era plasma humano
desfibrinado (Seracon III); el diluyente 6 era suero humano real; y
el diluyente 7 era plasma extraído deslipidado
(Seracon II).
(Seracon II).
La prueba de estabilidad se realizó
aproximadamente 45 minutos tras la adición de BNP a los diluyentes.
Los resultados se presentan en la Tabla 16. En la Tabla 16,
"añadido bajo" indica que se añadió BNP en una concentración
de aproximadamente 300 pg/ml, mientras que "añadido alto"
indica que se añadió BNP en una concentración de aproximadamente
3000 pg/ml. A pesar del efecto estabilizador de PPACK como se
demuestra en este documento, la recuperación de BNP se vio
comprometida, especialmente en el diluyente Nº 7. Estos resultados
elucidan las diferentes actividades de las muestras de pacientes
con respecto a la degradación de BNP con y sin inhibidores
de
proteasas.
proteasas.
| **: por debajo del límite de detección. |
La Tabla 17 muestra que la dilución de plasma
positivo para BNP (es decir, plasma que contiene BNP endógeno) en
plasma normal da como resultado una tasa de degradación de BNP
diferente. Esta tasa es específica del plasma usado como diluyente
y, en menor grado, del plasma probado. En la Tabla 17, Plasma A, B y
C representan muestras recibidas de la División Cardiovascular,
Hospital Brigham y Hospital de Mujeres de Boston, MA. La combinación
de plasmas normales 1 se preparó en los laboratorios de Bayer
Corporation, Tarrytown, NY a partir de plasma de donantes internos;
la combinación de plasmas 2 es la misma combinación de KCBB descrita
anteriormente en este documento; y las combinaciones de plasmas 3 y
4 se obtuvieron en Intergen. "Dil" se refiere a
"diluido".
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Claims (9)
1. Un procedimiento para estabilizar el péptido
natriurético cerebral (BNP) en una muestra de sangre o plasma, que
comprende introducir en la muestra una cantidad estabilizadora de al
menos un componente estabilizador seleccionado de
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína),
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK),
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK), diisopropilfluorofosfato (DFP) y combinaciones de los
mismos.
2. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, que además comprende uno o más análogos,
variantes, o derivados de los componentes estabilizadores, en el
que dichos análogos, variantes o derivados tienen función
estabilizadora de BNP.
3. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que al menos uno de los componentes
estabilizadores está presente en un tubo de recogida previo a
recoger la muestra de sangre o plasma.
4. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que al menos un componente estabilizador se
introduce en la muestra de sangre o plasma en el momento de recogida
de la muestra.
5. El procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que al menos un componente estabilizador
está presente en forma concentrada o liofilizada.
6. Una composición que contiene péptido
natriurético cerebral (BNP) estabilizado que comprende BNP y al
menos un componente seleccionado de
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína),
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK),
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK), diisopropilfluorofosfato (DFP) y combinaciones de los
mismos.
7. La composición de acuerdo con la
reivindicación 6, en la que al menos un componente está presente en
forma concentrada o liofilizada.
8. Un material de control para ensayar muestras
que contienen, o se sospecha que contienen, péptido natriurético
cerebral (BNP), que comprenden péptido natriurético cerebral (BNP) y
al menos un componente estabilizador de BNP seleccionado de
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína),
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK),
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK), diisopropilfluorofosfato (DFP) y combinaciones de los
mismos.
9. Un equipo para estabilizar el péptido
natriurético cerebral (BNP) en muestras basadas en sangre, que
comprende al menos un recipiente con al menos un componente
seleccionado de
acetil-leu-leu-arginal
(leupeptina),
N-(N\alpha-carbonil-Arg-Val-Arg-al)Phe
(antipaína),
H-D-Phe-Phe-Arg-clorometilcetona
(PPACK),
D-Phe-Pro-Arg-clorometilcetona
(PPRACK), diisopropilfluorofosfato (DFP) y combinaciones de los
mismos, y, opcionalmente, un gotero o dispositivo similar para
administrar al menos un componente, un tampón para disolver ese o
esos componentes, BNP sintético o exógeno, e instrucciones para el
uso.
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES03013792T Expired - Lifetime ES2279911T3 (es) | 2002-06-19 | 2003-06-18 | Procedimientos y composiciones para la estabilizacion del peptido natriuretico cerebral (bnp) en muestras de sangre. |
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