CN102305802B - Hbv感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型及其构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种乙型肝炎病毒（HBV）感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，通过选择HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血进行核磁共振分析，再对核磁共振得到的谱图进行多重变量的统计学分析，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的标志性代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。此外，本发明还涉及一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型。
Description
【技术领域】
本发明涉及一种HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法。
【背景技术】
代谢组学作为一门新兴的系统生物学技术，通过对体液及组织中的小分子代谢产物（一般是指相对分子量小于1000的低分子化合物）的整体组成进行动态的跟踪监测，结合模式识别多元变量统计分析方法，来检测和分析机体在受到环境及病理刺激时内源代谢产物的改变。代谢组学常用的技术包括核磁共振技术(nuclear magnetic resonance，NMR)和质谱技术（mass spectrometry，MS）。而1H NMR由于其损伤性小，重复性高及无偏向性等优点，使得代谢组学技术已经广泛应用于临床研究，尤其在临床疾病代谢标志物的寻找，疾病的分型和严重程度的区分，代谢机制的探讨以及预后及疗效的评估等领域。近年来，以NMR技术结合模式识别分析方法（pattern recognition，PR）成功地被应用于多种疾病的研究，包括心血管系统、神经系统、多器官肿瘤、自身免疫性疾病等。
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）感染性或酒精性肝硬化是当今世界两大慢性肝脏疾病。二者具有相同的临床症状，如肝腹水、高血胆红素水平等。但二者的发病机理不同，酒精性肝硬化是由肝细胞中的乙醇引起的基因毒性或氧化产物富集导致，而HBV感染性肝硬化是由于肝细胞对HBV的免疫反应导致。进一步研究表明，HBV感染性肝硬化相比较酒精性肝硬化的致癌率要高。但是，传统的对HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的致病机理研究较少，从而难以对二者针对性的诊断治疗提供支持。
【发明内容】
基于此，有必要提供一种HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法，从代谢产物组的水平对HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化进行区分研究。
一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，包括如下步骤：
步骤一：选择HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，分别得到外周血血清，冷冻保存；
步骤二：对得到的外周血血清中代谢产物进行核磁共振分析；
步骤三：对核磁共振分析得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，将得到的三组处理结果进行比对分析，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。
在优选的实施方式中，所述步骤二具体是将得到的外周血血清进行室温冻融，加入重水用于锁场，再在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱。
在优选的实施方式中，所述在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱是在25℃下用Varian Unity INOVA600核磁共振光谱仪并使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列记录一维氢谱，弛豫延迟120ms，谱宽为8,000Hz；核磁共振谱图以乳酸在1.33ppm处的双峰定标，积分区间为9.0-0.5ppm，积分间距为0.005ppm，去掉5.2-4.7ppm一段包含残余的水峰。
在优选的实施方式中，所述傅里叶变换是使用TopSpin软件对谱图的自由感应衰减信号进行傅立叶变换，并且在进行傅立叶变换时所有谱图均乘以增宽因子为0.3Hz的指数窗函数以提高信噪比。
在优选的实施方式中，所述主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理过程中的设定的阈值为0.05。
一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型，使用上述任一项所述方法得到的相对于健康人血清，HBV感染性肝硬化患者与酒精性肝硬化患者的区别代谢产物构建得到。
在优选的实施方式中，所述区别代谢产物包括肌酸、异丁酸盐、乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺。
在优选的实施方式中，所述区别代谢产物中，相比较酒精性肝硬化，HBV感染性肝硬化血清中肌酸、异丁酸盐表达上调，乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺的表达下调。
通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的潜在标志性代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，找到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的发病及代谢差异，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。
【附图说明】
图1为健康对照组、HBV感染性肝硬化组及酒精性肝硬化组的1H NMR图谱，其中，A：健康对照组，B：HBV感染性肝硬化组，C：酒精性肝硬化组；
图2为基于各血清样品的1H NMR图谱得到的PCA得分图，其中，N:健康对照组，A:酒精性肝硬化组，HBV:HBV感染性肝硬化组；
图3A为HBV感染性肝硬化组与健康对照组的PLS-DA得分图，其中，N:健康对照组，HBV:HBV感染性肝硬化组；
图3B为图3A排列实验的交叉验证结果图；
图3C为酒精性肝硬化组与健康对照组的PLS-DA得分图，其中，N:健康对照组，A:酒精性肝硬化组；
图3D为图3C排列实验的交叉验证结果图；
图3E为酒精性肝硬化组与HBV肝硬化组的PLS-DA得分图，其中，HBV:HBV感染性肝硬化组，A:酒精性肝硬化组；
图3F为图3E排列实验的交叉验证结果图；
图4A为HBV肝硬化组与健康对照组的OPLS-DA得分图，其中，N:健康对照组，HBV:HBV感染性肝硬化组；
图4B为图4A中的用于区分两组份的相关系数载荷图；
图4C为酒精性肝硬化组与健康对照组的OPLS-DA得分图，其中，N:健康对照组，A:酒精性肝硬化组；
图4D为图4C中的用于区分两组份的相关系数载荷图。
【具体实施方式】
下面主要结合附图及具体实施例对HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法作进一步详细的说明。
本发明通过代谢组学分析方法对HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者和健康人的代谢产物进行分析，从而找到与HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化发病机理相关的潜在代谢产物，构建HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型，找到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的发病及代谢差异，从而进一步为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的针对性诊断治疗提供支持。
一实施方式的HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型构建方法包括如下步骤：
步骤S1：选择HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，得到外周血血清，冷冻保存。
外周血血清中含有大量的反应当前被选择者身体状态的代谢产物，有小分子代谢产物，如氨基酸、脂类、小分子酶等，也有多分子代谢产物，如蛋白质、多肽、大分子脂肪酸等。通过对血清中代谢产物的分析，并与健康人进行比较，可以获得患者与健康人的差异表达的代谢产物；或者通过对同一种疾病的不同病理起源的患者血清代谢产物进行分析，得到其差异表达的图谱模型，为疾病的针对性诊断和治疗提供进一步的支持。
步骤S2：对得到的外周血血清进行核磁共振分析。
首先将得到的外周血血清进行室温冻融，加入重水（D2O）用于锁场，在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱。
步骤S3：对得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型。
以下为HBV感染性与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型及其构建方法的具体实施例部分。
一、HBV感染性肝硬化组、酒精性肝硬化组和健康对照组的选择：
HBV感染性肝硬化组：21例
酒精性肝硬化组： 20例
健康对照组： 20例
其中，病例来源于2009年9月-2010年8月深圳市人民医院消化科与传染科；
肝硬化的评判标准基于组织学诊断或者由临床、实验及影像学综合检测结果评定；
HBV感染性肝硬化评定标准是血清中存在HBV表面抗原和HBV的DNA；
酒精性肝硬化组评定标准是至少5年内每天摄入酒精大于50g或者至少两年内每天摄入酒精大于80g而导致肝硬化的患者；
实验时排除了由于其他并发症存在的肝硬化病例，如抗HBc/HBd阳性的慢性肝脏疾病患者、自身免疫缺陷型肝炎患者、Wilson疾病患者、HBV感染合并酒精性肝硬化的患者、肝癌患者等；
下表1为HBV感染性肝硬化组、酒精性肝硬化组与健康对照组的临床和生化参数检测：
表1
二、代谢组学分析：
选择健康对照组、HBV感染性肝硬化患者及酒精性肝硬化患者的外周血5mL；
将该外周血室温静置约30min后在2000转下离心10min，取血清，-80℃保存；
NMR分析之前，先融化血清样品，将样品分成400μL每管，再向每管中加入150μL的重水（D2O）用于锁场；
将血清样品在4℃，12,000转条件下离心10分钟，取上层500μL的样品加入至5mm的NMR管中；
25℃下用Varian Unity INOVA600NMR光谱仪记录样品的NMR频谱；
用Carr-Purcell-Meiboom-Gill(CPMG)序列记录一维频谱，弛豫延迟120ms，谱宽为8,000Hz；核磁共振谱图以乳酸在1.33ppm处的双峰定标，积分区间为9.0-0.5ppm，积分间距为0.005ppm，去掉5.2-4.7ppm一段包含残余的水峰；
使用TopSpin软件(V3.0,Bruker Biospin,Germany)对谱图的自由感应衰减信号（free induction decay，FID）进行了傅立叶变换、相位调整、基线校正、及定标等处理，所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为0.3Hz的指数窗函数以提高信噪比。
三、多重变量的统计学分析：
包括使用SIMCA-P11.0(Umetrics,Umea,Sweden)软件进行的PCA（principalcomponent analysis，主成分分析）、PLS-DA分析（偏最小二乘法-判别分析）和OPLS-DA（对PLS-DA进行的正交信号校正处理的分析）。
代谢产物信号的1H NMR血清影像首先进行无监督的PCA分析以降低数据的维数，得到整个实验组的得分图（score plots），对样本的代谢信息进行总体把握。然后，使用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)对归一化后的数据进行偏最小二乘法(PLS)发现NMR数据(X变量)和其它变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系。偏最小二乘法-判别分析(PLS-DA)使用自适换算(unitvariance scaling)的数据标度换算方式。PLS-DA对模型的质量用舍一法进行交叉验证检验，并用交叉验证后得到的R2X(代表模型计算所获得的隐变量反映自变量X的变异的百分比)、R2Y(表示模型隐变量反映因变量Y的变异的百分比)和Q2Y(代表模型的可预测度)对模型有效性进行评判。在此之后，通过排列实验随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机R2Y值和Q2Y值对模型有效性做进一步的检验。
完成PLS-DA分析之后，使用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)对试验结果进行正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)，最大化地凸显模型内部不同组别之间的差异。通过分析OPLS-DA模型中各代谢产物相应的相关系数，对有统计意义的代谢产物进行进一步归纳。在相关系数载荷图中，将每一个变量的负载值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换。然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢产物。本研究中，相关系数±0.433作为阈值选择HBV感染性肝硬化组和酒精性肝硬化组的标志性代谢产物。
四、结果分析：
1、血清样品的1H NMR频谱分析
一些常见代谢产物的1H NMR信号，如氨基酸、有机酸和碳水化合物依据传统的公开方法进行分析。图1所示的为健康对照组、酒精性肝硬化组及HBV感染性肝硬化组特征血清频谱，其中，A代表健康对照组，B代表HBV感染性肝硬化组，C代表酒精性肝硬化组，为了清晰显示，虚线框中的δ5.2-9.0及δ0.5-4.7区域放大了8倍，3-HB:3-羟基丁酸盐（3-Hydroxybutyrate）;Ace:乙酰醋酸盐（Acetoacetate）;Acet:丙酮（Acetone）;Ala:丙氨酸（Alanine）;Cit:柠檬酸盐（Citrate）;Cr:肌酸（Creatine）;FD:甲醛（Formaldehyde）;Glu:谷氨酸盐（Glutamate）;Gln:谷氨酰胺（Glutamine）;Gly:甘氨酸（Glycine）;GPC:甘油胆碱磷酯（Glycerophosphocholine）;His:组氨酸（Histidine）;Ile:异亮氨酸（Isoleucine）;IB:异丁酸盐（Isobutyrate）;Lac:乳酸盐（Lactate）;Leu:亮氨酸（Leucine）;L1:Lipid,CH3-(CH2)n-(LDL&VLDL);L2:CH3-(CH2)n-(LDL&VLDL);L3:Lipid,-CH2-CH2-C=O;L4:Lipid,-CH2-CH=CH-;L5:Lipid,=CH-CH2-CH=;L6:Lipid,-CH=CH-;Lys:Lysine;NAG:N-酰基糖蛋白类信号分子（N-acetyl glycoprotein signals）;PC:胆碱磷酸（Phosphocholine）；Phe:苯基丙氨酸（Phenylalanine）;Py:丙酮酸盐（Pyruvate）;Suc:琥珀酸盐（Succinate）;TMA:三甲胺（Trimethylamine）;Tyr:酪氨酸（Tyrosine）;Val:缬氨酸（Valine）;α-Glc:α-葡萄糖（α-Glucose）;β-Glc:β-葡萄糖（β-Glucose）。
再对图1中相关信息进一步使用多重变量统计学进行分析，如PCA、PLS-DA和OPLS-DA。
2、多重变量的统计学分析：
图2所示的为三个实验组的二维PCA得分图。PCA分析结果以主成分（principal component,PC）PC1和PC2构建评分图，其中PC1代表第一主成分，PC2代表第二主成分。N代表健康对照组，HBV代表HBV感染性肝硬化组，A代表酒精性肝硬化组。评分图上的每个点代表一个样本，从图上可以看到，虽然酒精性肝硬化组与HBV感染性肝硬化组之间存在一些重叠，但是从总体而言，肝硬化组与健康对照组还是可以区分开来。
为了建立诊断模型，使用SIMCA-P+软件(V11.0,Umetrics AB,Umea,Sweden)对归一化后的数据进行偏最小二乘法(PLS)发现NMR数据(X变量)和其它变量(Y变量，分组信息)之间的相关关系。图3A为正常健康对照组和HBV肝硬化组的PLS-DA得分图，R2X=0.340,R2Y=0.908,Q2Y=0.837，显示两组份成功区分开来；图3B为排列实验的交叉验证结果图，随机多次(n=200)改变分类变量Y的排列顺序得到相应不同的随机Q2Y和R2Y值对模型有效性做进一步的检验。图3C为正常健康对照组和酒精性肝硬化组的PLS-DA得分图，R2X=0.445,R2Y=0.906，Q2Y=0.897，显示两组份成功区分开来；图3D为交叉验证结果图。图3E为HBV肝硬化组和酒精性肝硬化组的PLS-DA得分图，R2X=0.263,R2Y=0.824,Q2Y=0.627，两组份也得到了较好的区分；图3F为交叉验证结果图。交叉验证图中的左边各个点代表200次随机验证时所得的R2Y和Q2Y，右上角两个点分别为所建模型的原始R2Y和Q2Y。通常原始R2Y和Q2Y大于任意一次随机验证的值，则说明模型成功。模型的可解释指标R2X、R2Y和可预测指标Q2Y并结合排列实验验证结果共同提示，血清样本的对照组和各疾病组所建立的模型相当成功，说明疾病组样本的代谢组出现了显著性差异。
为了更好的区分各试验组份，发现各组份的标志物，采用正交偏最小二乘法-判别分析(OPLS-DA)对试验数据进行进一步的分析。图4A、图4C是OPLS-DA预测模型的评分图。如图4A所示，HBV感染性肝硬化组与健康对照组被成功区分开，其中，R2X=0.364,R2Y=0.915,Q2Y=0.887。如图4C所示，酒精性肝硬化组与健康对照组也被成功区分开，其中，R2X=0.445,R2Y=0.926,Q2Y=0.903。从图4B和图4D中反应系数载荷图可以看出HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差别代谢产物。图4B和图4D中，正向的峰值代表各组PC1中正向表达较为丰富的代谢产物，负向的峰值代表各组PC1中负向表达较为丰富的代谢产物。从图4B和图4D可以看出相关的差异表达物包括β-葡萄糖、α-葡萄糖、低密度脂蛋白（low-density lipoproteins，LDLs）、超低密度脂蛋白（very low-densitylipoproteins，VLDLs）、缬氨酸、酪氨酸、琥珀酸盐、脂质、异丁酸盐、谷氨酰胺和谷氨酸盐等。依据对相关系数的阈值判断，找到了31种肝硬化组（包括HBV感染性肝硬化组和酒精性肝硬化组）与健康对照组的区别代谢产物，如下表2，表2为源自HBV感染性肝硬化组相比较健康对照组及酒精性肝硬化组相比较健康对照组的NMR数据获得的OPLS-DA系数。其中，肌酸、乙酰醋酸盐、异丁酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺这5种代谢产物在HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化组中有区别表达，相比较酒精性肝硬化组，HBV感染性肝硬化组血清中肌酸、异丁酸盐表达上调，乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺的表达下调。
表2
注：δ代表化学位移，r代表相关系数。其中，正负值代表相关系数的正负相关度，空白代表相关系数│r│小于阈值0.433。
四、结果讨论：
研究结果表明通过改变能量代谢，同时改变细胞内三羧酸循环（TCA）和细胞膜的流动性将会对肝硬化的生化条件产生重要的影响。本发明通过基于NMR的代谢产物分析来检测肝硬化患者的血清，从而找到HBV感染性和酒精性肝硬化的区别表达图谱模型。代谢产物的分析结果表明，肝硬化组（包括酒精性肝硬化和HBV感染性肝硬化）与健康对照组的血清中有31种代谢产物表达有差异。众多在酒精性肝硬化组中表达差异的代谢产物同时在HBV感染性肝硬化组中也区别表达，包括一些表达上调的代谢产物，如葡萄糖、酪氨酸、组氨酸、苯基丙氨酸、丙酮酸盐、琥珀酸盐、三甲基胺（TMA）、柠檬酸盐和3-羟基丁酸盐等，以及一些表达下调的代谢产物，如，LDLs、VLDLs、脂质、缬氨酸、N-乙酰基糖蛋白内信号物（NAG）、赖氨酸、亮氨酸、丙三氧基磷酯胆碱（GPC）/磷脂胆碱（PC）、异亮氨酸、乳酸盐和醋酸盐等。此外，就上述代谢产物的分析，其他的一些物质，如肌酸、乙酰醋酸盐、异丁酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺等物质也是区别HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的重要物质。
本发明的研究结果表明，血清中表达上调的谷氨酸盐和谷氨酰胺是酒精性肝硬化的两类较为敏感的生物标志物。肌酸是一类含有氮原子的主要在肝脏中合成的物质，其常作为线粒体中ATP产生点与细胞溶质之间的能量传递物质。肌酸在能量转化过程中普遍存在，并且在高增殖率的细胞中表达上调，如肝癌细胞（HCC）。肌酸在HBV感染性肝硬化中也表达上调，但在酒精性肝硬化患者中却没有发现较为明显的变化，其原因可能是HBV感染性肝硬化比酒精性肝硬化患者的肝脏损伤发生的要早。HBV感染性肝硬化患者血清中乙酰醋酸盐的表达下调表明其体内肝脏细胞线粒体中的TCA循环和能量代谢已经受损。研究表明，肝硬化患者血清中的醋酸盐浓度显著高于健康对照组。异丁酸盐是一种短链脂肪酸（C4-C6），肝脏细胞常利用异丁酸盐进行能量代谢。高浓度的异丁酸盐是一种有毒物质，会损伤肝脏细胞。研究表明，可以从检测血清中异丁酸盐的浓度角度出发研究肝脏功能的衰减。通过代谢产物分析，异丁酸盐在HBV感染性肝硬化患者体内浓度较高，但在酒精性肝硬化患者体内则没有显著变化，由此可以确定HBV感染性肝硬化患者肝脏功能的衰减比酒精性肝硬化患者更为严重。
本发明上述各例，以NMR为基础的代谢组学技术，结合模式识别分析方法，NMR技术可构建机体整体的代谢指纹图谱来区分疾病的病理状态，其提供的中间信息优于传统的单一标志物。从血清NOESY1DPR谱图看出，酒精性肝硬化患者与HBV感染性肝硬化患者之间血清代谢产物的差异主要集中在肌酸、异丁酸盐、乙酰醋酸盐、谷氨酸盐和谷氨酰胺等。但是，需要说明的是，单一代谢产物乃至于多个代谢产物的改变并不能作为酒精性肝硬化患者与HBV感染性肝硬化患者特异的标志物，只有收集整体代谢产物改变的信息、并经过医学验证才能准确区分酒精性肝硬化患者与HBV感染性肝硬化患者的疾病状态级发病机制。
通过使用1H NMR，并对检测结果进行多重变量的统计学分析，可以得到关于HBV感染性肝硬化患者与酒精性肝硬化患者区别表达图谱模型，从而为对酒精性肝硬化患者提供针对性的诊断治疗提供了新的途径。例如，某些地区的居民或者某些患者不愿意承认自己有饮酒习惯，通过代谢产物的分析，医生将不再需要通过长期的讨论去确定是否是酒精性肝硬化。更重要的是，实验得到的关于HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的5种区别性的生物标志物可以为HBV感染性肝硬化和酒精性肝硬化的病理学研究提供新的途径。
需要补充的是，本发明的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即血清，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (1)
1.一种HBV感染性与酒精性肝硬化差异表达图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一：选择HBV感染性肝硬化患者、酒精性肝硬化患者及健康人的外周血，并进行离心处理，分别得到外周血血清，冷冻保存；
步骤二：对得到的外周血血清中代谢产物进行核磁共振分析；
步骤三：对核磁共振分析得到的一维氢谱数据进行傅里叶变换、相位调整、基线校正及定标处理，再将得到的数据进行主成分分析、偏最小二乘法-判别分析和正交信号校正处理，将得到的三组处理结果进行比对分析，通过正交偏最小二乘法-判别分析得到的模型中各代谢产物相应的相关系数，得到相关系数载荷图，对有统计意义的代谢产物进行进一步归纳，在相关系数载荷图中，将每一个变量的负载值与其标准偏差的平方根值相乘后进行数据的回溯转换，然后与相应的相关系数临界值表进行比对，得到引起组间差异的代谢产物，且设定相关系数±0.433作为阈值选择HBV感染性肝硬化组和酒精性肝硬化组的标志性代谢产物，得到HBV感染性肝硬化与酒精性肝硬化的差异表达图谱模型；
其中，所述步骤二具体是将得到的外周血血清进行室温冻融，加入重水用于锁场，再在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱；
所述在核磁共振仪上采集血清的一维氢谱是在25℃下用Varian UnityINOVA600核磁共振光谱仪并使用Carr-Purcell-Meiboom-Gill序列记录一维氢谱，弛豫延迟120ms，谱宽为8,000Hz；核磁共振谱图以乳酸在1.33ppm处的双峰定标，积分区间为9.0-0.5ppm，积分间距为0.005ppm，去掉5.2-4.7ppm一段包含残余的水峰；
所述傅里叶变换是使用TopSpin软件对谱图的自由感应衰减信号进行傅立叶变换，并且在进行傅立叶变换时所有谱图均乘以增宽因子为0.3Hz的指数窗函数以提高信噪比。
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