DE2548963A1 - Verfahren und mittel zur bestimmung der aktivitaet von creatinkinase-mb - Google Patents
Verfahren und mittel zur bestimmung der aktivitaet von creatinkinase-mbInfo
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Description
Merck Patent Gesellschaft 21, Oktober 1975
■mit beschränkter Haftung
Darastadt
Verfahren und Mittel zur Bestimmung der
Aktivität von Croatinkinase-I-IB
Oie 'tirfindung betrifft ein Verfahren und ein Mittel
Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in menschlichen
Körperflüssigkeiten.
Die Bestimmung der Aktivität der Greatinkinase (ATP;
Oreatin-Phosphotransferase, Ii.G. 2.7.3.2; Abkürzung: CK)
iifl Γ-oruGi gilt als empfindlichste Laborrnethode bei der
Diagnostik von Erkrankungen der Skelett- und iierzmuskulacur,
speziell· beim Myokardinfarkt, Die Unteracheidung
von TrauEjatisierungen der Skelett- und Herzmuskulatur,
üpcaicil bei der Difforontialdiagnose des Hjrokardi-nfarkts,
ist aber schwierig. Durch die Bestimmung der CK-Gesarataktivität
kann eine Differenzierung nicht mit Sicherheit erfolgen, Es ist deshalb versucht worden, die differentiölfliagnostische
Aussagekraft der Bestimmung der CK-Aktivität
zu erhöhen, indem man die Aktivität weiterer Enzyme im Serum mißt und die Meßergebnisse miteinander
korreliert, a.B. durch Bildung des Quotienten CK/
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Quotienten dieser Art erlauben jedoch eine Verwendung bei der Differenzierung
zwischen Her κ- und Lungeninfarkt oder zwischen Herzinfarkt
und Schock-Folgen aus anderer Ursache nicht.
CK kommt im Körper in Form von drei Isoenzymen vor, nämlich
CK-MM, z.B. im Muskel, CK-BB, z.B, im Gehirn und als Hybrid CK-MB (bestehend aus einer' Untereinheit M und einer
Untereinheit B), z.B. im Herzmuskel. Die im Blut (Serum) auftretende CK-Aktivität ist normalerweise auf das
Isoenzym CK-MM zurückzuführen, da CK-BB nicht durch die Liquor-Blut-Schranke hindurchtritt und CK-MB auf bestimmte
Organe (z.B. den Herzmuskel) beschränkt ist. Bei Schädigungen des Herzmuskels (z.B. beim Herzinfarkt)
wird CK-MB jedoch in das Blut (Serum) freigesetzt und läßt sich dort nachweisen.
Die quantitative Bestimmung dieses Isoenzyme neben CK-MM im Serum gilt als empfindlichste und differentialdiagnostisch aussagekräftigste
Labormethode zum Nachweis des Herzinfarkts, lieben dem Hersmuskel enthalten zwar noch einige weitere
Organe CK-MB (z.B. Pankreas, Zwerchfell, Aorta, Lunge und Uterus), jedoch ist die Aktivität in diesen Organen
um den Faktor 100 geringer als im Herzmuskel, so daß eventuell aus den genannten Organen freigesetzte CK-MB-Aktivitäten
unterhalb der Nachweisgrenze liegen.
Die bisher üblichen Aktivitätsbestimmungen von CK-MB gingen
im wesentlichen auf 3 Methoden zurück:
1. Elektrophorese auf verschiedenen !Trägern. Die hiermit erhaltenen Ergebnisse sind bisweilen widersrprüchlich;
oft treten mehr Banden auf, als Isoenzyme vorhanden sind (Artefakte).
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2. Chromatographie an verschiedenen Säulenmaterialien,
Diese Methode ist langwierig (mehrere Stunden effektiver
Arbeitszeit) und nicht für Routineuntersuchungen geeignet. Die Ergebnisse verschiedener Untersucher
sind teilweise widersprüchlich,
3. Immunologische Bestimmung mit präzipitierenden Antikörpern.
Diese Methode wurde in den deutschen Patentanmeldungen P 21 28 670 und P 22 58 822 beschrieben
und liefert z.B. bei der Quantifizierung von Isoenzymen der Aldolase und Alkalischen Phosphatase gute
Ergebnisse, Zur Bestimmung von relativ geringen Aktivitäten von CK und insbesondere von CK-MB reicht die
Empfindlichkeit der Methode jedoch nicht aus.
Alle diese Verfahren erfordern außerdem zur Durchführung einen größeren Zeitaufwand und sind deshalb für die Verwendung
bei der Schnelldiagnose des Hersinfarkts nicht geeignet.
Der Erfindung lag daher die Aufgabe zugrunde, ein einfaches, reproduzierbares und schnell durchzuführendes
Verfahren und ein Mittel zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit zu
entwickeln.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß
ein bisher nicht bekanntes Verfahren zur Verfugung gestellt wird, das mit spezifischen Antikörpern arbeitet,
welche die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB vollständig hemmen, ohne die enzymatische
Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren.
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Gegenstand der Erfindung ist dementsprechend ein Verfahren
zur Bestimmung der Aktivität von CK-MB in einer Probe einer
Körperflüssigkeit, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Probe gegebenenfalls in Gegenwart von CK-Substraten
mit Antikörpern inkubiert, die die enzymatisch^ Aktivität
der Untereinheit M in den CK-Isoenzymen MM und ICB vollständig zu heaaea vermögen, ohne die enzymatisch^
Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu
inaktivieren, und die Aktivität der CK-Untereinlie.it B in bekannter Weise Ohotcrnetricch bestimmt.
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Gegenstand dor Erfindung .Let ferner ein Mittel zur Bestimmung
der Aktivität von CK--MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit,
v/elches dadurch gekennzeichnet ist, daß es
neben einem bekannten Mittel zur enzyraatischen Bestimmung
der OK-Aktivität Antikörper enthält, die die enzyinatische
Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig au hemmen vermögen, ohne die enzymatisch^
Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Eine bevorzugte Ausführungsforra dieses Mittels
ist dadurch gekennzeichnet, daß die darin enthaltenen Antikörper in der zu bestimmenden Probo bis zu 2500 U/l der
Untereinheit M in CK-MM und GK-MB vollständig zu hemmen
vermögen.
Gegenstand der Erfindung ist außerdem die Verwendung dieses Mittels -zur Bestimmung der Aktivität von GK-MB neben
CK-IiK und insbesondere als Hilfsmittel zur Diagnose des
MyocardInfarkts und/oder anderer Erkrankungen bzv,'» Schädigungen
des Herzmuskels. Gegenstand der Erfindung ist ferner die Verwendung dieses Mittels zur SiraultanbestimiDung
der GK-Gesarotaktivitat und der GK-MB-Aktivität in
einer Probe.
Als Körperflüssigkeit ist für das Verfahren der Erfindung in erster Linie Human-Serum geeignet, Man kann jedoch auch
andere Körperflüssigkeiten wie Vollblut, Plasma, Harn, Sputum und Schweiß vom Menschen, aber auch analoges Untersuchungsmaterial
von Tieren zur Bestimmung heranziehen. GK-BB stört die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens
und darf deshalb in den zu testenden Körperflüssigkeiten nicht vorhanden sein.
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Die für das erf Inclunrsgomäße Verfahr en benötigten Antikörper
werden'durch Impfung von Tieren rait CIi-MM--Antigenen
gewonnen. Als Antigen wird dafür vorzugsweise menschliche CK-MM herangezogen. Es ist aber auch möglich,
CK-MM aus Tieren zu verwenden, wenn die damit hergestellten Antiseren die enzymatische Aktivität der Untereinheit
M in menschlicher CK-MM und CK-MB, gegebenenfalls auch in Gegenwart von CK-~Substraten, vollständig
zu hemmen vermögen, ohne die enzyraatische Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener CK-MB zu inaktivieren. Tierische
Spender γοη CK-MM-Antigenen sind in erster Linie die
verschiedenen Affenarten, vorzugsweise Rhesusaffen und Schimpansen, ferner Haustiere wie Schwein, Pferd, Rind,
Kaninchen, Meerschweinchen und andere liiere wie Ratten, Mäuse und Vögel wie Gänse, Enten, Hühner.
Das zur Herstellung der Antikörper verwendete CK-MM-Antigen
soll frei sein von den Aktivitäten γοη CK-MB
und CK-BB. Ein empfindliches Kriterium für diese Reinheitsforderung ist die immunologische Analyse, die vorteilhafterweise
mittels Diffusions« oder Elektrophoresetechnik durchgeführt wird« Daneben sind z,B, die Methoden
der analytischen Disk-Elektrophorese und der Polyacrylamid-Gel-Elektrofokussierung
nützlich, Bei Anwendung dieser Methoden hat der Nachweis der Reinheit gegenüber CK-MB und CK-BE Vorrang. Dagegen ist die absolute
Reinheit gegenüber anderen Proteinen, die z.B. durch die beiden zuletzt genannten Methoden ermittelt werden
kann, weniger wichtig. Die Mikroheterogenität von CK-Isoenzymtypen,
die sich z.B. in geringen Unterschieden der Aminosäurezusammensetzung der einzelnen Isoenzyme
äußern kann, spielt als Reinheitskriterium in der Regel keine Rolle.
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!Für die Immunisierung werden, solche Tiere herangezogen,
die nach Impfung mit aktivierter CK-MM Antikörper bilden, welche die enzyraatische Aktivität der Untereinheit M in
den. Creatinkinasen MM und MB vollständig zu hemmen vermögen,
ohne die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit B etwa vorhandener GK-MB zu inaktivieren. Vorzugsweise
eignen sich hierfür Ziegen, Es kommen jedoch auch andere Tiere, insbesondere Wirbeltiere, "als Antikörperspender
in Frage, z.B. Affenarten, Pferd, Rind und rinderähnliche Tiere, Schaf, Hund, Schwein, Kaninchen, Vögel wie
Hühner, Truthühner, Gänse und Enten, ferner Ratten, Mäuse, und Meerschweinchen. Ziegen werden insbesondere
zur Induktion solcher Antikörper herangezogen, welche in Gegenwart von GK-Substraten vollständige Hemmungen
der M-Untereinheit in CK-MB auszuüben vermögen.
Die Immunisierung der Versuchstiere wird nach der Erfindung mit aktivierter menschlicher oder tierischer CK-MM durchgeführt.
Die Aktivierung der.CK-IiM kann durch bekannte SH-Gruppen-stabilisierende
und -aktivierende Reagenzien und/ oder durch zweiwertige Metallionsn, vorzugsweise durch
eine Kombination der genannten Reagenzien und der Metallionen, erfolgen. Als SH-Gruppen-stabilisierende und
-aktivierende Reagenzien werden vorzugsweise z.B. F-Acetylcystein, Mercaptoäthanol und Dithioerytrit verwendet,
ferner Glutathion, Gystein, Dithiothreit, S-(2-Aminoäthyl)-isothiouroniurabromid-hydrobromid (AET), und/
oder Thioglykolsäure. Die zweiwertigen Metallionen entstammen entsprechenden wasserlöslichen Salzen (z.B. den
Chloriden oder Acetaten) vorzugsweise des Magnesiums, ferner des Mangans, Calciums und/oder Kobalts. Derartige
Aktivierungen sind grundsätzlich auf anderen Gebieten bekannt und dem Fachmann geläufig.
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Die weitere Durchführung dor Immunisierung und die Aufarbeitung
κ um Erhalt der Antikeren bsr.y. Antikörper erfolgt
in bekannter Weise, Auch die Verarbeitung und Aufbewahrung der
Antiseren bsw. Antikörper erfolgt nach in der Immunologie
bekannten Methoden.
Die für das erfindungsgemäße Verfahren zu verwendenden Antikörper sind vorzugsweise der IgG-Iramunglobulinklasse
(bivalente Antikörper) zuzurechnen. Ihr Molekulargewicht liegt zwischen etwa 130 000 und 210 000, vorzugsweise
bei etwa 160 000; ihre angenäherte Sedimentationskonstante liegt1 zwischen 6 S und 8 S5 vorzugsweise bei etwa
7 S:ihr TCohlenhydratanteil beträgt etwa 3 $ ihres Gesamtgewichtes.
Die erfindungsgeniäß angewandten Antikörper sollen die Enzymaktivität
der M-üntereinlieit: der Creatinkinase vollständig
hemmen. Unter "vollständiger Hemmung" wird hier eine Hemmung verstanden, bei der höchstens 5 U/l, vorzugsweise weniger als
3 U/l der Enz7/maktivität ei or Untereinheit M in CK-I-Bl und CII-I-IB
in einer Probe erhalten bleiben,
Die Antikörper sollen ferner die enzymatisch^ Aktivität
der B-Untereinheit der CK-MB nicht beeinflussen. Darunter soll hier verstanden sein, daß höchstens 10 U/l, vorzugsweise
weniger als 5 U/l, Enzymaktivität der Untereinheit B der CE-MB in einer Probe gehemmt werden.
Zur Durchführung einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens, die darin besteht, daß die
zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von CK-Substraten inkubiert
werden, sollen die Antikörper ferner die Eigenschaft
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haben, ihre hemmende Wirkung gegenüber der ensyrnatischen
Aktivität der Untereinheit M in OX-MK und CK-MB auch in
Gegenwart von CI£~Sub;jtraten vollständig entfalten zu "können,
ohne die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit B etv/a vorhandener OK-MB zu "beeinflussen. Diese Eigenschaft
ist z.B, "bei Antikörpern, die aus Ziegen durch Inramnisierung
rait vollaktivierter CK-MM gewonnen werden, zusätzlich
zu den obün gekennzeichneten Eigenschaften vorhanden.
Sie ist für die normale Durchführung des orfindungsgeinäßen
Verfahrens (zuerst Inkubation mit den Antikörpern, dann Zusatz der CK-Substrate und photometcische
Messung) nicht unbedingt erforderlich.
Als CK-Substrate können alle üblicherweise verwendeten
Substrate bzw. Effektoren eingesetzt werden. Im vorliegenden
Zusammenhang sind in erster Linie Creatin, Creatin
phosphat, Adenosindiphosphat, Ads-nosintriphosphat und
Magnesiumionen von Bedeutung.
Die Bestimmung der Restaktivität der GK und ihrer Isoenzyme
kann im Prinzip nach allen Verfahren erfolgen, die schnell und präzis arbeiten. Geeignet sind z.B, bekannte
Verfahren, die es erlauben, die OS-Aktivität nach Zusatz von CK-Substraten mittels einer an Hilfsreaktionen
anschließenden photometrischen Bestimmung su messen.
Hierfür lassen sich kinetische Methoden, bei denen · die Enzymaktivität durch Messung im UV bei 334, 340
oder 366 nm ermittelt werden, heranziehen. Bevorzugt ist z.B. eine Standardmethode, nach der CK unter Verwendung
von Creatinphosphat und Adenosindiphosphat bestimmt wird (Z. Klin. Chera. Elin, Biochem., Band 8,
Seite 658 ff (1970) und Band 10, Seite 182 (1972)). Testpackungen zur Bestimmung der CK-Aktivität nach
dieser Methode sind im Handel.
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AZ
!fach- einem anderen. bo>ernten Bestinnuungsverfahron kann
CK auch fluorometrisch bestimmt werden. Durch GK läßt
sich aus Greatinphosphat Greabin freisetzen, welches
nach dem von R.B. Conn (Clin. Ghera., Band 6, Seite 537 f
(196O)) ausgearbeiteten Verfahren durch Reaktion mit Ninhydrin in stark alkalischer Lösung fluorometrisch gemessen
werden kann (vgl, Sax et al, Clin. Chera., Band 11, Seite 951 f (1965)).
Eine typische Ausführung des erfindungsgemäßen Verfahrons
wird im folgenden erläutert;
Die zu bestimmende Probe der Körperflüssigkeit, vorzugsweise
eine Probe von Huraanserum, wird mlU einer Menge von
CK-MM-Antikörpern versetzt, weiche ausreicht, bis zu
2500 U/l der Untereinheit M in CK-MM und CK-MB, vorzugsweise
etwa 1000 U/l, vollständig zu hemmen. Bei Körperflüssigkeiten mit höheren G-esarat-CK-Aktivitäten wird
zweckmäßigerweise vor der eigentlichen Bestimmung eine VorVerdünnung auf etwa 1000 U/l vorgenommen. Diese Vorverdünnung
ist bei der Berechnung zu berücksichtigen. Man mischt und inkubiert während etwa 1 bis 30, vorzugsweise
etwa 5 Minuten, bei Temperaturen zwischen +10 und +40 0C,
vorzugsweise etwa bei Raumtemperatur, speziell bei 25 oder 30 C. Danach wird die restliche Enzymaktivität des
Reaktionsgemisches mit Hilfe eines bekannten Verfahrens, vorzugsweise mit der oben beschriebenen UV-Methode, ermittelt.
Man gibt die Serum-Antikörper-Mischung zu einem bekannten Enzym-Coenzyra-Substrat-G-emisch, das alle zur
Durchführung der Methode erforderlichen Enzyme, Coenzyme und Substrate enthält, und fügt anschließend eine ausreichende
Menge einer Pufferlösung (pH etwa 7) hinzu. Übliche Handelspräparate enthalten z.B. als Snzym/Coenzym-
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Gemisch Hexokinase, Glucose-ö-phosphu l;--dehydrogfcmüse,
Adeuosindiph.osph.at und Nico binamid-adenin-dinucleotid·-
phosphat und als Substrate Ceeatinphosphat und Glucose.
Es ist auch möglich, die Serum-Antikörper-Mischung zu
einem Gemisch, aus Coenzyra und Enzym zu geben (oder umgekehrt)
und anschließend ein Puffer-Subetrafcgemisch
hinzuzufügen. Als Puffer eignen sich für die Umsetzung ITeutralpuffer, wie z.B. bevorzugt Triethanolamin- oder
IiBidajäolace tatpuff er, ferner u.a. Morpholinpropansulfonsäure-
und Morpholinächansuifonsäure-puffer. Man mischt,
.inkubiert etwa 1 bis 10, vorzugsweise 5 Minuten, bei 15 - 40,
vorzugsweise bei 25 oder 50 0G, und ermittelt darauf etwa
bei Raumtemperatur die Änderung der Extinktion. Daraus wird anschließend die Aktivität der Untereinheit B in
OK-MB errechnet.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann dieses Verfahren dahingehend abgewandelt v/erden, daß die Probe der zu
analysierenden Körperflüssigkeit mit den Antikörpern und den CK-Substraten in Gegenwart eines Puffers und den für
die Ifachweisreaktion erforderlichen Substanzen zusammen
inkubiert wird (ohne Vorinkubation der Probe mit den Antikörpern). 3?ür diese Ausführungsform ist eine weitere
Eigenschaft der Antikörper Voraussetzung: sie müssen die enzymatische Aktivität der Untereinheit M von CK-MM
und -MB auch in Gegenwart von CK-Substraten vollständig hemmen." Diese Eigenschaft besitzen z.B. die Antikörper,
die mittels voll aktivierter CK-MM aus Ziegen gewonnen werden. Sie ermöglichen es, das Verfahren der vorliegenden
Erfindung in einfacher und schneller Art durchzuführen:
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So kann ruari 53,13. die Al. tikörper, die zuvor mit den "bekannten,
für die Nachweisreakbion verwendeten Coeiizym-Enzym-Substrat-Gemisch
in eine lyophilisierte lOrra gebracht wurden, in einer bestimmten Menge einer Pufferlösung
auflösen, die zu bestimmende Körperflüssigkeit (z.B. Serum) hinzugeben und die Aktivitätsbestiraraung des B-An-■
teils von CK-MB durchführen. In einer Variante dieses Verfahrens kann man die Antikörper auch mit einem Gemisch, "be
stehend lediglich aus Coenzymen und Enzymen, in das Lyoph.il
is at einarbeiten und die Substrate der Pufferlösung hinzufügen.
Hach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform kann
eine Simultanbestiaruung der-OK-Gesamtaktivität und der
GK-HB-Aktivität unter Zuhilfenahme des soeben beschriebenen,
bevorzugten Verfahrens der Erfindung in einem einzigen Ansatz durchgeführt v/erden. Mann kann z.B. so
vorgehen, daß man zunächst die CK-Ge sam taktiviijät der
Probe nach einem bekannten photometrischen Verfahren bestimmt; anschließend gibt man zu dem selben
Ansatz ein in Wasser gelöstes T^ophilisat, bestehend aus
CK-MM-Antikörpern. Dann inkubiert man etwa 1 bis 10, vorzugsweise
5 Minuten und bestimmt die Restaktivität dor Probe photometrisch. Auch für diese Ausführungsform ist Voraussetzung, daß die Antikörper gegen CK-MM
die enzymatieche Aktivität der Untereinheit M von CK-MIi
und -MB auch in Gegenwart von CE-Substraten vollständig
zu hemmen vermögen.
Man kann die Antikörperkapazität der Antiseren bei diesen bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen
Verfahrens so einstellen, daß sie bis zu 2500 U/l,
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vorzugsweise etv/a 1OOO U/l, dor Untereinheit 11 in CK-MM
und CX--MB vollständig zu hemmen vermögen. Falls die QK-Gesamtaktivitaten
der zu bestimmenden Pro"be für diese Hemmkapazitäten der Antikörper au hoch sind, raus sen auch
hier Yorverdünnungen vorgenommen werden, z.B. auf Aktivitäten
der Untereinheit M in CK-KM und -M3 von etv/a
-1000 U/l.
Bas Verfahren der Erfindung hat gegenüber dem Stand der
!Technik beträchtliche Vorteile. Dazu zählen die hohe Präaision der 'Ergebnisse und die Schnelligkeit sowie
die Einfachheit der Durchführung.
Die Präzision des Verfahrens der Erfindung ist darauf zurückzuführen, da3 die verwendeten Antikörper spezifisch
auf die M-Untereinheit von CX-MM und OK-MB ansprechen
und en deshalb erlauben, die CK-MB--Aktivität
in Körperflüssigkeiten, wie dem Humanserum, in einer
Direkiüe«t:u7H!jUxj£. au ermitteln.
Demgegenüber besitzt das in den deutschen Patentanmeldungen P 21 28670 und P 22 58 822 beschriebene immunologische
Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Isoenzymen rlachteile. ITacn diesen Verfahren präaipitiert
man die Isoenzyme der CK durch isoenzymspezifißche,
präzipitierende Antikörper und ermittelt jeweils die i"ffl Überstand der Iimnunpräzipitation verbleibende
Restaktivität. Abgesehen von dem Aufwand dieser Methode, die in der Regel die Herstellung von mehreren spezifischen
Antiseren erforderlich macht, müssen in jedem Falle mindestens zwei verschiedene Testansätze durchgeführt
werden, nämlich die Bestimmung der CK-G-esarataktivität
und die Bestimmung der OK-Restaktivität nach Präzipi-
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ta tion. Die CK-HB-Ak!.; I ■/: f:U kann also erst durch eine
Differenzmessung ermittelt werden. Dan Ergebnis ist
daher entsprechend den Regeln der Fehlorreehnung mit
der Unsicherheit "beider Messungen "belastet. 3Jacn der
erfindungsgemäSen Methode wird die Fehleraddition dagegen vermieden und eine Direktmessung durchgeführt.
Ein lachteil des Präzipitationsverfahrens ist auch, daß
die Immun-Präzipitation als Sekundärrealction verhältnismäßig
viel Zeit (ca, 60 Minuten Ms mehrere Stunden) beansprucht, so daß sich das Verfahren nicht als Schnell
test eignet.
In Olin. Chira. Acta, Band 58, Seiten 223 - 232 (1975)
wurden auch bereits hemmende Antikörper gegen CK-Isoen-
^y roe beschrieben. Diese Antikörper bewirken neben einer
100 '/!igen Hemmung von CK-IM auch eine 80 °/o±ge Hemmung
von CK-MB. Über die M-Urifcereinheit von CPC-MB hinaus
wird also ein wesentlicher Anteil der B-Untereinheit
von den verwendeten Antikörpern gehemmt (Die Aktivitäten der Untereinheit M und B in CK-MB verhalten sich
zur Gesamtaktivität dieses Isoenzyms jeweils wie etwa 50 : 100). Selbst wenn die mit diesen Antikörpern gefundene
-Restaktivität von etwa 20 fo reproduzierbar wäre,
so wurden die erhaltenen Werte doch für eine präzise
Messung ύοώ. CK-MB zu niedrig liegen, um noch sicher erfaßbar
zu sein, da die CK-Gesamtaktivitat ira Serum an
sich schon niedrig ist. Die in dieser .Literaturstelle beschriebenen hemmenden Antikörper wurden entsprechend
auch nicht für eine Bestimmung der CK-Isoensyme nach dem Hemraprinzip angewendet, !lach dem Verfahren der Erfindung
bleiben dagegen noch etwa 50 fo der OK-MB-Aktivität,
d.h. etwa die gesamte Aktivität der Untereinheit B, für die Messung zugänglich. Das bedeutet einen erheblichen
Fortschritt.
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Die schnelle Durchführbarkeit ist ein besonderer Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens. Das gilt besonders
für die bevorzugte AusführungsforiQ, nach der die Hemmung
des M-Ante ils von GK-I-M und CK-MB sowie die Bestimmung
der Restaktivität gleichzeitig durchgeführt v/erden. Nach dieser Ausführungsform kann in kürzester Zeit, z.B.
innerhalb von 5 bis "50 Minuten, vorzugsweise zwischen
5 und 15 Minuten, ein exaktes Testergebnis für die Diagnosestellung zur Verfügung stehen.
Ein beachtenswerter Vorteil des Verfahrens der Erfindung ist auch die einfache Durchführbarkeit. Die Testmethode
kann in größeren Instituten bzw. Kliniken (z,B. mit Hilfe
von üblichen mechanisierten Geräten zur Bestimmung von Enzymaktivitäten) durchgeführt werden, ist aber auch in
kleineren Instituten bzw. im Arztlabor mit Hilfe eines Photometers durchführbar.
I1Ur Einzelbestimmungen eignen sich Testpackungen, die
alle zur Durchführung des erf indungs gemäßen Verfahrens
notwendigen Reagenzien enthalten, so z.B, ein übliches Gemisch aus Coenzym, Enzym und Substrat, erfindungsgemäßen
GK-ΜΓί-Antikörpern und einer Puffer-Lösung. Eine Testpackung
dieser oder ähnlicher Art ermöglicht die Bestimmung von GK-MB mit geringstmöglichem Aufwand.
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Nach dem Stand der Technik \var nicht zu erwarten, daß
sich das Problem der CK-MB-BeStimmung Mittels eines so
einfachen und schnell arbeitenden Verfahrens wie dem erfindungsgeraäßen Verfahren lösen läßt. So war nicht
vorauszusehen, daß spezifische Antiseren hergestellt ■werden können, welche zwar die ensymatische Aktivität
der Untereinheit M in GK-HM und -MB vollständig hersmen,
aber die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit B von CK-MB nicht beeinflussen. Der Einsatz von Antikörpern
mit dienen bisher nicht bekannten Eigenschaften ermöglicht
erst die erfindungsgemäße Reaktion.
Überraschend ist auch, daß die nach der Erfindung eingesetzten
Antikörper auch in Gegenwart von Substraten ihre volle Heraiakraft beibehalten. Das ist nicht selbstverständlich.
So wurden in der Literatur (Ann. N.Y. Acad. Sei., Band 103, Seiten 858 - 889 (1963)) Antikörper beschrieben,
die in Gegenwart von CK-Substraten CK-MM nicht mehr zu 100 c/o inaktivierten, Antikörper mit derartigen
Eigenschaften wären für die bevorzugten Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens, nach
denen Antikörperhemmung und Zusatz von CK-Substraten gleichzeitig erfolgen, völlig unbrauchbar. Die nicht
gehemmten Anteile der M-Aktiyitäten wurden den Meßwert
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von CK--K3 fälschlicherweise erhöhen (der Anteil von OK-MB
an der CK-Gesömtaktivität beträgt nur in Ausnahmefällen
mehr als 20 $), eventuell gar nicht vorhandene CK-ΪΠί-»
Aktivitäten vortäuschen und auf diese ¥eis e fηIsche
Labordaten für die Diagnose liefern.
Die überraschende Eigenschaft der erfindungsgemäß eingesetzten Antikörper, die enzymat'ische Aktivität der Untereinheit
M von GK-IM und -MB vollständig zu hemmen, ohne die enzyraatische Aktivität der Untereinheit B von
CK-MB zu beeinflussen und zugleich in Gegenwart von Substraten ihre volle Herainkraft gegenüber der Untereinheit
M in CK-MM und CK-MB zu entfalben, ermöglichen eine bisher mit immunologischen Methoden unerreichbare
Schnelligkeit und Präzision der CK-MB-Aktivitäts-Bestimmung*
Dadurch eröffnet eich für die Praxis ein Wog, die
CK-~MB«Aktivität mit einem Schnelltest zu bestiirraen.
Es wird möglich, den Laborbofund einer Erhöhung der CK-Aktivität
beim Patienten dahingehend zu differenzieren, ob sine Erkrankung bsv;. Traunjatiöierung von Skolctt-
oder Herzmuskulatur vorliegt. Dadurch erhält man -wichtige
zusätzliche Daten für die Differentialdiagnose des Herzinfarkts (z.3. vom Lungeninfarkt und/oder von Schockfolgen)
und anderer Erkrankungen bzv/, Schädigungen des Herzens.
Darüber hinaus erhält man durch die spezifische und exakte Bestimmung der Aktivität von CK-I1IB Aussagen über
die Beteiligung bzv/, Schädigung des Herzmuskels bei anderen Krankheitsprozessen (z.B. bei Vergiftungen), bei
therapeutischen Singriffen (z.B. bei der Wiederbelebung) oder bei diagnostischen Eingriffen (z.B. bei Herzkatheterisierungen
oder Coronar-Angiographien).
709818/092S
In den folgenden Beispielen bedeuten "M" (bzw. "mM") die
Konzentrationen in Mol (bzw. Millimol) pro Liter.
Hemmung von CK-MM, CK-MB und GK-BB durch Anti-Human-CK-MM
Zu einem bezüglich seiner CK-Eigenalctivität inaktivierten
Hum ans or ura1 werden, reine CK-MM, CK-MB oder CK-BB gegeben,
und die CX-Aktivitaten der einzelnen Proben werden bestimmt. Anschließend wird 0,1 ml Probe mit 0,1 ml Anti-CK-IiM-Iösung
(erhalten nach Beispiel Ba)) versetzt, ea wird gemischt und 5 Minuten bei 25 0C inkubiert. Danach erfolgt
eine Bestimmung der CK~Restaktivität auf bekannte
Art. Die Ergebnisse zeigt folgende Tabelle:
Restaktivitäten von OK-Isoenzymen nach Inkubation
mit inhibierendem Anti-Human-CK-MM (Mittelwerte -1s aus jeweils 5-fach-Bestiramungen) (s = Standardabweichung)
| Isoenzym | Aktivität der zugesetzten Isoenzyme (U/l) |
Restaktivität nach Inkubation mit Anti- OK-MM (U/l) |
| GK-MlVI · | 98 ± 1,9 1043 ± 22 |
0,3 ± 2,1 0,5 ± 2,5 |
| GK-MB | 103 i 2,0 410 ± 7,8 |
53 ± 1,7 206 i 6,.2 |
| CK-BB | 197 ± 3,8 | 199 i 4,1 |
709818/0925
Innerhalb der Meßgenauigkeit werdet? die Aktivitäten von
CK-MM zu 100 #, von CK-BB zu O # und von CK-KB (entsprechend
den Anteil von 50 °ß>
M-Untereinheiten) zu 50 cß>
gehemmt. Die Ergebnisse sind über einen weiten Aktivitätsbereich der zugesetzten Isoenzym-Aktivitäten konstant,
Test I zur quantitativen Bestimmung der Aktivität von
CE-MB in Körperflüssigkeiten
a) Zusammensetzung der Testpackung
Die Testpackung ist ausreichend für 10 Aktivitätsbestimtnungen.
Die Packung enthält 1 Flasche Puffer für 10 Bestimmungen, 10 Flaschen Coenzym-Snzym-Subsbrat-Gemisch
und 1 Flasche Anti-CK-MM, erhalten nach Beispiel Ba).
Die Flasche Ooenzyra-Enzym-Substrat-Gemisch enthält:
Creabinphosphat-Dinatriumsalz, Hexahydrat 27,24mg
Glutathion reduziert 6,4 mg
(oder 1T-Acetyl~cystein 3,4 mg)
Adenosindiphosphat-Dinatriumsalz,
Hexahydrat 1,25 mg
JTicotinaraid-adenin-dinucleotid-phosphat,
Dinatriumsalz 1,7 mg
Adenosin-monophosphat, Dinatriurasalz 8,47 mg
Hexokinase 5 U
Glucose-ö-phosphat-dehydrogenase 3 TI
Glucose 8,32 tng
Magnesiumacetat 4»52 mg
709818/0925
OIe flasche Puffer-Lösung enthält:
Triäthanolamia-aeetat (in Wasser) 105
Die lyophilisierten Antikörper werden mit 2 ml destilliertem
Wasser aufgelöst. Die entstehende Antikörperlösung ist so eingestellt, daß "bis zu 1000 U/l Creatinkinase-MM total
gehemmt werden, Bei Seren mit extrem hohen Gesarat-C.reatinkinase-Aktivitäten
muß das Serum 'deshalb auf ca. 1000 U/l vorver dünnt v/erden. Die Antikörper lösung ist bei +4
mindestens 7 Tage haltbar.
L) Ausführung der Aktivibätsbestimmung der GK-MB
1)1) Ausführung
In ein ReaktionsgefäS pipettieren:
0,1 ml Serum
+ 0,1 ml Antikörperlösung
Gut mischen, 5 Minuten "bei 25 ° inkubieren, Danach werden 0,1 ml dieses Reaktionsgeraisches sov/ie 2,0
ml Puffer-Lösung in eine Flasche mit dem Gemisch von Ooenzym, Enzym und Substrat gegeben.
Mischen, 5 Minuten bei 25 0G inkubieren, danach in
eine Küvette gießen, die Extinktion bei 25 0G
messen und anschließend die Sxtinktionsänderung pro Minute bestimmen. Wellenlänge: 334, 340 oder
366 nm; Schichtdicke: 1 cm.
b2) Berechnung
Die ermittelte CK-Aktivität der Probe muß
a) mit dem Verdünnungsfaktor 2 und
b) mit dem OK-MB-Hybridfaktor 2
(im Test werden nur die B-Untereinheiten von
CK-MB gemessen) multipliziert werden.
709818/0925
Aus den Extinlcbionsd iff «ranzen pro Minute (_£\E/Minute)
v/ird der Mibtelwert gebildet und in die entsprechende
Berechnungsformel eingesetzt:
Kessung Tdei 334 nm: Volum enalctivität-CK-MB =
Kessung Tdei 334 nm: Volum enalctivität-CK-MB =
/^E/Minute χ 4 x 3500 U/l
Messung "bei 340 nm: Volumenaktivität-CK-MB =
J\ß/Minute χ 4 x 3376 U/l
Messung bei 366 nm· Yolumenaktivität-CK-MB =
/\S/Mirmte χ 4 x 6364 U/l
2esü II zur quantitativen Bestimmung der CK-JIB-Aktivität
in Körperfliissiglceiten
a) Zusaraaensctzung der Testpaclcung
Die Testpaclrang ist ausreichend für 30 AktivitätsbestiraTnungen.
Die Packung enthält 1 Plasche Puffer-Lösung für 30 Bestimmungen und 30 Flaschen
eines lyophilisierten Gemisches bestehend aus Coenzym,
Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba).
Die in der Flasche Puffer-Lösung enthaltene Menge iCriäthanolaminacetat entspricht der im Beispiel 2a)
angegebenen Menge. Die einzelnen Flaschen mit dem Gemisch
aus Goenzym, Enzym, Substrat und Anti-CK-MM nach Beispiel Ba) entsprechen bezüglich der drei zuerstgenannten
Komponenten ebenfalls der in Beispiel 2a) angegebenen Zusammensetzung und enthalten zusätzlich Anti-CX-MM,
das bis zu 1000 ü/1 CK-MM total hemmt.
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b) EeStimmung der Aktivität von GK-MB
b1) Ausführung
Zum Inhalt einer Flasche Goenzym/Enzym/Substrat/ Anti-CK-MM-Geroisch werden 2,0 ml Puffer-Lösung
und 0,1 ml Serum pipettiert. Mischen, 5 Minuten "bei 25 G inkubieren, dann in eine Küvette gießen
und über 5 Minuten die Extinktionen bei 25 0C
messen. Wellenlänge: 334·, 340 oder 366 nra; Schicht-■
dicke: 1 cm.
b2) .Berechnung
Aus den Extinktionsdifferenzen pro Minute (/\E/
- - Minute) wird der Mittelwert gebildet und in die entsprechende Berechnungsforrael eingesetzt:
Messung bei 334 nm: Volumenaktivität CK-MB =
^E/Minute χ 7000 U/l Messung bei 340 nra: Voluraenaktivität GK-MB =
^E/Minute χ 6752 U/l
Messung bei 366 nxn: Volumenaktivität GK-MB =
E/Minute χ 12728 U/l
Simultanbestimmung der CK-Gesamtaktivität und der GK-MB-Aktivität
a) Zusammensetzung der Testpackung
Die Zusammensetzung der Testpackung entspricht derjenigen
von Beispiel 2a),
709818/0 9 25
b) Bestimmung dor CK-Ggöarataktivitat und der CK-MB-Aktivität
von CK-MB
"ta1) Ausführung
In die Flasche Coensym-Enzym-Substrat-Gemisch
werden 2,0 ml Puffer-Lösung und 0,1 ml Serum bzw Serutaverdünnung pipettiert. Mischen, 5 Minuten
"bei 25 0G inkubieren, danach in eine Küvette
gießen und über 2 Minuten die Sxtinktionsänderung
(^\E1) bei 25 0C bestimmen. Inschließend
v/ird 0,1 ml .Antikörperlösung zugefügt, sofort
gemischt und nach 3 Minuten erneut die Extinktionsänderung (^\E2) bei 25 0C bestimmt. Wellenlänge:
334* 340 oder 366 mn; Schichtdicke: 1 cm.
b2) Berechnung
Die CE-Gesamtaktivitat errechnet sich wie folgt:
Messung bei 334 mn: Volumenaktivität CK-Gesamt =
/^B 1 /Minute χ 3500 TJ/1
Messung bei 340 nm: Voluraenalctivität CIC-Gesamt -
^E1/Mtnute x 3376 U/l
Messung bei 366 nm: Yolumenaktivität CK-Gesamt =
2\E1/Minute χ 6364 U/l
Die CK-I-IB-Ak b ivi tat ergibt sich nach folgenden
Berechnungsformeln:
Messung bsi 334 nm: Volumenaktivität CK-MB =
^E2/Minute χ 7350 U/l
Messung bei 340 nm: Volumenaktivität CK-MB =
/\^?/Minute χ 7090 U/l
Messung bei 366 nm: Volumenakbivität CK-MB =
/\E2/Minute χ 13364 U/l
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Bei ,spiel 5
Bestimmung ύοπ OK--I£B~-A.ktivitäten bei Patienten mit und
ohne Herzinfarkt rait Sestpackung nach Beispiel 3
a) OK-Aktivitäten verschiedener Patientenkollektive
Patienten ta it erhöhten CK-Aktivitäten
ohne Herainfarkte
Fallzahl
Mittelwerte Gesarat-CK OK-MB (U/l)
< 1,7
Patienten mit Herzinfarkten
510
44
Die Tabelle zeigt, daß mit Hilfe der erfindungsgemäßen Best
immungsmethode schnell und eindeutig ein Hinweis auf einen
Hersinfarkt erhalten werden kann.
"b) Verlauf der CE-I-IB--Aktivitäten bei einem Patienten mit
Hersinfarkt
Stunden nach Infarkteintritt
3,5
4,5
5,5
7,5
8,5
9,5
10,5
11,5
13,5
15,5
GK-ICB
<· 5
22 23 29 50 46 56 55
709818/0925
17,5 21,5 25,5 29,5 33,5 43,5 53,5 61,5
64 62 50 42 25 18 <5
Die Zahlenderte zeigen den nach dem erfindungsgeaäßen
Verfahren "bestimmten Anstieg und Wiederabfall der CK-MB-Akfcivität
"bei einem Herzinfarkt-Patienten.
Herstellung der Ausgangsmaterialien Beispiel A Herstellung von CK-MM
a) 1,2 kg tiefgefrorener, menschlicher Skelettmuskel werden
bei Raumtemperatur aufgetaut und maschinell zerkleinert.
Das Gewebe wird in 2,5 1 kaltem 0,05 M Tris/ HCl-Puffer pH 8.0 [Tris-(hydro2?p}ethyl)-aminomethan-HCl-Puffer],
der 0,01 M KCl, 1 τπΜ EDTA [Äthylendiamintetraessigsäure]
und 1 tdI-I Dithioerythrit enthält, suspendiert
und mit einem Mixer homogenisiert. Das Homogenat
\-/ird unter Eiskühlung 45 Minuten gerührt und anschließend
60 Minuten bei 12000 g zentrifugiert. Der klare Überstand (2,680 1) wird einer Ammoniuiasulfat-Fraktionierung
bei pH 8,0 in den Grenzen 40 - 75 °ß>
.Sättigung unterworfen. Der 0,75 s-Niederschlag wird
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in. 0,04 M T.ris/HC'l~.ru:'.for pH 8,0 aufgenommen und gegen
den gleichen Puffer dialysiert. Zur Adsorption von Myoglobin und sauren Ballastprobeinen v/erden 500 g feuchter
"basischer Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans, äquilibriert gegen den gleichen Puffer, zugesetzt,
Nach 30 Minuten wird der Austauscher abgesaugt und zweimal mit je 400 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer
pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, ausgewaschen. Filtrat und Waschwasser werden vereinigt und mit
Arnmoniurasulfat auf 0,75 s gebracht. Der Niederschlag
wird abzentrifugiert, in 100 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer
pH 8,0 gelöst und gegen den selben Puffer dialysierb, bis
kein Araraoniurasulfat mehr nachweisbar ist. Das klare Dialysat
wird auf einer Säule mit einem basischen Ionenaustauscher auf Basis eines vernetzten Dextrans
(6 χ 60 eis) ta it dem gleichen Puffer äquilibriert. Die
Säule wird rait Startpuffer solange gewaschen, bis das Sluat proteinfrei ist. Danach wird das Enzym mit 0,04
M Tris/HCl-Puffer pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM
EDTA und 1 raM Dithioerythrit, von der Säule eluiert. Fraktionen mit einem Enz'yragehalt von mindestens 20 U/ml
v/erden vereinigt, mit Ammoniumsulfat auf 80 fo gesättigt,
und das präzipitierte Enzym wird abzentrifugiert.
Zur Endreinigung wird es nochmals einer Chromatographie im selben System unterworfen, jedoch unter
Verwendung eines kleineren Säuleinvoluraens. Aus den
vereinigten aktiven Fraktionen wird das Enzym rait 0,8 s Aramοniumsulfat- gefällt, in 50 ml 0,04 M Tris/HCl-Puffer
pH 8,0, enthaltend 0,02 M NaCl, 1 mM EDTA und 1 mM Dithioerythrit, konzentriert gelöst, steril-filtriert
und wieder mit Ammoniumsulfat auf 0,8 s gebracht. Man erhält so eine bei 4 0C stabile Enzymsuspension von
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σκ-ϊ€·ϊ mit einer spezifischen Aktivität von 26 - 30 U/mg,
gemessen mit Creabin als Substrat bei 25 0G.
Volumen: 86 τηΐ; Aktivität; 316 ü/ml; Protein: 11,8 Tag/ml.
Ausbeute: ca. 30 $ (bezogen auf den Organextrakt).
b) Analog Beispiel Aa) wird CK-Μίί aus Muskelgewebe folgender
Tiere isoliert: Rhesusaffe, Schwein, Rind,
Herstellung von Anti-GK-MM.
a) CK-MM aus Humanmuskel wird gegen eine mit 0,07 M !Eriäthanolamin gepufferte, physiologische ITaGl-Iiösung
pH 7,0, die 10 raM Mercaptoäthanol und 10 mM MgGIg enthält, dialysiert. Die Bnzymlösung wird durch
Ultrazentrifugaticri von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf
2 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird mit 1 ml komplettem
Freund'sehen Adjuvans (Wasser-Mineralölsuspension,
die zusätzlich noch 2 mg abgetötete M-Tuborculosebazillen
enthält) emulgiert. Diese Emulsion wird einer Ziege intramuskulär injiziert. Nach 3 Injektionen
gleicher Art im Abstand von 3 ΐ/ochen und 3 weiteren
Boosterinjektionen jeweils im Abstand von 16 Wochen wird dem Tier 21 Tage nach der letzt Injektion Blut
entnommen. Das nach bekannten Methoden gewonnene Serum wird mit einer Mischung, enthaltend 3 /» Schaf-Serumalbumin
und 0,1 $ üTatriumassid in einem 0,1 M Boratpuffer,
auf pH 8,4 eingestellt und sterilfiltriert. Die erhaltene Lösung, enthaltend Anti-Huraanmuskel-CK-MM,
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v/ird in 0^5 τπΙ-Por-t ionen in "braune Glasflaschen abgefüllt
und gefriergetrocknet. Die Antikörper besitzen ein Molekulargewicht von etwa 160 000 bis 180 000.
b) Die nach Beispiel Aa) erhaltene CK--HM aus flumanmuskel
wird gegen eine rait 0,1 M Iraidazol gepufferte, physiologische
ITaGl-Lösung pH 6,8, die 7,5 mM H-Acety1-cystoin
und 25 raM Magnesiumacetat enthält, dialysiert.
Anschließend v/ird die Enzymlösung durch Ultrazentrifugation
von Aggregaten befreit und der Proteingehalt mit dem genannten Dialysepuffer auf 0,2 mg/ml
eingestellt. 1 idI dieser Lösung wird rait 1 ml komplettem Freund·sehen
Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion ivird einem Hammel
intradermal injiziert, riach 3 und 6 Wochen folgen 2
intramuskuläre Injektionen und 3 weitere Boosterinjektionen, jeweils im Abstand von 14 Wochen. 19 Tage
nach der letzten Injektion wird Blut entnommen, Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält
Anti-HuBianmuskel-CK-MM in gefriergetrockneter Form.
Molekulargewicht der Antikörper etwa 160 000 bis 180 000,
c) CK-M aus Bhesusaffemnuskel wird gründlich gegen eine
mit 0,15 M Imidazo! gepufferte, physiologische HaCl-*
Lösung pH 6,8, die 25 tdM Dithioerythrit und 15 mM
Mangan(II)-chlorid enthält, dialysiert. Nach Entfernung
der Aggregate durch Ultrazentrifugation wird der
Proteingehalt tnit dem genannten Dialysepuffer auf 5 mg/ml eingestellt. 1 ml dieser Lösung wird
mit 1 ml komplettem
Freund'sehen Adjuvans emulgiert. Injektionen, Blutentnahme
und Aufarbeitung erfolgen analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Rhesusaffenmuskel-CK-IM in gefriergetrockneter
Form. Sedimentationskonstante der Antikörper etwa 7 S.
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d) CK-MM aus Sehv/einemuskel wird analog Beispiel Bb)
aktiviert und die Anbigen-Emulsion mit komplettem
Freund'sehen Adjuvans Kaninchen injiziert, liaeh 3
Wochen erfolgt eine weitere subcutane Antigeninjektion.
Die Injektion wird nach weiteren 3 Wochen wiederholt, 19 lage danach wird Blut entnommen.
Die Aufarbeitung erfolgt analog Beispiel Ba). Man erhält Anti-Schweineiauskel-CK-MM in gefriergetrockneter
3?orm. Molekulargewicht der Antikörper etwa
160 000 bis 180 000.
160 000 bis 180 000.
In völlig analoger Weise wird au3 liindenauskel Anti-Rindermuskel-CK-MM
gewonnen (Molekulargewicht etwa 160 000 bis 180 000).
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Claims (9)
- Pa be nt'-■ ^Sprüche.J Verfahren zur Bestimmung der Aktivität von Greatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit Antikörpern inkubiert, die die enssymatische Aktivität der Untereinheit M in den Greatinkinase-Isoenzymen-MM und -MB vollständig su hemmen vermögen, ohne die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit Ώ etwa vorhandener Creatinkinase-MB au inaktivieren, und die Aktivität der Oreatinkinase-Untereinheit B in bekannter "else photouietriseh bestimmt.
- 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe der Körperflüssigkeit und die Antikörper in Gegenwart von Creatinkinase-Substraten inkubiert.
- 3. Verfahren nach den Ansprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Inkubation der Probe mit den Antikörpern in der gleichen Probe zusätzlich die GK-Gesamtaktivität bestimmt.
- 4. Mittel zur Bestimmung der Aktivität von Creatinkinase-MB in einer Probe einer Körperflüssigkeit, dadurch gekennzeichnet, daß es neben einem bekannten Mittel zur enzymatischen Bestimmung der Greatinkinase-Aktivität Antikörper enthält, die die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit M in den Creatinkinasen-MM und -MB vollständig zu hemmen vermögen, ohne die enzymatisch^ Aktivität der Untereinheit. B etwa vorhandener Creatinkinase-MB zu inaktivieren.709818/0925ORIGINAL INSPECTED
- 5. Kittel nach Anspruch 4* dadurch gekennzeichnet, daß es Antikörper enthält, die auch in Gegenwart you Creatinklnaso-Substraten eine vollständige Hemmung zu entfalten vermögen.
- 6. Mittel nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet} dai3 es aus Ziegen gewonnene Antikörper enthält,
- 7. Mittel nach den Ansprüchen 4 "bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß 8λ Antikörper enthält, die in der Prohe Ms zu 2500 U/l der Untereinheit M in den Creatinkinasen~i#i und -HB vollständig zu heimaen vermögen.
- 8. Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 4 his 7 zur Bestimmung der Aktivität von Creatlnkiriape-MB nehen Creatinkinase-MM.
- 9. Verwendung des Mittels nach Anspruch 8 als Hilfsmittel zur Diagnose des MyokardInfarkts.10, Verwendung des Mittels nach den Ansprüchen 8 und 9 zur SiraultanbestiMDiing der Creatinkinaae-Gesaat« aktivität und der Öreatinkinase-MB-Aktivität in einer Probe.709818/0 925
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Applications Claiming Priority (1)
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Family
ID=5960613
Family Applications (1)
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