CN102798691A

CN102798691A - 一种检测血中苯丙氨酸二肽的新方法

Info

Publication number: CN102798691A
Application number: CN201110133019XA
Authority: CN
Inventors: 尹沛源; 黄强; 周丽娜; 路鑫; 许国旺
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2011-05-21
Filing date: 2011-05-21
Publication date: 2012-11-28

Abstract

本发明公开了一种检测血清中苯丙氨酸二肽的新方法，该方法基于代谢组学的分析平台，以反相液相色谱-质谱进行分析。根据苯丙氨酸二肽的特征离子的色谱峰面积确定其在血清中的相对含量，并以血清轮廓分析的总峰面积作为参数，校正分析过程中的误差。本方法测定血中苯丙氨酸二肽的相对含量，具有预处理方法简单，重复性好，稳定性高的特点，在肝癌的筛查以及蛋白多肽类营养支持效果评价营养中具有很好的推广前景。

Description

一种检测血中苯丙氨酸二肽的新方法

技术领域

本发明涉及分析化学和医学领域，是一种以代谢组学的方法为基础，基于高效液相色谱质谱联用的方法，快速测定血中苯丙氨酸二肽相对含量的新技术。

背景信息

肝癌是一种世界范围内的常见的恶性肿瘤，其死亡率中仅次于胃癌和食道癌而居恶性肿瘤第三位。近年来，原发性肝癌的发病率、死亡率在世界范围内有上升趋势。据我们的研究发现，苯丙氨酸二肽在肝癌患者血清中呈现相对的高浓度，并且与传统的诊断标志物甲胎蛋白(AFP)的浓度没有关联，不受后者浓度变化的影响。因此，测量血清苯丙氨酸二肽对肝癌的早期筛查可能具有重要的提示作用。

二肽是一类由两个氨基酸残基通过肽键连接而成的短肽的总称。组成二肽的氨基酸可以相同，也可以不同。二肽是结构最简单的一类肽。通常认为，二肽是一类活性肽，可能与体内众多的过程，如营养，激素、酶、免疫、抗菌、抗病毒、抗氧化有非常紧密关系。但迄今为止，大部分的二肽的功能并不十分明确。作为其中的一种，苯丙氨酸二肽的生物学功能尚无明确的报道。作为其前体，苯丙氨酸是一种必需氨基酸，并且作为酪氨酸的前体，为肾上腺皮质激素的合成提供材料。同时，苯丙氨酸也是一种重要的神经递质-儿茶酚胺的前体。总之，苯丙氨酸二肽可能与肝癌发生有着重要的生物学联系。此外，根据文献报道，作为人体必需氨基酸--苯丙氨酸的吸收方式之一，苯丙氨酸二肽的浓度也可以反映机体对饮食中的蛋白质的消化吸收情况，可以作为蛋白质及多肽类营养品的消化吸收利用情况的评价指标目前，并没有专门的关于检测苯丙氨酸二肽方法的报道。液相色谱是一种适合分析非挥发性、热稳定差的化合物的一种分析技术，具有分离效能高、分析速度快、检测灵敏度高以及应用范围广等特点。近年来，采用2μm以下色谱填料的液相色谱柱的出现大大改善了液相色谱的分离能力，实现了更快的分析速度，更高的分辨率。并且更适用于与质谱技术联用，提高了对复杂组分的分离度，降低了离子抑制效应，有效的改善了质谱的分辨率、灵敏度、信噪比等。线性离子阱串联离子回旋轨道阱质谱能够提供极高的质量分辨率，对于化合物的分子量测定具有很大的优势。

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发明内容

本发明的目的是开发一种检测血中苯丙氨酸二肽的方法，由于该化合物具有潜在的辅助肝癌早期筛查的能力，因此，发展一种实用快速的分析方法对于发挥该化合物的临床作用具有重要的意义。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

1)血清样品预处理：样品待测时室温解冻，取100μl血清，加入400μl乙腈，振荡30秒，4℃12000g离心10分钟后取300μl上清液冻干，采用体积比为1∶4的乙腈∶水混合溶液80μl复溶后4℃10000g条件下离心15分钟取上清后直接上样分析。

2)分析条件：液质联用仪选用赛默飞世尔公司的线性离子阱串联离子回旋轨道阱质谱串联其液相色谱。色谱柱采用Waters公司的HSS T3色谱柱。

3)离子提取：提取质核比为313.154的离子，其质量数误差范围在0.001道尔顿之内(质量误差＜3ppm)，并积分，计算峰面积。

4)归一化方法：利用峰提取，匹配软件对总离子流数据进行处理，以每个样品的实际总峰面积为基数，对苯丙氨酸二肽的峰面积进行归一化校正，以消减分析过程中的误差。

本发明具有如下优点：

本方法测定血中苯丙氨酸二肽的相对含量，具有预处理方法简单，重复性好，稳定性高的特点。同时，高分辨质谱方法的引入，一方面降低了血液内杂质离子的干扰，提高了定量测定的精度；另一方面，也增加了苯丙氨酸二肽的检测灵敏度。

附图说明

图1苯丙氨酸二肽提取离子流图以及质谱图。

图2测得的苯丙氨酸二肽在不同肝病病例血清中的相对值提示肝癌中该物质的显著升高以及其作为辅助筛查标志物的潜力。纵坐标为苯丙氨酸二肽在血清中含量的相对值。HCC：肝癌；Cirrhosis：肝硬化；Hepatitis：肝炎；Controls：健康对照。

图3测得的苯丙氨酸二肽(Dphe)结果显示，当其Cutoff值26.9的时候，苯丙氨酸二肽对AFP具有很好的互补性。在AFP阴性(小于20)的50例小肝癌患者中，苯丙氨酸二肽大于其Cutoff值的有48例，而在AFP弱阳性及阳性患者中，AFP共有3例阴性。

具体实施方式

实施例

1.血清样品收集与预处理

采集前，纳入志愿者签署知情同意书。

在相同条件下分别收集30例正常人、确诊的75例肝炎、74例肝硬化和243例肝癌患者的血清作为待测样品，待测样品-80℃保存，样品测定时先于室温解冻，分别取待测样品进行如下操作，取100μ1血清，加入400μl乙腈，振荡30秒，4℃12000g离心10分钟后取300μl上清液冻干，采用体积比为1∶4的乙腈∶水混合溶液80μl复溶后4℃10000g条件下离心15分钟取上清后分别直接上样分析。

2.分析方法

色谱质谱联用仪器采用赛默飞世尔公司的型号为LTQ OrbitrapXL系统，色谱柱为Waters ACQUITY UPLCTM HSS C18柱，流动相A为体积浓度0.1％的甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱条件为：0～2min为体积比1％B相(其余为A)，2～22min线性变化至100％B相，保持5分钟后，恢复为1％B相，平衡5分钟。柱温60℃，每个待测样品的进样量15μL，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测。

质谱采用电喷雾离子源正离子模式检测；脱溶剂气和锥孔气流量分为35单位和5单位气量，使用体积浓度99.9％高纯氮气；脱溶剂气温度为325℃，离子源温度为100℃；喷雾电压为4500V；采用全扫描模式，扫描质核比范围为50-1000。获取每个待测样品的总离子流图。

3.苯丙氨酸二肽离子的提取和积分

在每个待测样品的总离子流图下，提取质核比为313.154的离子，质量误差范围为±0.001道尔顿范围内的。该质量范围内有且仅有1个离子，与苯丙氨酸二肽标准品比对，即确认其为苯丙氨酸二肽的分子离子。提取该离子后，对其峰面积进行积分定量，如图1所示，获知待测样品中苯丙氨酸二肽的相对浓度。

4.在大量样本分析中，为确保分析准确性，减少因仪器引起的误差，引入了代谢轮廓分析总峰面积作为校正参数，对苯丙氨酸二肽的面积进行校正。校正后，质量控制样本的相对标准偏差可以控制的总体(＞72h)为13％，日内相对标准偏差为3％，根据国际上代谢组学研究的文献报道的标准，本方法的分析稳定性可以满足目前研究需要。

5.如图2所示，在实际样本中，经本方法测得的苯丙氨酸二肽可以实现对肝癌与非肝癌的样本包括肝炎，硬化以及健康对照组的良好区分。同时，图3显示，苯丙氨酸二肽对于APF不同水平的肝癌患者均有比较好的判断。此外，根据文献报道，作为人体必需氨基酸--苯丙氨酸的吸收方式之一，苯丙氨酸二肽的浓度也可以反映机体对饮食中的蛋白质的消化吸收情况，可以作为蛋白质及多肽类营养品的消化吸收利用情况的评价指标，快速测定其血液浓度具有良好的应用前景。

Claims

1.一种检测血清中苯丙氨酸二肽的方法，其特征在于：以反相液相色谱质谱联用为平台技术，流动相采用乙腈-甲酸水体系；具体过程为，

1)样品预处理：取100μl待测样品血清，加入400μl乙腈，振荡30秒，4℃12000g离心10分钟后取300μl上清液冻干，采用体积比为1∶4的乙腈∶水混合溶液80μl复溶后4℃10000g条件下离心15分钟取上清后分别直接上样分析；

2)分析：采用色谱质谱联用仪器，色谱柱为Waters ACQUITYUPLCTM HSS C18柱，流动相A为体积浓度0.1％的甲酸水，B为乙腈；梯度洗脱条件为：0～2min为体积比1％B相，2～22min线性变化至100％B相，保持5分钟后，恢复为1％B相，平衡5分钟；柱温40～60℃，柱后流出液不经分流直接进入质谱检测；

质谱采用电喷雾离子源正离子模式检测；脱溶剂气为氮气；脱溶剂气温度为275～325℃，离子源温度为100℃；喷雾电压为3500～4500V；采用全扫描模式，扫描质核比范围为50～1000，获取待测样品的总离子流图；

3)苯丙氨酸二肽离子的提取和积分

在每个待测样品的总离子流图下，提取质核比为313.154的离子，质量误差范围为±0.001道尔顿范围内的；该质量范围内仅有的1个离子，即确认其为苯丙氨酸二肽的分子离子；提取该离子后，对其峰面积进行积分定量，获知待测样品中苯丙氨酸二肽的相对浓度。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采取血液代谢轮廓分析的方法，将总峰面积归一化以减少实验误差。