CN109504750A - Plc围手术期肝移植患者环状rna差异性表达谱图谱模型及其构建方法和构建系统 - Google Patents

Abstract

一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型及其构建方法和构建系统，其中，构建方法包括如下步骤：设置疾病组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分别提取RNA；采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；采用RT‑PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。上述构建方法，通过比较未实施肝移植术前患者与实施肝移植术后患者、健康对照者之间差异性表达的circRNA，筛查PLC特异表达的circRNA以及移植术后早期肝功能恢复相关的circRNA，为PLC早期诊断、预后以及治疗提供新的信息。

Description

PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型及其 构建方法和构建系统

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，特别是涉及一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型及其构建方法和构建系统。

背景技术

原发性肝癌(Primary Liver Cancer，PLC)是我国最常见的肝脏恶性肿瘤，该病临床表现复杂，好发于40至50岁的男性，由多种因素相互影响，例如包括微量元素的化学元素、环境因素和病毒感染，所以其发病机制复杂一直未能阐明，这也给PLC的治疗带来了困难。目前肝移植是治疗PLC最有效、最彻底的方法，它将肝脏整个癌变组织切除，换上匹配的健康肝脏组织，使肿瘤尽可能得到清除以及减少复发，同时也有助于肝功能的恢复。由于肝移植是异体移植，不可避免的，患者或多或少会产生免疫排斥反应，保守估计，大约10％的患者可发展为慢性排斥反应。

环状RNA(circular RNA,circRNA)作为最近被发现的一种特殊的新型内源非编码RNA，是RNA研究领域的研究热点。生物体内普遍存在着不能翻译为蛋白的功能性RNA分子，称为非编码RNA(non-coding RNAs，ncRNAs)。其中circRNA是一类通过反向剪接将3′和5′末端连接起来形成的环形RNA分子。按照剪接来源的不同，circRNA可分为内含子来源环状RNA以及外显子来源环状RNA，主要参与转录及转录后基因表达的调节。circRNA可能在疾病的发生和发展中发挥着重要的作用，有望成为某些疾病过程的潜在的生物标志物。围绕环状RNA进行深入而系统的研究具有较强的创新与现实性意义。

同种异体肝移植是目前治疗PLC最彻底、有效的方法，但如何提高供肝利用率和受者生存率一直也是医疗界所面临的问题。因此，迫切需要发现用于PLC早期诊断和肝移植术后功能恢复相关的新生物标记物。

发明内容

基于此，有必要提供一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型及其构建方法和构建系统。

一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，包括如下步骤：设置疾病组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液；采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；采用RT-PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，由如上任一实施例中所述的构建方法制备得到。

一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。

上述PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，通过比较未实施肝移植术前患者与实施肝移植术后患者、健康对照者之间差异性表达的circRNA，筛查PLC特异表达的circRNA以及移植术后早期肝功能恢复相关的circRNA，为PLC早期诊断、预后以及治疗提供新的信息。为更准确寻找有效的PLC早期诊断、靶向治疗和肝移植预后的生物分子标志提供了一定的理论依据。

附图说明

图1为本发明一实施方式的PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的步骤流程图；

图2为本发明另一实施方式的PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的步骤流程图。

具体实施方式

为了便于理解本发明，下面将参照相关附图对本发明进行更全面的描述。附图中给出了本发明的较佳实施方式。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施方式。相反地，提供这些实施方式的目的是使对本发明的公开内容理解的更加透彻全面。当然，它们仅仅为示例，并且目的不在于限制本发明。此外，本发明可以在不同例子中重复参考数字和/或字母。这种重复是为了简化和清楚的目的，其本身不指示所讨论各种实施例和/或设置之间的关系。

需要说明的是，当元件被称为“固定于”另一个元件，它可以直接在另一个元件上或者也可以存在居中的元件。当一个元件被认为是“连接”另一个元件，它可以是直接连接到另一个元件或者可能同时存在居中元件。本文所使用的术语“垂直的”、“水平的”、“左”、“右”以及类似的表述只是为了说明的目的，并不表示是唯一的实施方式。

在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”应做广义理解，例如，可以是机械连接或电连接，也可以是两个元件内部的连通，可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语的具体含义。

此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在发明的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。在本发明的描述中，“若干”的含义是至少一个，例如一个，两个等，除非另有明确具体的限定。

除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的术语只是为了描述具体的实施方式的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

例如，请参阅图1，一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，请参阅图1，所述构建方法包括如下步骤：设置疾病组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液；采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；采用RT-PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。又如，所述PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型为PLC围手术期肝移植患者外周血环状RNA差异性表达谱图谱模型。

为了进一步说明上述PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，又一个例子是，请参阅图2，所述构建方法包括如下步骤：

S110：设置疾病组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

例如，对照组为4名2015年8月15日于中国人民解放军第一八一医院门诊部门体检正常的健康志愿者，4例为男性，平均年龄40.5±5.26岁，中位年龄42岁。又如，疾病组为4例2014年12月1日至2015年8月31日于中国人民解放军第一八一医院确诊为PLC并进行肝移植手术的患者。4例患者均为男性，平均年龄40.25±6.40岁，中位年龄42.5岁。所有患者有长期大量饮酒病史，治疗前诊断为酒精性肝硬化发展成PLC，且无其他肿瘤病史和肝炎感染病史。

患者和健康个体的临床特征从第一八一医院的数据库中提取并总结在表一中。谷草转氨酶(aspartate transaminase，AST)和谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)是用于评估肝功能的常用指标，在0IU/L～50IU/L之间为正常参考值，表一显示，经移植术后PLC患者的肝功能逐渐恢复正常。

表一 肝移植患者和健康对照组的临床特征

又如，各外周血标本收取于中国人民解放军第一八一医院肾脏科进行PLC肝移植手术前1天、术后1天、术后3天、术后7天患者，以及于中国人民解放军第一八一医院门诊部门体检正常的健康志愿者的外周血，每个标本收集0.5ml于0.5ml的冻存管中并置于-80℃冰箱保存，储存备用。所有研究对象均知情同意参加本项实验，且该过程经医院伦理委员会审查批准。

又如，实验分为肝移植术前1天组、术后1天、术后3天、术后7天组和健康对照组，用于circRNA微阵列实验的5组标本分别由4例PLC患者肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天外周血和4例健康志愿者外周血混合构成(每个样本0.5ml)。也可理解为，疾病组包括肝移植术前1天组、术后1天、术后3天和术后7天组，对照组即为健康对照组。

S120：分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液；

为了直接从外周血中提取出RNA，一实施例中，所述步骤S120具体为：

(1)各取2ml外周血标本，加入1mL TRIzol，用移液管反复吹打多次，得到第一样品；具体的，当然，也可以直接取血液中悬浮细胞例如单个核细胞进行此操作步骤。

(2)将第一样品于15℃～30℃放置5min后，加入0.2mL的氯仿，震荡15s后，15℃～30℃孵育2min～3min；具体的，为了将核酸蛋白复合体完全解离，把加了TRIzol的样品于15-30℃放置5min；每1mL的TRIzol试剂匀浆的样品中加入0.2mL的氯仿，盖紧管盖；手动剧烈振荡管体15s后，15℃～30℃孵育2min-3min。

(3)4℃下12,000g离心15min，吸取上层水相；需要说明的是，离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层核上层的无色的水相；RNA全部被分配于水相中；水相的体积大约为匀浆时加入的TRIzol试剂的60％。又如，4℃下12,000g离心15min应理解为在4℃的环境下12,000g离心15min，温度的设置可以通过离心机进行设置，例如，离心机为带有温度设置的离心机。后续以此类推。

(4)将水相转移到新离心管中，加入异丙醇，混匀后15℃～30℃孵育10min，得到第二样品，其中，异丙醇的加入量为制备第一样品时加入Trizol试剂量的1/2。具体的，将水相转移到新离心管中。

(5)将第二样品于4℃，12,000g离心10min，使RNA形成RNA沉淀，弃上清；具体的，RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

(6)加入75％乙醇，振荡混匀后，4℃，7500g离心5min，弃上清。具体的，每1mLTRIzol试剂匀浆的样品中加入至少75％的乙醇1mL用于清洗RNA沉淀。

(7)将RNA沉淀干燥。例如，为了不降低RNA的可溶性，在空气中不完全干燥RNA沉淀5min～10min。

(8)加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，55℃～60℃孵育10min，得到总RNA溶液。具体的，溶解RNA时，先加入无RNA酶的水，然后用移液枪反复吹打几次，然后55-60℃孵育10min。获得的RNA溶液保存于-70℃。

为了降低血液中红细胞成分对RNA的污染，又一实施例中，所述步骤S120具体为：

(1)将外周血标本使用淋巴分离液分离出单个核细胞。例如，选用淋巴分离液分离外周血标本中的淋巴细胞具体包括如下步骤：a.各取外周血3毫升，用pH7.2的Hanks液或生理盐水以1：1体积将外周血稀释。b.用毛细吸管吸取3毫升淋巴细胞分层液加入到刻度离心管中，再使离心管倾斜水平面约45度角，用毛细滴管把稀释的样本血沿管壁缓慢滴入分离液面之上，此时应尽量保持两者界面清楚。c.于16摄氏度～18摄氏度条件下，用水平离心机以2500r/分钟离心25min。离心后观察细胞分布。d.使用毛细吸管缓慢插到白色云雾层混浊带中，沿管壁轻轻吸出此层细胞，此层细胞主要为单个核细胞，其中也包括淋巴细胞，将吸取的细胞加入至另一支离心管中。其中，沿管壁轻轻吸出此层细胞时，取尽目标细胞，同时避免吸取其他液面的液体，以减少非目标细胞混杂。e.用Hanks液洗涤上述细胞3次-5次。第一次2500r/min，10min；第2～3次2000r/min，10min，此举主要去除大部分混杂的血小板。f.将沉淀细胞置入悬浮液中备用。又如，所述悬浮液包括PBS、Hanks液、培养基、生理盐水或其它缓冲液中的任一种。

(2)向单个核细胞沉淀中加入TRIzol，用移液管反复吹打多次，得到第一样品；具体的，悬浮细胞则是在离心的沉淀中加入TRIzol试剂并用移液管反复吹吸以裂解细胞，在TRIzol试剂加入前不要洗涤细胞以免增加mRNA降解的可能。

(3)将第一样品于15℃～30℃放置5min后，加入0.2mL的氯仿，震荡15s后，15℃～30℃孵育2min～3min；

(4)4℃下12,000g离心15min，吸取上层水相；

(5)将水相转移到新离心管中，加入异丙醇，混匀后15℃～30℃孵育10min，得到第二样品，其中，异丙醇的加入量为制备第一样品时加入Trizol试剂量的1/2；

(6)将第二样品于4℃，12,000g离心10min，使RNA形成RNA沉淀，弃上清；

(7)加入75％乙醇，振荡混匀后，4℃，7500g离心5min，弃上清；

(8)将RNA沉淀干燥；

(9)加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，55℃～60℃孵育10min，得到总RNA溶液。

如此，可以首先从外周血中提取出单个核细胞，再从单个核细胞中提取出RNA，能够降低血液中红细胞成分对RNA的污染。

S130：对总RNA进行纯化，并测定总RNA中RNA含量。

例如，所述步骤S130具体为：

①在微量离心管中分别加入重新溶解的RNA≤85μL、10×反应缓冲液10μL、Baseline-ZERO DNA酶5μL、无RNA酶的水至100μL，于37℃孵育30min；

②加入350μL缓冲液RLT，混匀；然后加入250μL乙醇(96％～100％)，并吹打混匀；又如，RLT为凯杰公司的缓冲液RLT。

③在2mL收集管上的RNeasy小型离心柱中加入上述700μL的样品，小心盖上管盖，≥8000g条件下离心15s；

④弃去流体，在RNeasy小柱中加入500μL缓冲液RPE(RPE缓冲液第一次使用前，按瓶上所述加入4倍体积的96％～100％乙醇配成工作溶液)，小心地盖上盖子≥8000g，离心15s；

⑤洗涤RNeasy膜，把流体倒掉，再次加入缓冲液RPE 500μL，盖紧管盖，≥8000g条件下离心2min；

⑥再次洗涤RNeasy膜，将RNeasy柱置于一支干净的2mL收集管中，过滤，去除旧的收集管，全速离心1min；又如，用过滤法去除旧的收集管，

⑦将离心后的RNeasy柱放入一新的1.5mL的离心管中，RNeasy膜中加入适量无RNA酶的水；盖上管盖，≥8000rpm离心1min，洗脱；

⑧最后测定总RNA中RNA含量。需要说明的是，如何测定RNA中RNA含量，请参照现有技术，本申请在此不在赘述。

S140：检测纯化后的总RNA是否合格，是则执行后续步骤，其中，总RNA合格的标准为OD260/OD280比值应为1.8～2.1，且OD260/OD230比值要大于1.8。

S150：采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；

一实施例中，所述步骤S150具体为：

(1)向RNA溶液中，加入RNA核糖核酸酶R，以去除RNA溶液中的线性RNA并富集circRNA；

(2)对circRNA进行扩增，并利用随机引物法转录成荧光标记的circRNA；具体的，采用arraystar超级RNA标记试剂盒进行荧光标记。

(3)纯化标记的circRNA，并对浓度和活性进行检测；例如，在纯化标记的circRNA，并对浓度和活性进行检测中，浓度和活性利用NanoDrop ND-1000测定。

(4)在1μg的每种标记的circRNA中加入5μL 10×封闭剂和1μL 25×裂解缓冲液，60℃保温30min以裂解circRNA；又如，10×封闭剂即为10倍浓度的封闭剂，25×裂解缓冲液即为25倍浓度的裂解缓冲液。

(5)加入25μL 2×杂交缓冲液稀释标记的circRNA；又如，2×杂交缓冲液即为2倍浓度的杂交缓冲液。

(6)将50μL杂交样品分配到垫片中并和circRNA微阵列表达垫片组装；

(7)垫片在杂交炉中以65℃孵育17小时；

(8)杂交阵列进行洗涤，并用Agilent G2505C固定，得到circRNA芯片；

(9)使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描circRNA芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，得到circRNA差异数据。

S160：采用RT-PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；

一实施例中，所述步骤S160具体包括：

(1)引物的设计和合成

根据术前组(术前1天组)与健康对照组比较上调且术后组(术后1天、3天、7天组)与术前组比较下调，或者术前组与健康对照组比较下调且术后组与术前组比较上调的筛选原则随机挑选验证的circRNA进行荧光定量验证。以2^-ΔΔCt法计算差异倍数，通过RT-PCR检测。

一实施例中，在所述RT-PCR中，RT-PCR引物包括β-actin引物、hsa_circRNA_400031引物、hsa_circRNA_102032引物、hsa_circRNA_103096引物、hsa_circRNA_102347引物，其中：

β-actin-F引物为GTGGCCGAGGACTTTGATTG；

β-actin-R引物为CCTGTAACAACGCATCTCATATT；

hsa_circRNA_400031-F引物为CTCCTCCTGTCTTTCTCCTCCTT；

hsa_circRNA_400031-R引物为GTCCTGTGGCTATGCTTTGTGA；

hsa_circRNA_102032-F引物为GATAAGGTAACAAGTCGATGGAT；

hsa_circRNA_102032-R引物为TGGAACTCTCTCTGGGGTGA；

hsa_circRNA_103096-F-R引物为GGCTACGGGAGGAGAACAAG；

hsa_circRNA_103096-R引物为TGCTGGCAATTCAAACACACAT；

hsa_circRNA_102347-F引物为GTTAGCAGATTTTCTTCGTTGTC；

hsa_circRNA_102347-R引物为TTCCTGTTTGGTTTGGTTCC。

(2)RT-PCR反应。例如，采用RT-PCR进行验证。例如，建立8μL体系，加入2×MasterMix 5μL，正、反向引物各0.5μL，蒸馏水2μL。又如，F引物为正向引物，R引物为反向引物。将8μL混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，加入对应的2μL cDNA，小心粘上Sealing Film封口膜，并短暂离心混合。将上述384-PCR板置于Realtime PCR仪上进行PCR反应。反应程序如下：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10s；60℃，60s(收集荧光))。为了建立PCR产物的熔解曲线，扩增反应结束后，按(95℃，10s；60℃，60s；95℃，15s)；并从60℃缓慢加热到99℃(仪器自动进行-Ramp Rate为0.05℃/s)。由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个样品的2μL体积的cDNA其含量并不完全相同，为校正此差异，使用管家基因β-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测基因相对含量。

S170：对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

例如，所述数据分析包括circRNA芯片数据分析和对比数据分析。

又如，circRNA芯片数据分析如下：使用Agilent Feature Extraction(11.0.1.1版)软件将扫描后得到的circRNA微阵列图片进行分析，得到原始数据。再将原始数据输入R软件中进行归一化处理。两组样本归一化的数据进行fold change值的计算后，将foldchange的绝对值≥2.0归为两组间具有差异表达的circRNA。同时运用Arraystar公司基于TargetScan&miRanda数据库而自制的miRNA靶向结合位点预测软件预测与miRNA吸附相关的circRNA。

通过对对比数据分析，以进一步验证circRNA表达谱芯片的检测结果。通过circRNA芯片数据分析和对比数据分析，来构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

下面举例说明实验结果：

(一)PLC患者肝移植围手术期和健康对照者circRNA表达谱数据分析

构建PLC患者肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天和健康对照组的circRNA表达谱，对表达谱的原始数据进行归一化处理，发现PLC患者肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天和健康对照组5组样本中，通过circRNA芯片共筛选出3298个circRNA。据统计，芯片共检测到3298个circRNA。判断在两组样品间的表达量是否存在差异性表达。将PLC患者肝移植术后1天、3天和7天circRNA归一化后的数据进行均值处理后同PLC患者肝移植术前组比较，发现术后和术前组之间共有302个circRNA差异表达(foldchange绝对值≥2.0)，其中差异表达上调的有120个(fold change≥2.0)，差异表达下调的有182个(fold change≤-2.0)。

在PLC肝移植术前、术后及健康对照研究中，术前组circRNA归一化数值/健康对照组circRNA归一化数值≥2.0(fold change≥2.0)∩术后组circRNA归一化均值/术前组circRNA归一化数值≤-2.0(fold change≤-2.0)的circRNA有165个；术前组circRNA归一化数值/健康对照组circRNA归一化数值≤-2.0(foldchange≤-2.0)∩术后组circRNA归一化均值/术前组circRNA归一化数值≥2.0(fold change≥2.0)的circRNA有80个。也即共245个circRNA。

(二)差异表达的circRNA与miRNA位点结合的预测

circRNA具有miRNA海绵作用，即通过结合位点靶向定位可以结合的miRNA，从而抑制miRNA的表达。通过运用Arraystar公司基于TargetScan&miRanda数据库而自制的miRNA靶向结合位点预测软件预测与miRNA吸附相关的circRNA。每个作对比的差异表达的circRNA预测约有5个miRNA有位点结合，并对circRNA/miRNA相互作用信息做了详细注释。现举例说明。在hsa_circ_400031中，5'末端第134位～159位核苷酸与miR-122以不完全方式配对，而第305位～331位核苷酸与miR-122种子区以7mer-m8的结合方式完全互补配对；在hsa_circ_102347中，5'末端第286-307位核苷酸与miR-203a-5p种子区不完全互补配对。

(三)候选circRNA的确定

根据术前组与健康对照组比较上调且术后组与术前组比较下调，或者术前组与健康对照组比较下调且术后组与术前组比较上调的筛选circRNA原则，挑选了以下4个circRNA进行候选的验证基因(见表二)。

表二 肝移植围手术期与健康对照组circRNA在circRNA微阵列芯片中foldchange值

与hsa_circRNA_400031有结合位点的miR-122与肝功能衰竭相关；与hsa_circRNA_102347有结合位点的miR-203与肝移植术后肝癌复发相关。

(四)RT-PCR检测circRNA结果

根据上述筛选差异表达的circRNA原则，随机选取了hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347进行RT-PCR的验证分析，其中hsa_circRNA_400031和hsa_circRNA_102347分别与肝功能状态和肝癌相关。为了能直观地体现circRNA在肝移植术前、术后1天、术后3天、术后7天以及健康对照组中的动态表达，利用扩增之前的circRNA浓缩浓度绘制成柱状图。然而由于受RNA浓度定量误差和RNA逆转录效率误差等的影响，每个用于RT-PCR样品的2μl体积的cRNA其含量并不完全相同，为校正此差异，通过使用管家基因β-actin(不同样品间表达量基本恒定)作为内参，以样品待测基因的值除以此样品内参的值，最终得到的比值为样品的待测circRNA的相对含量。

为了检测hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天以及健康对照组之间是否存在差异表达，将4个circRNA的Ct值经β-actin内参基因的Ct校正后得到的△Ct值用于两组间相对表达比值：2^-△△Ct，以及两组间是否存在显著差异的p值计算。结果发现，hsa_circRNA_400031除了肝移植术后1天表达量相对于术前1天有极其显著上调以外(p<0.01)，其余肝移植术前1天、术后3天、7天与健康对照组之间均无显著差异(p>0.05)；hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植术前1天的表达量相对于健康对照组极其显著上调(p<0.01)，并且在肝移植术后1天、3天、7天有着显著下调的趋势。

虽然目前基因芯片技术具有高灵敏度和准确性对生物样品并行、快速、高效地检测，但其也存在假阳性的风险。芯片的假阳性率一般要求在5％以内，差异倍数大于或等于2倍，以不至于基因芯片分析数据结果带来较大误差。一般由芯片技术筛选出的差异表达基因，用RT-PCR来验证，可以确定差异芯片的准确性。

通过将hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植术前1天、术后1天、术后3天和术后7天分别与健康对照组进行比较，通过芯片获得的fold change值和RT-PCR检测和计算获得的2^-△△Ct值进行验证芯片准确性。结果发现，hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347通过利用RT-PCR检测有75％(12/16)的样本上调或下调的表达情况与芯片分析结果一致，证实circRNA表达谱芯片的检测结果是可信的。

本研究采用circRNA微阵列芯片技术，在PLC患者肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天和健康对照组5组样本中共检测到3298个circRNA。根据术前组与健康对照组比较，表现为上调表达，且术后组与术前组比较，表现为下调表达的circRNA筛选原则，筛选到circRNA 165个，这165个circRNA在机体存在肿瘤时上调表达，实施PLC肝切除及肝移植术后下调表达，推测其可能是PLC相关生物标记物；根据术前组与健康对照组比较，表现为上调表达，且术后组与术前组比较，表现为下调表达的circRNA筛选原则，筛查到circRNA80个，这80个circRNA在机体存在肿瘤时下调表达，实施PLC肝切除及肝移植术后上调表达，推测其可能与肝移植术后早期肝功能恢复有关。通过Arraystar公司研发的miRNA靶向结合位点预测软件，发现不少差异表达的circRNA与miRNA有结合位点。在这些筛选出差异表达的circRNA中，发现hsa_circRNA_400031和hsa_circRNA_102347分别与miR-122和miR-203有靶向结合位点。所以本研究选择hsa_circRNA_400031和hsa_circRNA_102347以及差异表达倍数较高的hsa_circRNA_102032和hsa_circRNA_103096进行RT-PCR的验证和动态分析。

在利用RT-PCR对4个候选circRNA进行定量的动态分析中得知：hsa_circRNA_400031除了肝移植术后1天表达量相对于术前有极其显著上调以外，其余肝移植术前1天、术后3天、7天与健康对照组之间均无显著差异；hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347在肝移植术前的表达量相对于健康对照组极其显著上调，并且在肝移植术后1天、3天、7天有着显著下调的趋势。该结果中，hsa_circRNA_400031虽然在肝移植术后表达量有下降趋势，但是在肝移植术前与健康对照组的对比中无显著差异，与芯片检测结果不一致，造成误差的原因可能与有限的样本量有关。而hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347的肝移植术前和术后与健康对照组表达量相比，有着先上调后下调的趋势，说明PLC患者在进行成功的同种异体肝移植手术后，原本高表达的circRNA得到了有效的清除，这可能与PLC通过肝移植得到有效清除治疗有关。其中与肝移植术后肝癌复发相关的miR-203有结合位点的hsa_circRNA_102347可能通过靶向吸附作用来调控miR-203的表达水平，可以作为PLC早期诊断、靶向治疗、移植术后疗效判定的生物标志物。

对于利用RT-PCR验证circRNA芯片检测结果，本研究得到了75％的结果一致率，25％的结果不一致率可能是因为标本数量的局限性，后续研究还需要扩大样本量。总之，RT-PCR法检测PLC患者肝移植围手术期和健康对照者中circRNA表达情况，验证了circRNA表达谱的较高的准确性，为后续研究提供了实验依据。

由此可知，hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347经RT-PCR检测在肝移植术前1天、术后1天、术后3天、术后7天有着不同程度的表达水平，其中与肝移植术后肝癌复发相关的miR-203有结合位点的hsa_circRNA_102347很有可能作为PLC早期诊断、靶向治疗、移植术后疗效判定的生物标志物。hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347均有潜力成为PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

目前，circRNA的相关研究还处于基础研究阶段，circRNA如何通过调控作用来影响疾病的发生、发展的机制还未能阐明。虽然本研究利用了miRNA靶向预测软件对相关circRNA进行了预测，也应用RT-PCR对circRNA表达情况做了动态分析，筛选了具有代表性的差异表达circRNA，但是要想把外周血circRNA真正应用到临床上，还需要进一步miRNA与circRNA吸附机制的实验，以及收集PLC肝移植围手术期标本来验证。除此之外，有研究表明，miRNA可以在某些信号通路中富集，并对信号通路上多个靶蛋白的调节，从而实现对miRNA-mRNA的网络调控。所以，circRNA、miRNA、mRNA、蛋白质、基因表达的调控网络也是今后探究的重要方向。

上述PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，通过比较未实施肝移植术前患者与实施肝移植术后患者、健康对照者之间差异性表达的circRNA，筛查PLC特异表达的circRNA以及移植术后早期肝功能恢复相关的circRNA，为PLC早期诊断、预后以及治疗提供新的信息。为更准确寻找有效的PLC早期诊断、靶向治疗和肝移植预后的生物分子标志提供了一定的理论依据。

本发明还提供一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。又如，PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型包括。hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_103096和hsa_circRNA_102347。

为了提供更为准确的PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，一实施例中，PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型还包括：hsa_circRNA_101436、hsa_circRNA_100738、hsa_circRNA_103559、hsa_circRNA_100213、hsa_circRNA_101347、hsa_circRNA_000689、hsa_circRNA_101864、hsa_circRNA_104060、hsa_circRNA_101152、hsa_circRNA_103492、hsa_circRNA_100374、hsa_circRNA_100654、hsa_circRNA_105012、hsa_circRNA_104850、hsa_circRNA_101100、hsa_circRNA_101289、hsa_circRNA_103507、hsa_circRNA_104764、hsa_circRNA_102929、hsa_circRNA_101771、hsa_circRNA_104052、hsa_circRNA_100566、hsa_circRNA_102032、hsa_circRNA_101617、hsa_circRNA_103030、hsa_circRNA_103557、hsa_circRNA_103623、hsa_circRNA_102353、hsa_circRNA_102610、hsa_circRNA_104776、hsa_circRNA_100257、hsa_circRNA_100065、hsa_circRNA_103667、hsa_circRNA_101427、hsa_circRNA_100925、hsa_circRNA_101597、hsa_circRNA_101348、hsa_circRNA_100762、hsa_circRNA_102053、hsa_circRNA_103493、hsa_circRNA_100924、hsa_circRNA_102153、hsa_circRNA_101865、hsa_circRNA_103206、hsa_circRNA_103497、hsa_circRNA_100976、hsa_circRNA_102392、hsa_circRNA_101250、hsa_circRNA_102143、hsa_circRNA_100610、hsa_circRNA_100100、hsa_circRNA_100125、hsa_circRNA_102361、hsa_circRNA_100381、hsa_circRNA_101564、hsa_circRNA_101085、hsa_circRNA_100259、hsa_circRNA_104320、hsa_circRNA_100926、hsa_circRNA_102940、hsa_circRNA_102861、hsa_circRNA_103149、hsa_circRNA_101035、hsa_circRNA_103500、hsa_circRNA_101319、hsa_circRNA_104425、hsa_circRNA_103112、hsa_circRNA_102957、hsa_circRNA_103094、hsa_circRNA_104768、hsa_circRNA_100313、hsa_circRNA_103842、hsa_circRNA_101034、hsa_circRNA_103045、hsa_circRNA_103505、hsa_circRNA_100548、hsa_circRNA_103096、hsa_circRNA_100917、hsa_circRNA_102360、hsa_circRNA_101963、hsa_circRNA_100446、hsa_circRNA_104979、hsa_circRNA_103246、hsa_circRNA_103554、hsa_circRNA_101575、hsa_circRNA_100261、hsa_circRNA_100795、hsa_circRNA_100921、hsa_circRNA_103767、hsa_circRNA_100459、hsa_circRNA_100918、hsa_circRNA_103887、hsa_circRNA_101618、hsa_circRNA_101550、hsa_circRNA_104514、hsa_circRNA_104821、hsa_circRNA_104852、hsa_circRNA_104315、hsa_circRNA_104980、hsa_circRNA_103757、hsa_circRNA_103572、hsa_circRNA_101331、hsa_circRNA_102347、hsa_circRNA_100534、hsa_circRNA_100913、hsa_circRNA_100910、hsa_circRNA_102383、hsa_circRNA_102839、hsa_circRNA_100119、hsa_circRNA_103504、hsa_circRNA_103966、hsa_circRNA_101237、hsa_circRNA_100920、hsa_circRNA_101552、hsa_circRNA_101964、hsa_circRNA_101090、hsa_circRNA_101099、hsa_circRNA_102759、hsa_circRNA_100632、hsa_circRNA_100380、hsa_circRNA_104810、hsa_circRNA_102859、hsa_circRNA_101213、hsa_circRNA_101349、hsa_circRNA_103968、hsa_circRNA_101488、hsa_circRNA_102737、hsa_circRNA_100226、hsa_circRNA_101101、hsa_circRNA_100373、hsa_circRNA_104591、hsa_circRNA_100120、hsa_circRNA_104492、hsa_circRNA_101543、hsa_circRNA_104807、hsa_circRNA_100993、hsa_circRNA_103171、hsa_circRNA_103690、hsa_circRNA_100922、hsa_circRNA_101838、hsa_circRNA_103503、hsa_circRNA_103113、hsa_circRNA_102927、hsa_circRNA_104809、hsa_circRNA_104805、hsa_circRNA_102611、hsa_circRNA_102984、hsa_circRNA_101566、hsa_circRNA_102158、hsa_circRNA_104061、hsa_circRNA_100271、hsa_circRNA_101837、hsa_circRNA_104808、hsa_circRNA_101231、hsa_circRNA_100705、hsa_circRNA_101563、hsa_circRNA_100669、hsa_circRNA_101245、hsa_circRNA_104804、hsa_circRNA_101836、hsa_circRNA_101835、hsa_circRNA_104490、hsa_circRNA_104062、hsa_circRNA_100923、hsa_circRNA_101996、hsa_circRNA_000624、hsa_circRNA_000764、hsa_circRNA_000791、hsa_circRNA_001038、hsa_circRNA_001108、hsa_circRNA_001205、hsa_circRNA_001594、hsa_circRNA_100001、hsa_circRNA_100168、hsa_circRNA_100177、hsa_circRNA_100223、hsa_circRNA_100492、hsa_circRNA_100508、hsa_circRNA_100541、hsa_circRNA_100587、hsa_circRNA_100646、hsa_circRNA_100674、hsa_circRNA_100679、hsa_circRNA_100696、hsa_circRNA_100751、hsa_circRNA_100860、hsa_circRNA_100861、hsa_circRNA_100989、hsa_circRNA_101004、hsa_circRNA_101051、hsa_circRNA_101571、hsa_circRNA_101740、hsa_circRNA_101798、hsa_circRNA_101901、hsa_circRNA_101948、hsa_circRNA_101976、hsa_circRNA_102213、hsa_circRNA_102323、hsa_circRNA_102334、hsa_circRNA_102393、hsa_circRNA_102396、hsa_circRNA_102400、hsa_circRNA_102404、hsa_circRNA_102411、hsa_circRNA_102430、hsa_circRNA_102451、hsa_circRNA_102462、hsa_circRNA_102466、hsa_circRNA_102482、hsa_circRNA_102513、hsa_circRNA_102520、hsa_circRNA_102526、hsa_circRNA_102534、hsa_circRNA_102543、hsa_circRNA_102546、hsa_circRNA_102645、hsa_circRNA_102881、hsa_circRNA_102990、hsa_circRNA_103065、hsa_circRNA_103250、hsa_circRNA_103290、hsa_circRNA_103316、hsa_circRNA_103355、hsa_circRNA_103410、hsa_circRNA_103528、hsa_circRNA_103546、hsa_circRNA_103781、hsa_circRNA_103910、hsa_circRNA_104084、hsa_circRNA_104169、hsa_circRNA_104374、hsa_circRNA_104405、hsa_circRNA_104506、hsa_circRNA_104577、hsa_circRNA_104716、hsa_circRNA_104755、hsa_circRNA_104756、hsa_circRNA_104872、hsa_circRNA_104964、hsa_circRNA_104983、hsa_circRNA_400024、hsa_circRNA_400029、hsa_circRNA_400031、hsa_circRNA_400059和hsa_circRNA_400087。上述245个circRNA均为肝移植术前、术后和健康对照组之间差异表达的共同circRNA，通过进一步分析上述245个circRNA的差异表达，能够构建更为准确的PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，能够为PLC早期诊断、预后以及治疗提供新的信息。为更准确寻找有效的PLC早期诊断、靶向治疗和肝移植预后的生物分子标志提供了一定的理论依据。

本发明还提供一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建系统，采用如上任一实施例中所述的构建方法实现。

能够理解的是，PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建系统，需要经过大量的生物实验操作以及专业的数据分析过程，一方面，对人员的专业要求较高，需要较为娴熟的实验技能和专业技能，另一方面，由于实验操作受人员影响大，重复性较差，误差也较大，PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建过程容易出现构建效率较差以及准确性较差的问题。为了能够自动构建出PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，一实施例中，所述构建系统包括标本获取模组、提取模组、circRNA芯片分析模组、RT-PCR分析模组和数据分析模组，提取模组连接标本获取模组，circRNA芯片分析模组和RT-PCR分析模组均连接提取模组，数据分析模组分别连接circRNA芯片分析模组和RT-PCR分析模组。其中，标本获取模组用于获取疾病组与对照组的标本；提取模组用于分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液；circRNA芯片分析模组用于采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；RT-PCR分析模组用于采用RT-PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；数据分析模组用于对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

上述构建系统能够自动生成所述PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，由于是全自动化操作，能够提高构建效率，还能够减少人为误差，使得实验重复性较好，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力，还能够提高PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的准确性。

一实施例中，所述提取模组包括第一控制单元，以及分别连接所述第一控制单元的接收单元、TRIzol加样处理单元、氯仿加样处理单元、第一离心单元、吸取单元、异丙醇加样处理单元、第二离心单元、75％乙醇加样处理单元、第三离心单元、干燥处理单元和RNA重悬单元。第一控制单元分别用于控制接收单元、TRIzol加样处理单元、氯仿加样处理单元、第一离心单元、吸取单元、异丙醇加样处理单元、第二离心单元、75％乙醇加样处理单元、第三离心单元、干燥处理单元和RNA重悬单元。接收单元、TRIzol加样处理单元、氯仿加样处理单元、第一离心单元、吸取单元、异丙醇加样处理单元、第二离心单元、75％乙醇加样处理单元、第三离心单元、干燥处理单元和RNA重悬单元依次顺序连接。接收单元连接标本获取模组，RNA重悬单元分别连接circRNA芯片分析模组和RT-PCR分析模。其中，接收单元用于从标本获取模组中分别接收疾病组与对照组的标本；TRIzol加样处理单元用于从疾病组与对照组的标本中各取2ml外周血标本，并加入1mL TRIzol混匀后，得到第一样品；氯仿加样处理单元用于将第一样品于15℃～30℃放置5min后，加入0.2mL的氯仿，震荡15s后，15℃～30℃孵育2min～3min；第一离心单元用于将孵育后的第一样品4℃下12,000g离心15min；吸取单元用于吸取离心后的上层水相，并将水相转移到新离心管中；异丙醇加样处理单元用于向新离心管中的水相中加入异丙醇，并在混匀后15℃～30℃孵育10min，得到第二样品，其中，异丙醇的加入量为制备第一样品时加入Trizol试剂量的1/2；第二离心单元用于将第二样品于4℃，12,000g离心10min，使RNA形成RNA沉淀；75％乙醇加样处理单元用于将离心后的第二样品弃上清，并向RNA沉淀中加入75％乙醇，振荡混匀；第三离心单元用于将加入75％乙醇后的RNA沉淀于4℃，7500g离心5min；干燥处理单元用于将离心后的RNA沉淀弃上清，并将RNA沉淀干燥；RNA重悬单元用于向干燥后的RNA沉淀中加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，55℃～60℃孵育10min，得到总RNA溶液。

上述提取模组，能够从标本获取模组能够从标本获取模组自动接收疾病组与对照组的外周血标本，并从各外周血标本中自动分离出RNA得到总RNA溶液，由于是全自动化操作，能够提高构建效率，还能够减少人为误差，使得实验重复性较好，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力，还能够提高PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的准确性。

一实施例中，circRNA芯片分析模组包括第二控制单元，以及分别连接所述第二控制单元的核糖核酸酶R加样单元、扩增单元、纯化检测单元、封闭剂裂解缓冲液加样处理单元、杂交缓冲液加样单元、分配组装单元、孵育单元、洗涤单元、固定单元和扫描处理单元。第二控制单元用于分别控制核糖核酸酶R加样单元、扩增单元、纯化检测单元、封闭剂裂解缓冲液加样处理单元、杂交缓冲液加样单元、分配组装单元、孵育单元、洗涤单元、固定单元和扫描处理单元。核糖核酸酶R加样单元、扩增单元、纯化检测单元、封闭剂裂解缓冲液加样处理单元、杂交缓冲液加样单元、分配组装单元、孵育单元、洗涤单元、固定单元和扫描处理单元依次顺序连接。核糖核酸酶R加样单元连接RNA重悬单元。扫描处理单元连接数据分析模组。核糖核酸酶R加样单元用于向RNA溶液中，加入RNA核糖核酸酶R，以去除RNA溶液中的线性RNA并富集CircRNA；扩增单元用于对CircRNA进行扩增，并利用随机引物法转录成荧光标记的CircRNA；纯化检测单元用于纯化标记的CircRNA，并对标记效率、浓度和活性进行检测；封闭剂裂解缓冲液加样处理单元用于在1μg的每种标记的CircRNA中加入5μL 10×封闭剂和1μL 25×裂解缓冲液，60℃保温30min以裂解CircRNA；杂交缓冲液加样单元用于加入25μL 2×杂交缓冲液稀释标记的CircRNA；分配组装单元用于将50μL杂交样品分配到垫片中并和CircRNA微阵列表达垫片组装；孵育单元用于将垫片在65℃孵育17小时；洗涤单元用于将杂交阵列进行洗涤；固定单元用于将杂交阵列用Agilent G2505C固定，得到CircRNA芯片；扫描处理单元用于扫描CircRNA芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，得到circRNA差异数据。

上述circRNA芯片分析模组，能够自动对总RNA中的circRNA进行分析，从而得到CircRNA对应的荧光强度并将实验结果转换成数字型数据保存，得到circRNA差异数据，由于是全自动化操作，能够提高构建效率，还能够减少人为误差，使得实验重复性较好，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力，还能够提高PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的准确性。

一实施例中，RT-PCR分析模组包括第三控制单元，以及分别连接所述第三控制单元的扩增单元、电泳检测单元、梯度稀释单元、RT-PCR体系配置单元、RT-PCR加样单元、RT-PCR反应单元和RT-PCR结果分析单元。第三控制单元分别用于控制扩增单元、电泳检测单元、梯度稀释单元、RT-PCR体系配置单元、RT-PCR加样单元、RT-PCR反应单元和RT-PCR结果分析单元。扩增单元、电泳检测单元、梯度稀释单元、RT-PCR体系配置单元、RT-PCR加样单元、RT-PCR反应单元和RT-PCR结果分析单元依次顺序连接。扩增单元连接RNA重悬单元，RT-PCR结果分析单元连接数据分析模组。其中，扩增单元用于针对每一需要测量的基因和管家基因，选择一个确定表达该基因的circDNA模板进行PCR反应；电泳检测单元用于将PCR产物与100bp DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带；梯度稀释单元用于将PCR产物进行10倍梯度稀释：设定PCR产物浓度为1，分别稀释为1×10^-1、1×10^-2、1×10^-3、1×10^-4、1×10^-5、1×10^-6、1×10^-7、1×10^-8、1×10^-9，这几个梯度浓度的DNA，即为所有的cDNA样品。RT-PCR体系配置单元用于将所有cDNA样品分别配置RT-PCR反应体系，其中，RT-PCR反应体系如下：2×Master Mix 5μL，10uM的PCR特异引物F0.5μL，10uM的PCR特异引物R 0.5μL，水2μL。RT-PCR加样单元用于将8μl混合液加到384-PCR板对应的每个孔中，再加入对应的2μLcDNA，并粘上Sealing Film封口膜。RT-PCR反应单元用于对384-PCR板进行RT-PCR反应，其中，RT-PCR反应的条件如下：95℃，10min；40个PCR循环(95℃，10秒；60℃，60秒(收集荧光))。RT-PCR结果分析单元用于根据绘制的梯度稀释DNA标准曲线得到各样品目的基因和管家基因的浓度结果，并进行分析，得到对比数据。

上述RT-PCR分析模组，能够自动对RNA重悬单元中的RNA进行RT-PCR分析，以此得到对比数据，由于是全自动化操作，能够提高构建效率，还能够减少人为误差，使得实验重复性较好，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力，还能够提高PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的准确性。

一实施例中，数据分析模组包括第四控制单元，以及分别连接所述第四控制单元的circRNA芯片数据分析单元、对比数据分析单元和图谱构建单元；第四控制单元用于分别控制circRNA芯片数据分析单元和对比数据分析单元；circRNA芯片数据分析单元连接扫描处理单元，对比数据分析单元用于连接RT-PCR结果分析单元；图谱构建单元分别连接circRNA芯片数据分析单元和对比数据分析单元。其中，circRNA芯片数据分析单元用于使用Agilent FeatureExtraction(11.0.1.1版)软件将扫描后得到的circRNA微阵列图片进行分析，得到原始数据，再将原始数据输入R软件中进行归一化处理。两组样本归一化的数据进行fold change值的计算后，将fold change的绝对值≥2.0归为两组间具有差异表达的circRNA。同时运用Arraystar公司基于TargetScan&miRanda数据库而自制的miRNA靶向结合位点预测软件预测与miRNA吸附相关的circRNA。对比数据分析单元用于验证circRNA表达谱芯片的检测结果；图谱构建单元用于通过circRNA芯片数据分析和对比数据分析，来构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

上述数据分析模组，能够根据circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，来构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，由于是全自动化操作，能够提高构建效率，还能够减少人为误差，使得实验重复性较好，避免了较为繁琐的实验操作，节省了大量的人力物力，还能够提高PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的准确性。

需要补充的是，本发明PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法的直接目的不是获得诊断结果或健康状况，而只是对已经脱离人体的体液，即外周血，进行处理或检测以获取作为中间结果的信息的方法，或处理该信息的方法，根据目前的医学知识和本发明所公开的内容，从所获得的信息本身不能够直接得出疾病的诊断结果。

以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。

以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

设置疾病组与对照组，每组包括若干份相异人体的已经脱离人体的外周血标本；

分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液；

采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据；

采用RT-PCR验证疾病组和对照组中circRNA的表达情况，得到对比数据；

对circRNA差异数据及对比数据进行数据分析，构建PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液，具体为：

各取2ml外周血标本，加入1mL TRIzol，用移液管反复吹打多次，得到第一样品；

将第一样品于15℃～30℃放置5min后，加入0.2mL的氯仿，震荡15s后，15℃～30℃孵育2min～3min；

4℃，12,000g离心15min，吸取上层水相；

将水相转移到新离心管中，加入异丙醇，混匀后15℃～30℃孵育10min，得到第二样品，其中，异丙醇的加入量为制备第一样品时加入Trizol试剂量的1/2；

将第二样品于4℃，12,000g离心10min，使RNA形成RNA沉淀，弃上清；

加入75％乙醇，振荡混匀后，4℃，7500g离心5min，弃上清；

将RNA沉淀干燥；

加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，55℃～60℃孵育10min，得到总RNA溶液。

3.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液，具体为：

将外周血标本使用淋巴分离液分离出单个核细胞；

向单个核细胞沉淀中加入TRIzol，用移液管反复吹打多次，得到第一样品；

将第一样品于15℃～30℃放置5min后，加入0.2mL的氯仿，震荡15s后，15℃～30℃孵育2min～3min；

4℃下12,000g离心15min，吸取上层水相；

将水相转移到新离心管中，加入异丙醇，混匀后15℃～30℃孵育10min，得到第二样品，其中，异丙醇的加入量为制备第一样品时加入Trizol试剂量的1/2；

将第二样品于4℃，12,000g离心10min，使RNA形成RNA沉淀，弃上清；

加入75％乙醇，振荡混匀后，4℃，7500g离心5min，弃上清；

将RNA沉淀干燥；

加入无RNA酶的水溶解RNA沉淀，55℃～60℃孵育10min，得到总RNA溶液。

4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在分别提取各所述外周血标本中的RNA，得到RNA溶液之后，以及在采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据之前，所述构建方法还包括如下步骤：

对总RNA进行纯化，并测定总RNA中RNA含量。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，在对总RNA进行纯化，并测定总RNA中RNA含量之后，以及在采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据之前，所述构建方法还包括如下步骤：

检测纯化后的总RNA是否合格，是则执行后续步骤，其中，总RNA合格的标准为OD260/OD280比值应为1.8～2.1，且OD260/OD230比值要大于1.8。

6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，采用circRNA微阵列芯片分析疾病组和对照组RNA溶液中的circRNA表达谱，得到circRNA差异数据，具体为：

向RNA溶液中，加入RNA核糖核酸酶R，以去除RNA溶液中的线性RNA并富集circRNA；

对circRNA进行扩增，并利用随机引物法转录成荧光标记的circRNA；

纯化标记的circRNA，并对浓度和活性进行检测；

在1μg的每种标记的circRNA中加入5μL 10×封闭剂和1μL 25×裂解缓冲液，60℃保温30min以裂解circRNA；

加入25μL 2×杂交缓冲液稀释标记的circRNA；

将50μL杂交样品分配到垫片中并和circRNA微阵列表达垫片组装；

垫片在杂交炉中以65℃孵育17小时；

杂交阵列进行洗涤，并用Agilent G2505C固定，得到circRNA芯片；

使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描circRNA芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，得到circRNA差异数据。

7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，在纯化标记的circRNA，并对浓度和活性进行检测中，浓度和活性利用NanoDrop ND-1000测定。

8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，在所述RT-PCR中，RT-PCR引物包括β-actin引物、hsa_circRNA_400031引物、hsa_circRNA_102032引物、hsa_circRNA_103096引物、hsa_circRNA_102347引物，其中，

β-actin-F引物为GTGGCCGAGGACTTTGATTG；

β-actin-R引物为CCTGTAACAACGCATCTCATATT；

hsa_circRNA_400031-F引物为CTCCTCCTGTCTTTCTCCTCCTT；

hsa_circRNA_400031-R引物为GTCCTGTGGCTATGCTTTGTGA；

hsa_circRNA_102032-F引物为GATAAGGTAACAAGTCGATGGAT；

hsa_circRNA_102032-R引物为TGGAACTCTCTCTGGGGTGA；

hsa_circRNA_103096-F-R引物为GGCTACGGGAGGAGAACAAG；

hsa_circRNA_103096-R引物为TGCTGGCAATTCAAACACACAT；

hsa_circRNA_102347-F引物为GTTAGCAGATTTTCTTCGTTGTC；

hsa_circRNA_102347-R引物为TTCCTGTTTGGTTTGGTTCC。

9.一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型，其特征在于，由如权利要求1至8中任一项所述的构建方法制备得到。

10.一种PLC围手术期肝移植患者环状RNA差异性表达谱图谱模型的构建系统，其特征在于，采用如权利要求1至8中任一项所述的构建方法实现。