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GEBIET DER
ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des cAMP-Gehalts
oder einer Adenylatcyclase-Aktivität in einer biologischen Probe,
welche nicht-cyclische
Adeninnucleotide enthält,
welche aus der Gruppe ausgewählt
sind, bestehend aus cAMP, das durch endogene Adenylatcyclase aus
ATP hergestellt worden ist (cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat), aus
ATP (Adenosintriphosphat), aus ADP (Adenosindiphosphat) und aus
einem Gemisch davon, ohne die Verwendung von radioaktiven Agentien
bereit. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren, umfassend:
(1) Kombinieren einer biologischen Probe mit wirksamen Mengen von
Apyrase, Adenosindesaminase und alkalischer Phosphatase ausschließlich 5'-Nucleotidase, um nicht-cyclische
Adeninnucleotide mit Ausnahme von cAMP und Glucose-6-phosphat in
der Probe enzymatisch zu entfernen; (2) enzymatische Umwandlung
von cAMP zu AMP; (3) Bestimmen der Menge von AMP ohne die Verwendung
radioaktiver Agentien.
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Adenylatcyclase
(Adenylylcyclase, Adenylatcyclase, EC 4.6.1.1) ist ein Enzym, das
die Umwandlung
ATP → cAMP
in
der Anwesenheit von Mg2+ oder Mn2+ katalysiert.
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Adenylatcyclase
liegt lokal auf Zellmembranen vor und spielt eine wichtige Rolle
als eine Signalübertragungskaskade
einer Reihe von grundlegenden Hormonen und Neurotransmittern.
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Zum
Beispiel ist die Messung der Adenylatcyclase-Aktivität dazu verwendet
worden, die veränderte Physiologie
zu untersuchen, die bei transplantierten Herzen und bei dekompensierter
Herzinsuffizienz zu beobachten ist. Siehe M. R. Bristow et al.,
New Engl. J. Med. 307, 205 (1982); K. G. Lurie et al., J. Thorac.
Cardiovasc. Surg. 86, 195 (1983).
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Die
Adenylatcyclase-Aktivität
kann gemessen werden, indem man die Veränderungen im Gehalt von cAMP
verfolgt, das durch die katalytische Wirkung der Adenylatcyclase
aus ATP synthetisiert wird.
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Eine
eindeutigere Aufklärung
der biologischen Rolle der Adenylatcyclase ist durch die Schwierigkeit beschränkt gewesen,
die Veränderungen
im Gewebespiegel von cAMP genau zu verfolgen.
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Man
fand heraus, dass cAMP (cyclisches Adenosin-3',5'-monophosphat)
ein Faktor ist, der die Blutzucker erhöhende Aktivität von Adrenalin
und Glucagon in Leberzellen vermittelt [E. W. Sutherland et al.,
J. Am. Chem. Soc. 79, 3608 (1957)]. Und man fand auch heraus, dass
cAMP die Wirkung von Hormonen wie z.B. Adrenocorticotropin (ACTH),
luteinisierendem Hormon (LH), Tyrosin-stimulierendem Hormon (TSH)
und Parathormon (PTH) oder von physiologisch aktiven Substanzen
wie z.B. Prostaglandin vermittelt. Wenn Peptidhormone oder aktive
Amine sekretiert worden sind und die Zielzellen erreicht haben, überträgt cAMP
deren Information, um Enzymreaktionen ablaufen zu lassen, d.h. es
spielt eine Rolle als sekundärer
Botenstoff.
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cAMP
wird von der Adenylatcyclase, die sich im lebenden Körper auf
Membranen befindet, aus ATP synthetisiert und durch Phosphodiesterase
zu 5'-AMP abgebaut.
cAMP ist in Bakterien oder Tieren weit verbreitet, aber die Konzentration
von cAMP ist extrem niedrig (eine stationäre Konzentration liegt bei
0,1–1 nMol/g
Feuchtgewicht). Als Test für
cAMP wird zweckmäßigerweise
ein Test, welcher cAMP-Bindungsprotein verwendet, oder ein Radioimmuntest
eingesetzt. Der cAMP-Gehalt
hängt von
der Eutrophie, von der Proliferation, von der Differenzierung, von
der Anpassung der Zellen und von Änderungen in der Sensitivität ab.
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Die
Messung von cAMP in vielen verschiedenen Geweben und Flüssigkeiten
von Säugern
und Nicht-Säugern
stellt eine nützliche
Methode bereit, um die Lebensfähigkeit
von Zellen, die Achsenfunktion endokriner Hormone, die Adenylatcyclase-Aktivität und die
Phosphodiesterase-Aktivität
zu testen. Außerdem kann
die Messung von cAMP dazu verwendet werden, die Aktivität einer
Reihe von Signalübertragungsproteinen
abzuschätzen,
einschließlich,
aber nicht beschränkt
auf die Familie von G-Proteinen
(Guanin-Nucleotid-Bindungsprotein), die eine bedeutende Rolle bei
der Signalübertragung,
der ribosomalen Proteinsynthese, der Translokation entstehen der
Proteine und bei anderen wichtigen zellulären Funktionen spielen. Bourne
et al., Nature 348, 125 (1990).
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Des
Weiteren kann die Messung von cAMP dazu eingesetzt werden, andere
endogene und exogene Verbindungen (z.B. Stickoxid) abzuschätzen, welche
den Spiegel von cyclischen Nucleotiden in einer speziellen Zelle,
Gewebe, Organ oder Körperflüssigkeit ändern können.
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Viele
Hormone verwenden cAMP als sekundären Botenstoff, einschließlich, aber
nicht beschränkt
auf: Epinephrin, Norepinephrin, Adrenocorticotropin (ACTH), Vasopressin,
Glucagon, Thyroxin sowie Thyroid-stimulierendes und Melanocyten-stimulierendes Hormon,
die einige der hauptsächlichen
regulatorischen Hormone/Proteine in lebenden Organismen darstellen.
Die Aktivität
aller dieser Hormone und Regulatoren kann in Geweben, im Serum,
in Körperflüssigkeiten
sowie in allen Zellkulturen (Zellen und Medium) durch Verwendung des
Verfahrens für
cAMP der vorliegenden Erfindung gemessen werden. Eine Messung dieser
Hormone wird bei einer Vielzahl von Krankheitszuständen durchgeführt, bei
denen ein Hormon-Ungleichgewicht
zu einer spezifischen Pathologie führen kann.
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Sobald
ein Hormon oder ein regulatorisches Protein mit einem spezifischen
Rezeptor wechselwirkt, wird der sekundäre Botenstoff, in diesem Fall
cAMP, durch eine Kaskade biochemischer Ereignisse produziert. Die
Produktion von cAMP kann in manchen Fällen spezifisch durch Hormone
gehemmt werden, die eine Abnahme von cAMP als Teil des spezifischen
hormonellen Signalübertragungwegs
benutzen. Das Ergebnis dieser Wechselwirkung eines regulatorischen
Proteins oder Hormons mit einem Rezeptor kann sein, ist aber nicht beschränkt auf:
(1) eine Veränderung
in der Zellpermeabilität
zusätzlich
zu z.B. Veränderungen
in den Ionenkanälen,
(2) eine Veränderung
in der Rate von Enzym-katalysierten Reaktionen, die empfindlich
für die
Konzentration von cAMP sind und (3) eine Veränderung in der Rate der Proteinsynthese,
einschließlich
der Synthese und des Abbaus anderer Enzyme. Der cAMP-Gehalt kann dazu
verwendet werden, die Auswirkungen nach der Wechselwirkung eines
Hormons oder eines regulatorischen Proteins mit einem Rezeptor direkt
oder indirekt zu verfolgen.
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Genau
gesagt kann cAMP im Urin oder im Blut zur Verwendung als Marker
für die
Spiegel von Arzneistoffen wie Aminophyllin oder Theophyllin gemessen
werden, welche das adrenerge Nervensystem stimulieren, indem sie
die Aufspaltung von endogenem cAMP verhindern. Die Messung von cAMP
in Zellkulturen kann dazu verwendet werden, um spezifische Hormone,
regulatorische Proteine und Arzneistoffe zu testen, bei denen cAMP
ein wichtiges Bindeglied im Signalübertragungsprozess darstellt.
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cAMP
kann auch dazu verwendet werden, die Lebensfähigkeit und Stabilität von Zellen
zu testen, indem man die Zellen in Abwesenheit oder in Gegenwart
eines spezifischen Hormons oder regulatorischen Proteins untersucht.
Zum Beispiel kann die Messung von cAMP in Leberzellen (Hepatocyten)
durch Glucagon dazu verwendet werden, um die Lebensfähigkeit
von Leberzellen zu testen. Dies kann zum Beispiel bei der Organ-
und/oder Zelltransplantation, zum Beispiel einer Herz-, Leber-,
Lungen-, Nieren-, Bauchspeicheldrüsen-, Haut- oder Gehirnzellentransplantation
nützlich
sein.
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Die
Messung der Ansprechbarkeit von Zellen aus Biopsieproben nach einer
Aktivierung durch eine große
Vielfalt von Hormonen, regulatorischen Proteinen und Arzneistoffen,
welche die zellulären
cAMP-Spiegel entweder erhöhen
oder verringern, kann als eine Methode verwendet werden, um die
Funktion der Zelle spezifisch zu testen.
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Ein
spezielles klinisches Beispiel ist der Einsatz der cAMP-Messung
in Herzbiopsien, um die Ansprechbarkeit des Myokards zu testen.
Kardiomyopathische Herzzellen reagieren nicht mit demselben Anstieg im
cAMP-Gehalt nach einer β-adrenergen Stimulation
wie normale Herzzellen. Die Diagnose der Schwere der Herzkrankheit
und die Wirksamkeit mancher Arzneistoffe wie z.B. β-adrenerger
Blocker und Angiotension-Converting-Enzyme-Hemmern kann erstellt
werden, indem man die Ansprechbarkeit von Biopsieproben von normalen
Herzen mit denen von kardiomyopathischen Herzen vergleicht. Die
Messung der Basal- und/oder der stimulierten Spiegel der Adenylatcyclase-Aktivität oder des
cAMP in Blutzellen kann dazu verwendet werden, um die Therapie in
solchen Patienten zu steuern. Außerdem kann die Freisetzung
von cAMP entweder intrazellulär
oder in den arteriellen oder venösen
Kreislauf als ein Indikator der Reaktion eines Organs und/oder Gewebes
auf eine Vielzahl verschiedener physiologischer und nicht-physiologischer Belastungen
wie z.B. Ischämie,
Hypoxie oder Stimulierung durch Arzneistoffe oder Hormone verwendet
werden. Die Spiegel von cAMP im Gewebe oder in der Körperflüssigkeit
können
mit diesem Ansatz in fast jeder Säugerzelle oder Körperflüssigkeit
eines Säugers
gemessen werden, einschließlich
in Blutzellen und Blutplättchen.
In einigen Geweben können
cAMP-Spiegel in Reaktion auf spezifische Stimulatoren als ein Index
für Oncogenität und/oder
Invasivität
gemessen werden, etwa im Fall von Proben von potenziell tumorösen Zellen.
In anderen Fällen
kann eine Messung von cAMP dazu verwendet werden, die Wirksamkeit
von speziellen Therapien zu bestimmen, welche die Synthese oder
den Abbau von cAMP ändern
können.
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Wie
vorstehend beschrieben, spielt cAMP eine wichtige Rolle als sekundärer Botenstoff
beim Informationstransfer in Zellen und hat auch verschiedene physiologische
Funktionen. Es ist auf den Gebieten der Grundlagen- und der klinischen
Medizin wichtig, cAMP zu messen, das durch eine katalytische Aktivität der Adenylatcyclase
aus ATP synthetisiert wird, um die Aktivität der Adenylatcyclase zu bestimmen
oder um das Verhalten von cAMP aufzuklären.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Die
Messung der Adenylatcyclase-Aktivität wird durch eine quantitative
Bestimmung von cAMP erreicht, welches aus ATP als Substrat erzeugt
wird. Die Verfahren zur Messung von cAMP werden in zwei Verfahren
eingruppiert, die als Substrat (1) markiertes ATP und (2) nicht
markiertes ATP verwenden.
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Bei
dem Verfahren, welches markiertes ATP als Substrat einsetzt (1),
wobei man als ein Substrat ATP einsetzt, welches durch ein radioaktives
Element markiert worden ist, zum Beispiel [α-32P]-ATP,
wird das aus dem radioaktiv markierten ATP erzeugte cAMP ([32P]-cAMP) abgetrennt und bestimmt. (Siehe
Y. Salomon et al., Anal. Biochem. 58, 541 (1974); R. A. Johnson
et al., in Methods in Enzymology 195, 3 (1991)). Das Verfahren verwendet
sequenzielle Affinitäts-Chromatographie
mit einem Ionenaustauschharz und Aluminiumoxidsäulen zur Trennung von [32P]-cAMP von [α-32P]-ATP.
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Obwohl
dieses Verfahren empfindlich ist, ist es auf gefährliche und teure, radioaktiv
markierte Verbindungen angewiesen.
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Auf
der anderen Seite teilt man die Verfahren, welche nicht markiertes
ATP verwenden, ein in (1) einen Radioimmuntest, bei dem radioaktiv
markiertes cAMP einer Antigen-Antikörper-Reaktion mit einem kompetitiven
Antiserum unterzogen wird, welches cAMP beinhaltet, das aus nicht
markiertem ATP erzeugt worden ist, und dann wird die Radioaktivität des bindenden
Antikörpers
untersucht, um den cAMP-Gehalt zu bestimmen, und (2) einen ProteinbindungsTest,
bei dem die Radioaktivität
von 3H-cAMP gemessen wird, das an eine cAMP-abhängige Proteinkinase
gebunden ist, wobei man sich die spezifische Bindung zwischen der cAMP-abhängigen Proteinkinase
und cAMP zunutze macht. Siehe A. G. Gilman et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA 67, 305 (1970).
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Das
Verfahren, welches nicht markiertes ATP als Substrat verwendet,
kann den Abbau von cAMP durch cyclische Nucleotidphosphodiesterase
nicht kompensieren und deswegen ist das Verfahren nicht geeignet
für Proben,
welche eine hohe Phosphodiesterase-Aktivität beinhalten.
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In
Anbetracht der Sicherheits- und Umweltbedenken sollte die Verwendung
von radioaktiven Materialien vermieden werden. Es besteht ein Bedarf
für einen
hochempfindlichen nicht-radioaktiven Test, um die Adenylatcyclase-Aktivität und cAMP
als einen Index der Adenylatcyclase-Aktivität zu messen.
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Es
ist jedoch wegen der extrem geringen Konzentration von cAMP in den
meisten Säugergeweben sehr
schwierig, cAMP ohne Verwendung radioaktiver Verbindungen zu bestimmen.
Außerdem
agieren nicht-cyclische Adeninnucleotide wie z.B. AMP, ADP und ATP
als störende
Substanzen bei dem cAMP-Test, da diese in einer biologischen Probe
in einer mehrere hundert- bis mehrere hunderttausendfach höheren Konzentration
vorliegen als cAMP und deren chemische Struktur ähnlich der von cAMP ist. Insbesondere
liegt ATP in einer hundertmillionenfach höheren Konzentration vor als
cAMP und daher ist es so gut wie unmöglich, cAMP genau zu messen,
ohne das endogene ATP vollständig
zu entfernen.
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Auf
der anderen Seite wird cAMP durch die Einwirkung von Phosphodiesterase
in AMP umgewandelt. Ein Test für
AMP ohne radioaktive Verbindungen ist offenbart worden. Lowry et
al. haben einen sensitiven Test entwicktelt, der auf der Fluoreszenz
von reduzierten Pyridinnucleotid basiert. Siehe O. H. Lowry et al.,
A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jovanovich,
New York (1972); F. M. Matschinsky et al., J. Histochem. Cytochem.
16, 29 (1968). Der Test beruht darauf, dass das Absorptionsvermögen von
reduziertem Nicotinamid-Adenindinucleotidephosphat (NADPH) bei 340
nm 0,617 pro 0,1 mMol ist und dass eine absolute Konzentration von
NADPH aus dem Absorptionsvermögen
einer Probe errechnet wird.
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Es
wird ein Test für
AMP offenbart, der auf den stimulatorischen Wirkungen von AMP auf
Glycogenphosphorylase beruht, dem Enzym, welches Glycogen in der
Gegenwart von anorganischem Phosphat (Pi)
in Glucose-1-phosphat umwandelt. Siehe E. Helmrich et al., Biochemistry
52, 647 (1964); ibidem 51, 131 (1964); M. Trus et al., Diabetes
29, 1 (1980). Nach diesem Verfahren wird die Glycogenphosphorylase-Aktivität über die
Menge an Glucose-1-phosphat bestimmt, das aus Glycogen gebildet
wird, und AMP kann bestimmt werden, indem man die Glycogenphosphorylase-Aktivität als Index
verwendet. Lurie hat ebenfalls einen empfindlichen Test für AMP entwickelt.
Siehe Lurie et al., Am. J. Physiol. 253, H662 (1987).
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Ein
Verfahren, um die analytische Sensitivität und Spezifität für cAMP oder
Adenylatcyclase zu steigern, hat sich den enzymatischen Abbau von
nicht-cyclischen Adeninnucleotiden oder deren Entfernung durch Chromatographie
zunutze gemacht. Siehe N. D. Goldberg et al., Anal. Biochem. 28,
523 (1969); B. Mcl. Breckenridge, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 52,
1580 (1964).
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Bei
der herkömmlichen
Analyse hat man die Messung von cAMP für unmöglich gehalten, weil störendes endogenes
ADP oder ATP nicht vollständig
entfernt werden konnte. Daher hat es praktisch kein Verfahren für eine hochempfindliche
Messung des cAMP-Gehalts und der Adenylatcyclase-Aktivität auf der
Grundlage der Menge an cAMP gegeben, ohne radioaktive Substanzen
zu verwenden.
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Von
einem völlig
anderen Standpunkt haben der Erfinder und andere zuvor versucht,
Tests für
die Adenylatcyclase-Aktivität
und cAMP zu entwickeln, und als ein Ergebnis einer intensiven Studie
hatten sie ein Verfahren für
eine hochempfindliche Messung des cAMP-Gehalts und der Adenylatcyclase-Aktivität gefunden, welches
auf der Menge an cAMP beruht, wobei nur enzymatische und chemische
Reaktionen eingesetzt werden, wobei das Verfahren die selektive
Entfernung störender
Substanzen, endogener nicht-cyclischer Adeninnucleotide wie z.B.
ATP, ADP und dergleichen, wobei Enzyme eingesetzt werden, die Umwandlung
von AMP in ATP, die Umwandlung von ATP in Glucose-6-phosphat über Fructose-6-phosphat, die Umwandlung
in NADPH, die Bestimmung der Konzentration von NADPH und die Korrelation
mit der Konzentration von cAMP umfasst (WO94/17198).
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Nach
diesem Verfahren kann cAMP in einer Menge in der Größenordnung
von μg in
einer biologischen Probe auf der Ebene von pMol oder fMol genau
gemessen werden. Siehe A. Sugiyama et al., Anal. Biochem. 218, 20
(1994); A. Sugiyama et al., J. Clin. Lab. 8, 437 (1994); A. Sugiyama
et al., Anal. Biochem. 225, 368 (1995); A. Sugiyama et al., Yamanashi
Med. J. 10, 11 (1995).
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Die
Reaktionsschemata des vorstehenden herkömmlichen Verfahrens sind nachstehend
beschrieben.
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Stufe
1: Reinigungsreaktionen (Entfernung
von endogenen nicht-cyclischen Nucleotiden und von endogenem Glucose-6-phosphat)
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Stufe
2: Umwandlungsreaktion 1 (Umwandlung
von cAMP zu AMP)
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Stufe
3: Umwandlungsreaktionen 2 (Umwandlung
von AMP zu ATP)
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Stufe
4: Amplifikation durch cyclische ATP-ADP-Reaktionen (Die
Sensitivität
des Tests wird 6000–10.000-fach
verstärkt)
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Stufe
5: Nachweisreaktionen (Immunphotometrischer
Test auf NADPH)
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Das
vorstehend dargestellte Verfahren war vom methodischen Prinzip her
hervorragend als eine Methode für
die quantitative Analyse und von der Theorie her korrekt. Das Verfahren
benötigt
jedoch eine lange Zeit für
eine Reinigungsreaktion oder ein Reaktionsgemisch wird trüb, wenn
ein Enzym nach einer cyclischen Reaktion durch Erhitzen inaktiviert
wurde.
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OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung wurde als Ergebnis einer intensiven Studie
zur Entwicklung eines einfachen und schnellen Verfahrens zur Bestimmung
von cAMP und Adenylatcyclase ohne radioaktive Substanzen erreicht.
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Die
vorliegende Erfindung hat die Verfahren zur Bestimmung der Adenylatcyclase-Aktivität und der quantitativen
Messung von cAMP mit Hilfe von enzymatischen Reaktionen und Fluoreszenzintensität verbessert,
welche der Erfinder und andere vorher entwickelt haben (WO 94/17198).
Das bedeutet, (1) bei den Reinigungsreaktionen kann die Reaktionsdauer
von 1 Stunde extrem auf 5 bis 10 Minuten verkürzt werden, indem die 5'-Nucleotidase von
den zu verwendenden Enzymen entfernt wird; (2) bei den cyclischen
Reaktionen werden die verwendeten Enzyme anstatt durch Erhitzen
durch Entfernung von Mg2+ mit einem Chelatbildner
wie z.B. EDTA inaktiviert. Das Reaktionsgemisch wird nicht trüb und die
Genauigkeit der Nachweisreaktion im nächsten Schritt wird verbessert;
(3) die Umwandlungsreaktion wird von den herkömmlichen Umwandlungsreaktionen
in 2 Schritten zu einer Einschrittreaktion geändert. Die Durchführung kann
einfacher sein; und (4) die Konzentrationen der in den Nachweisreaktionen
eingesetzten Reaktanden wurden überprüft, um sie
in dem vorliegenden Verfahren zu optimieren. Durch diese Verbesserungen
konnte ein enzymatischer fluorimetrischer Test oder ein spektrophotometrischer
Test bereitgestellt werden, in dem cAMP und die dem cAMP entsprechende
Adenylatcyclase schnell und mit hoher Sensitivität bestimmt werden.
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Zufälligerweise
kann das vorliegende Verfahren, wie nachstehend beschrieben, für die Messung
von Guanin-regulierenden Proteinen und cAMP-spezifischer Phosphodiesterase verwendet
werden.
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Die
in dem vorliegenden Verfahren verwendeten Reaktionen zur Bestimmung
von cAMP sind nachstehend dargestellt.
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Schritt
1 – Reinigungsreaktionen (Entfernung
von endogenen nicht-cyclischen Nucleotiden und von endogenem Glucose-6-phosphat)
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Schritt
1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 1 (Entfernung
von Fructose-6-phosphat)
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Schritt
1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 2 (Entfernung
von endogenem Glycogen in einer physiologischen Probe)
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Schritt
2 – Umwandlungsreaktion (Umwandlung
zu AMP)
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Schritt
3 – Nachweisreaktionen
1 (Fluorimetrischer
Test für
NADPH)
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Schritt
3 – Optionale
Nachweisreaktionen (Abbau
von 6-Phosphogluconolacton)
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Schritt
3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 1
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Schritt
3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2 (Fluorimetrischer
Test für
NADPH)
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Schritt
3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2 (Amplifikation
durch cyclische ATP-ADP-Reaktion) (Die
Sensitivität
des Tests wird 6000–10.000-fach
verstärkt)
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Schritt
3 – Nachweisreaktionen
3 (Nachweis
von ATP) (Luciferase-Reaktion)
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Die
in den vorstehenden Schemata veranschaulichten Reaktionen sind nachstehend
weiter dargelegt.
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Schritt 1 – Reinigungsreaktionen
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(Entfernung von endogenen
nicht-cyclischen Adeninnucleotiden und von Glucose-6-phosphat)
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Das
vorliegende Messverfahren umfasst Schritte, in denen endogene Verbindungen,
die nicht-cyclische Adeningruppen mit Ausnahme von cAMP aufweisen
(Adenosin, ATP, ADP und AMP), enzymatisch durch ein Gemisch aus
Apyrase, Adenosindesaminase und alkalischer Phosphatase, ausschließlich 5'-Nucleotidase, entfernt
werden. Bevorzugt umfasst das vorliegende Verfahren einen Schritt,
in welchem Glucose-6-phosphat in einer Probe durch die Verwendung
von alkalischer Phosphatase enzymatisch in Glucose umgewandelt wird (Reinigungsreaktionen).
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Die
Reinigungsreaktionen der vorliegenden Erfindung können das
gesamte endogene ATP, ADP und AMP entfernen, welche in viel höheren Konzentrationen
als cAMP vorliegen und das Hintergrundsignal erheblich erhöhen. Da
Glucose-6-phosphat
in den anschließenden
Nachweisreaktionen entsteht, ist es vorteilhaft, Glucose-6-phosphat
vorher aus einer Probe enzymatisch zu entfernen, um die Genauigkeit
der Messung zu verbessern. Die Reinigungsreaktionen sind wichtig,
um die Sensitivität
zu erhöhen.
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Hinzu
kommt, dass die Dauer der Reinigungsreaktionen extrem verkürzt und
vereinfacht worden ist, indem 5'-Nucleotidase
von vier Arten von Enzymen entfernt worden ist, die in einem herkömmlichen
Reinigungsreaktionsschritt eingesetzt worden sind, d.h. von Apyrase,
5'-Nucleotidase,
alkalischer Phosphatase und Adenosindeaminase. Das bedeutet, man
hat herausgefunden, dass die Dauer der herkömmlichen Reinigungsreaktion
von etwa 1 Stunde auf nur 5 bis 10 Minuten verkürzt werden kann.
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Schritt 1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 1
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(Entfernung von Fructose-6-phosphat)
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Es
ist vorteilhaft, durch Hydrolyse mit alkalischer Phosphatase aus
einer Probe Fructose-6-phosphat zuvor zu entfernen, das während den
cyclischen Reaktionen und Nachweisreaktionen entsteht.
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Schritt 1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 2
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(Entfernung von endogenem
Glycogen in einer Probe)
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Es
ist vorteilhafter, aus einer Probe endogenes Glycogen zu entfernen,
welches zu Glucose-6-phosphat umgewandelt wird, indem Glucoseoxidase,
Glycogenphosphorylase und alkalische Phosphatase verwendet werden
(optionale Reaktionen). Gemäß diesen
Optionalen Reinigungsreaktionen wird endogenes Glycogen abgebaut,
welches in den Nachweisreaktionen, in denen eine bekannte Menge
Glycogen zugegeben wird, eine störende
Substanz darstellt.
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Schritt 2 – Umwandlungsreaktion
(Umwandlung zu AMP)
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Nach
den Reinigungsreaktionen wird anschließend Phosphodiesterase mit dem
Reaktionsgemisch kombiniert, so dass cAMP zu AMP umgewandelt wird
(Umwandlungsreaktion).
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Schritt 3 – Nachweisreaktionen
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(Fluorimetrischer Test
für NADPH)
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Nach
den Umwandlungsreaktionen werden Glycogen und anorganische Phosphorsäure zu dem
Reaktionsgemisch hinzugegeben und eine Menge von AMP wird bestimmt,
indem man den Spiegel von Glucose-6-phosphat, das schlussendlich
aus Glycogen durch die durch AMP aktivierte Glycogenphosphorylase
erzeugt wird, damit korreliert. Glucose-1-phosphat wird durch Phosphoglucomutase
zu Glucose-6-phosphat
umgewandelt und schlussendlich wird Glucose-6-phosphat enzymatisch
zu 6-Phosphogluconolacton, NADPH und H+ umgewandelt.
Die Konzentration von NADPH wird durch einen fluorimetrischen Test
gemessen, zum Beispiel nach der Methode von Trus et al. [M. Trus
et al., Diabetes 29, 1 (1980)].
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Schritt 3 – Optionale
Nachweisreaktionen
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(Abbau von 6-Phosphogluconolacton)
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Und
auch 6-Phosphogluconolacton kann durch Erhitzen in einer wässrigen
Lösung
in vitro in 6-Phosphogluconat umgewandelt werden, und dann kann
6-Phosphogluconat
in der Gegenwart von NADP+ in vitro in NADPH
und Ribulose-5-phosphat
umgewandelt werden. Die Konzentration von NADPH kann durch die Optionale
Reaktion erhöht
werden und in einem fluorimetrischen Test gemessen werden, zum Beispiel
nach der Methode von Trus et al., wie vorstehend beschrieben [M.
Trus et al., Diabetes 29, 1 (1980)].
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Wo
stimulierte Adenylatcyclase-Aktivität in derselben Präparation
von Kaninchenherzen sowohl mit dem modifizierten radioaktiven Salomon-Verfahren
als auch mit dem vorliegenden fluorimetrischen Verfahren ohne alkalische
Phosphatase gemessen wurde, waren die Ergebnisse ähnlich.
Weign et al., Anal. Biochem. 208, 217 (1993). Ergebnisse mit dem
radioaktiven Test sind vergleichbar mit dem vorliegenden fluorimetrischen
Verfahren. Obwohl die absoluten spezifischen Aktivitäten unterschiedlich
sind, wenn die Ergebnisse des radioaktiven Tests und des fluorimetrischen
Tests verglichen werden, ist das Ausmaß der mit jeder der beiden Verfahren
bestimmten Stimulierung der Adenylatcyclase ähnlich. Die Unterschiede in den
spezifischen Aktivitäten
beruhen aller Wahrscheinlichkeit nach auf geringfügigen Faktoren
in den Adenylatcyclase-Reaktionsgemischen. Das heißt, unmarkiertes
cAMP wird in dem radioaktiven Test eingesetzt, um den Abbau von [α-32P]-cAMP durch endogene Phosphodiesterasen
zu verhindern, während
in dem fluorimetrischen Test Theophyllin verwendet wird, um endogenen
Phosphodiesterase-vermittelten
Abbau von neu synthetisiertem cAMP zu hemmen.
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Darüber hinaus
hat die Messung der Adenylatcyclase mit Hilfe der cyclischen ATP-ADP-Reaktionen, wie
in Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2 gezeigt, deutlich gemacht, dass die absoluten
spezifischen Aktivitäten
sowohl für
den radioaktiven als auch den fluorimetrischen Test gleich waren.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung wird vorteilhafterweise mit
einem zuvor hergestellten Kit durchgeführt, und ein solcher Kit umfasst
Fläschchen,
welche Enzyme, Pufferlösungen
und dergleichen enthalten, die in jedem Reaktionsschritt zu verwenden
sind.
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Speziell
wird ein Kit der vorliegenden Erfindung zur Durchführung eines
Verfahrens zur schnellen Bestimmung des cAMP-Gehalts oder der Adenylatcyclase-Aktivität beispielhaft
durch einen Kit dargestellt, welcher umfasst (1) ein Fläschchen
für die
Reinigungsreaktionen, umfassend wirksame Mengen von Apyrase, alkalischer
Phosphatase und Adenosindeaminase ausschließlich 5'-Nucleotidase zur Entfernung von endogenen
nicht-cyclischen Adeninnucleotiden, bestehend aus ATP, ADP und AMP,
und von endogenem Glucose-6-phosphat in einer biologischen Probe;
(2) ein Fläschchen
für die
Umwandlungsreaktion, umfassend eine wirksame Menge von Phosphodiesterase
zur enzymatischen Umwandlung von cAMP in der biologischen Probe
zu AMP; und (3) Fläschchen
für eine
Nachweisreaktion, umfassend wirksame Mengen von (a) Glycogen, anorganischem
Phosphat und Glycogenphosphorylase zur Umwandlung von Glycogen zu
Glucose-1-phosphat, (b) Phosphoglucomutase zur Umwandlung von Glucose-1-phosphat
zu Glucose-6-phosphat, und (c) Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und NADP (β-Nicotinamidadenindinucleotidphosphat)+ zur Umwandlung von Glucose-6-phosphat zu
6-Phosphogluconolacton und NADPH.
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Ebenso
kann ein anderer Kit der vorliegenden Erfindung zur Durchführung eines
Verfahrens zur schnellen Bestimmung des cAMP-Gehalts oder der Adenylatcyclase-Aktivität ein Kit
sein, welcher umfasst (1) ein Fläschchen
für die
Reinigungsreaktionen, umfassend wirksame Mengen von Apyrase, Adenosindeaminase
und alkalischer Phosphatase ausschließlich 5'-Nucleotidase zur enzymatischen Entfernung
endogener nicht-cyclischer Adeninnucleotide, bestehend aus ATP,
ADP und AMP, und von endogenem Glucose-6-phosphat in einer biologischen
Probe; (2) ein Fläschchen
für die
Umwandlungsreaktion, umfassend wirksame Mengen von Phosphodiesterase,
ATP, Myokinase, Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase zur enzymatischen Umwandlung
von cAMP in der biologischen Probe zu AMP; und (3) Fläschchen
für die
Nachweisreaktion, umfassend wirksame Mengen von (a) Fructose und
Hexokinase zur Umwandlung von ATP zu Fructose-6-phosphat und (b)
Phosphoglucoseisomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und NADP+ zur Umwandlung von Fructose-6-phosphat
zu 6-Phosphogluconolacton und NADPH.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung ist empfindlich genug, um cAMP
in kleinen biologischen Proben zu messen, die weniger als 0,1 mg
wiegen, und kann angepasst werden, um 0,1 fMol cAMP/Probe zu messen.
Gemäß der vorliegenden
Erfindung wird eine bekannte Menge ATP zu einer biologischen Probe
hinzugefügt,
und dann wird das ATP durch die Aktivität der Adenylatcyclase in der
Probe zu cAMP umgewandelt. Die Adenylatcyclase-Aktivität kann bereitgestellt
werden, indem man das umgewandelte AMP nach der Entfernung aller
Adeninnucleotide wie z.B. endogenem ATP durch die Reinigungsreaktionen
bestimmt.
-
Das
in der Reinigungsreaktion aus Adenosin erzeugte Ammoniumion treibt
die Reinigungsreaktionsreihe im Wesentlichen zur Vollendung, indem
es die Neubildung von Nucleotiden in der Probe verhindert. Diese
Schritte sorgen für
eine erhebliche, unerwartete Verbesserung gegenüber fluorimetrischen Tests.
Weign et al., Anal. Biochem. 208, 217 (1993).
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KURZE BESCHREIBUNG DER
FIGUREN
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1 ist
ein Liniengraph, welches die Fluoreszenz gegen die Konzentration
von ATP bei verschiedener Inkubationsdauer zeigt.
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2 ist
eine graphische Darstellung der Absorption gegen die Konzentration
von cAMP-Standardproben, wie durch eine Ausführungsform der Erfindung bestimmt.
-
3 ist
ein Histogramm, welches die Mengen von cAMP zeigt, die in unbehandelten
und in stimulierten Zellen, wie durch das vorliegende fluorimetrische Verfahren
(ausgefüllt)
und durch einen im Handel erhältlichen
immuncolorimetrischen Test (schraffiert) und durch einen Radioimmuntest
(leer) bestimmt, nachgewiesen worden sind.
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4 ist
ein Histogramm, welches die Adenylatcyclase-Aktivität zeigt,
die mit dem vorliegenden fluorimetrischen Verfahren (ausgefüllt) und
mit einem im Handel erhältlichen,
radioimmunometrischen Test (schraffiert) und mit dem Salomon-Verfahren (leer)
bestimmt worden ist.
-
DIE BESTE ART UND WEISE,
DIE ERFINDUNG AUSZUFÜHREN
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Das
physiologische Material, welches mit dem vorliegenden Verfahren
getestet wird, wird bevorzugt aus einer Säugerquelle erhalten, einschließlich Gewebe,
Blutzellen, Knochen und physiologische Flüssigkeiten wie z.B. Urin, Blut,
Liquor und dergleichen, und kann frisch oder gefroren sein. Lowry
et al., A Flexible System of Enzymatic Analysis, Harcourt Brace
Jovanovich, New York (1972).
-
Demnach
umfasst die vorliegende Erfindung in einer bevorzugten Ausführungsform
die Schritte:
-
Schritt 1 – Reinigungsreaktion
-
(Entfernung von endogenen
nicht-cyclischen Nucleotiden und von Glucose-6-phosphat)
-
Eine
Probe eines physiologischen Materials, umfassend cAMP, Glucose-6-phosphat und mindestens ein
nicht-cyclisches Adeninnucleotid, das heißt ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus ATP, AMP, AMP und einem Gemisch davon, wird mit einem wässrigen
Puffer kombiniert, umfassend ein Gemisch von Apyrase, Adenosindeaminase
und alkalischer Phosphatase ausschließlich 5'-Nucleotidase,
so dass diese nicht-cyclischen Adenosinnucleotide (das ATP, ADP
und/oder AMP) enzymatisch umgewandelt werden, um sie zu entfernen.
-
Der
Ausdruck „schneller" bedeutet, dass die
Dauer der Reinigungsreaktion, welche herkömmlich etwa 1 Stunde benötigt hat,
auf etwa 5 bis 10 Minuten verkürzt
worden ist, d.h. auf ein Zwölftel
oder ein Sechstel, mindestens auf ein Sechstel der Reaktionsdauer.
-
Schritt 1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 2
-
Und
wahlweise wird das Reaktionsgemisch mit einem Gemisch von Glucoseoxidase
und Glycogenphosphorylase und alkalischer Phosphatase kombiniert,
so dass das gesamte Glycogen in der Probe abgebaut wird, wohingegen
das cAMP in dem Reaktionsgemisch zurückgehalten wird. Diese Schritte
bauen das gesamte endogene Glycogen ab, welches eine störende Substanz
beim Schritt 3 – Nachweisreaktion
(Fluorometrie von NADPH) ist, in dem eine bekannte Menge Glycogen
hinzugegeben wird.
-
Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen
(Reaktion zur Umwandlung zu AMP)
-
Das
Reaktionsgemisch wird mit Phosphodiesterase kombiniert, so dass
das cAMP zu AMP umgewandelt wird.
-
Schritt 3 – Nachweisreaktionen
-
(Fluorimetrischer Test
für NADPH)
-
Weiter
wird das AMP in Gegenwart von Glycogen und anorganischem Phosphat
mit Glycogenphosphorylase in Kontakt gebracht, so dass in dem Reaktionsgemisch
Glucose-1-phosphat erzeugt wird. Dann wird das Glucose-1-phosphat in diesem
Reaktionsgemisch enzymatisch zu 6-Phosphogluconolacton, NADPH und H+ umgewandelt und die Konzentration von NADPH
wird fluorimetrisch gemessen. Die Konzentration von NADPH korreliert
mit der Konzentration der Adenylatcyclase-Aktivität, dem cAMP-Gehalt
oder der Konzentration von AMP.
-
Das
Verfahren zur Bestimmung von cAMP beruht auf dem Prinzip, dass AMP,
welches durch die Spaltung der 3'-5'-Phosphodiesterbindung
von cAMP erzeugt wird, die Aktivität der Glycogenphosphorylase
stimuliert. Das heißt,
die Menge an cAMP und die Adenylatcyclase-Aktivität entspricht
der Absorption von NADPH, welches schlussendlich durch die Glycogenphosphorylase-Aktivität erhalten
wird, die durch das aus dem cAMP erzeugte AMP aktiviert wird.
-
Die
Korrelation der Endkonzentration von NADPH mit der Konzentration
des AMP kann z.B. durch eine Kalibrierungskurve erhalten werden.
Siehe 2.
-
Bevorzugt
können
die bei der Reinigungsreaktion verwendeten Enzyme im Anschluss an
die Reinigungsreaktionen durch Erhitzen inaktiviert werden.
-
Weiter
wird im Anschluss an Schritt 1 – Reinigungsreaktionen
bevorzugt eine Lösung
von Phosphodiesterase, Glycogenphosphorylase, Glucose-1,6,-diphosphat,
anorganischem Phosphat, Glycogen, NADP+, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase,
Phosphoglucomutase und Mg2+ zu dem Reaktionsgemisch
hinzugefügt, und
die Schritte 2 der Umwandlungsreaktionen und der Schritt 3 der Nachweisreaktionen
1 werden sequentiell in situ durchgeführt.
-
Schritt 3 – Optionale
Nachweisreaktionen 1
-
(Abbau von Phosphogluconolacton)
-
Die
Konzentration von NADPH, welches im Schritt 3 erzeugt wird, kann
dadurch erhöht
werden, indem nacheinander das 6-Phosphogluconolacton durch Erhitzen
des Reaktionsgemisches von Schritt 3 – Nachweisreaktionen 1 zu 6-Phosphogluconat umgewandelt
wird und indem man das 6-Phosphogluconat mit hinzugegebenen NADP+ und 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase in
der Gegenwart von Mg2+ reagieren lässt, um
Ribulose-5-phosphat, NADPH, H+ und CO2 zu ergeben.
-
Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktion 1
-
Die
tatsächliche
Konzentration des NADPH, das im Schritt 3 – Nachweisreaktionen 1 erzeugt
wird, kann um Größenordnungen
erhöht
werden, indem man es in einem cyclischen Reaktionssystem einsetzt.
Ein solches Reaktionssystem wandelt zu α-Ketoglutarat hinzugefügtes NADPH
zu NADP+ und Glutamat um. Das NADPH+ wiederum wandelt hinzugefügtes Glucose-6-phosphat
zu 6-Phosphogluconolacton und NADPH um. Wie vorstehend beschrieben,
kann das 6-Phosphogluconolacton hydrolysiert (H2O,
Wärme)
und in Gegenwart von 6-Phosphogluconat-Dehydrogenase zu Ribulose-5-phosphat
und NADPH umgewandelt werden. Lowry et al., A Flexible System of
Enzymatic Analysis, Harcourt Brace Jacovanovich, New York (1972).
-
Schritt 2 – Optionale
Umwandlungsreaktionen 1 (Umwandlungsreaktion zu ATP)
-
Alternativ
kann das AMP, welches in Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen aus
cAMP hergestellt wird, zu ADP umgewandelt werden, indem man es mit
Spuren von ATP in der Gegenwart von Myokinase kombiniert. Das ADP,
welches hergestellt wird, wird dann zu ATP und Pyruvat umgewandelt,
indem man das ADP mit 2- Phospho(enol)pyruvatkinase
kombiniert. Ein Molekül
AMP erzeugt in diesem Schritt ein Molekül ATP (Umwandlungsreaktion
zu ATP).
-
Schritt
2 – Umwandlungsreaktionen
und Schritt 2 – Optionale
Umwandlungsreaktionen 1, in denen cAMP zu AMP umgewandelt wird und
AMP über
ADP zu ATP umgewandelt wird, können
sequenziell in einem Schritt durchgeführt werden.
-
Schritt 3 – Nachweisreaktionen
2
-
(Fluorimetrischer Test
für NADPH)
-
Weiter
wird ATP zu Fructose-6-phosphat und ADP umgewandelt, indem man es
in Gegenwart von Fructose mit Hexokinase kombiniert. Fructose-6-phosphat
wird in Gegenwart von Phosphoglucoisomerase zu Glucose-6-phosphat
umgewandelt, das enzymatisch zu 6-Phosphogluconolacton, NADPH und
H+ umgewandelt wird. Die Konzentration von
NADPH wird mit der Methode von Trus et al., wie vorstehend beschrieben, gemessen.
M. Trus et al., Diabetes 29, 1 (1980).
-
Schritt 3 – Optionale
Nachweisreaktionen 1
-
Alternativ
kann das 6-Phosphogluconolacton, wie vorstehend beschrieben, hydrolysiert
und weiter zu 6-Phosphogluconat umgewandelt werden, welches zu NADPH,
H+, CO2 und Ribulose-5-phosphat
umgewandelt werden kann.
-
Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2 (Amplifikation der cyclischen ATP-ADP-Reaktion)
-
Weiter
wird ATP einer cyclischen ATP-ADP-Reaktion unterzogen. Das heißt, ATP
wird zu Fructose-6-phosphat und ADP umgewandelt, indem man es in
Gegenwart von Fructose mit Hexokinase kombiniert. Dann wird das
ADP zu ATP und Pyruvat umgewandelt, indem man es mit Phosphoenolpyruvat
in Gegenwart von Pyruvatkinase kombiniert. Das auf diese Weise erzeugte
ATP wird dann wieder zu Fructose-6-phosphat und ADP umgewandelt.
Durch die Wiederholung dieser Reaktionen kann Fructose-6-phosphat
schließlich
angereichert werden.
-
Ein
Chelatbildner wird hinzugefügt,
um die Enzyme am Ende der cyclischen Reaktionen zu inaktivieren.
Als Beispiel für
Chelatbildner können
Polyaminocarboxylsäure
wie z.B. EDTA, Oxycarboxylsäure
wie z.B. Zitronensäure, bevorzugt
EDTA, angeführt
werden.
-
Das
so erhaltene Fructose-6-phosphat, das aus der im Überschuss
vorliegenden Fructose und aus Phospho(enol)pyruvat, die in den cyclischen
Reaktionen eingesetzt wird, erzeugt wird, wird mit Hilfe von Phosphoglucoseisomerase
zu Glucose-6-phosphat umgewandelt, und das Glucose-6-phosphat wird
zu 6-Phosphogluconolacton
und NADPH umgewandelt, indem man es der Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
und NADP+ aussetzt. Die NADPH-Konzentration
kann dann nach der Methode von Trus et al. bestimmt werden. M. Trus
et al., Diabetes 29, 1 (1980). Siehe Schritt 3 – Nachweisreaktionen 2, wie
vorstehend beschrieben.
-
Schritt 3 – Nachweisreaktionen
3
-
Gemäß der vorliegenden
Erfindung ist es möglich,
das ATP, welches, wie in Schritt 2 – Optionale Umwandlungsreaktionen
1 gezeigt erzeugt wird, durch Messung der Absorption mit einem Chemilumineszenztest nachzuweisen,
der die Luciferase-Reaktion und Glühwürmchen-Luciferase verwendet.
Wulff et al., Methods of Enzymatic Analysis, Bergmeyer H. U. (Hrsg.),
VCH (1985). Aus der Bestimmung des ATP ist es möglich, die AMP-Konzentration
und cAMP-Konzentration und sowie die diesen entsprechende Adenylatcyclase-Aktivität zu berechnen.
-
Obwohl
die Geschwindigkeit dieser Reaktion sehr langsam ist, ist die Ausbeute
der Reaktion (definiert als das Verhältnis der Zahl der ausgesendeten
Photonen und der Zahl der umgewandelten ATP-Moleküle) fast 100%.
Die Intensität
des ausgesendeten Lichts ist direkt proportional zu der ATP-Konzentration
und wird bei 582 nm gemessen.
-
Sofern
das Prinzip des Reaktionssystems identisch ist, kann das vorliegende
Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Bestimmung einer beliebigen
anderen Substanz als AMP angepasst werden, zum Beispiel der Guanylatcyclase-Aktivität, von cyclischem
Guanosin-3',5'-monophosphat (cGMP)
und Guanosin-3',5'-monophosphat (GMP), indem man ein geeignetes
Enzym einsetzt, welches sich auf GMP bezieht.
-
Die
Reaktionsschemata sind nachstehend gezeigt.
-
Schritt
(i) – Reinigungsreaktionen
-
Schritt
(ii) – Umwandlungsreaktionen
-
Schritt
(iii) – Cyclische
Reaktionen
-
Schritt
(iv) – Nachweisreaktionen
-
Schritt (i) – Reinigungsreaktion
-
Wie
vorstehend beschrieben, wird ein Reinigungsgemisch aus alkalischer
Phosphatase, Nucleosidphosphorylase und Guanase in den Reinigungsreaktionen
verwendet. Alkalische Phosphatase kann dazu verwendet werden, Verbindungen
wie z.B. Glucose-6-phosphat und nicht-cyclische Nucleotide zu dephosphorylieren,
welche die Leerwerte bei der Messung von cGMP erhöhen können (Reinigungsreaktionen).
-
In
den Reinigungsreaktionen wird das GTP in einer Probe zu GMP plus
2 Pi umgewandelt, gefolgt von der Umwandlung
zu Guanosin und Pi. Guanosin wird zu Guanin
und Ribose-1-phosphat umgewandelt und Guanin wird zu Xanthin und
Ammoniak umgewandelt. Ebenso wie in der Reinigungsreaktion zur Bestimmung
von cAMP treibt die Bildung von Ammonium (oder NH4 +) in den endgültigen Reinigungsreaktionen
die Serie von verbundenen Reaktionen im Wesentlichen zur Vollendung,
gewährleistet
die Entfernung von störenden
Nucleotiden.
-
Bevorzugt
werden die in den Reinigungsreaktionen eingesetzten Enzyme vor dem
nächsten
Schritt (ii) – Umwandlungsreaktion
z.B. durch Erhitzen inaktiviert.
-
Schritt (ii) – Umwandlungsreaktion
-
Das
in der Probe vorliegende cGMP wird dann mit Phosphodiesterase zu
GMP umgewandelt. Das GMP wird in Gegenwart von Gunaninmonophosphatkinase
mit ATP kombiniert, um Guanosin-5'-diphosphat (GDP) und ADP zu ergeben.
-
Schritt (iii) – Cyclische
Reaktionen
-
Das
GDP wird in Gegenwart von im Überschuss
vorliegendem PEP, Succinyl-CoA
und anorganischem Phosphat (Pi) eingesetzt,
um eine Menge von Pyruvat zu ergeben (Cyclische Reaktionen).
-
Schritt (iv) – Nachweisreaktionen
-
Dieses
Pyruvat wird indirekt quantifiziert, indem eine bekannte Menge NADH
hinzugefügt
wird, die in Gegenwart von Säure
zu Lactat und NAD+ umgewandelt wird. Auf
diese Weise wird die Fluoreszenz der Indikator-Proben in direktem
Verhältnis
zur Menge an Pyruvat erniedrigt, die in der auf cGMP, GMP oder Guanylatcyclase
zu testenden Probe erzeugt wird. Um die Sensititvität des Tests
zu erhöhen,
kann das gebildete NAD+ nach dem Abbau von überschüssigem NADH
mit Säure
auch mit Alkali zu 2-Hydroxy-nicotinaldehyd umgewandelt werden,
was eine höhere
Fluoreszenzintensität
aufweist. K. Scya et al., Anal. Biochem. 272, 243 (1999).
-
Nach
der vorliegenden Erfindung besteht eine alternative Methode zur
Messung von GMP darin, die Menge an ATP zu messen, welches durch
Guaninmonophosphatkinase in Schritt (ii) – Umwandlungsreaktion abgebaut
wird. Die Menge an ATP kann, wie vorstehend beschrieben, mit Hilfe
eines bekannten Verfahrens bestimmt werden.
-
Zusätzlich zur
Verbesserung der Sensitivität
des Tests ist die Messung der Adenylatcyclase-Aktivität oder der
Guanylatcyclase-Aktivität
mit den vorliegenden enzymatischen Test s erheblich kostengünstiger, nimmt
weniger Zeit in Anspruch und ist darüber hinaus sicherer für den Anwender
und besser für
die Umwelt, da keine radioaktiven Substanzen verwendet werden.
-
Schließlich kann
der vorliegende Test ohne weiteres angepasst werden, um die Menge
an endogener oder exogener Phosphodiesterase in einer biologischen
Probe zu bestimmen. Das heißt,
eine einzige, vorher ausgewählte
Menge an cAMP wird zu einer Probe hinzugefügt, welche eine unbekannte
Konzentration an Phosphodiesterase enthält. Gegebenenfalls können beliebige
Hemmstoffe hinzugefügt
werden, die spezifisch für
Phosphodiesterasen sind. Eine Standardkurve wird erstellt, indem
eine einzige, vorher ausgewählte überschüssige Menge
von cAMP zu verschiedenen, vorher ausgewählten bekannten Mengen von
Phosphodiesterase hinzugefügt
wird. Nach einer begrenzten Reaktionsdauer (5–60 Minuten), in der ein Teil,
aber nicht die komplette Menge des hinzugefügten cAMP durch die Phosphodiesterase
zu AMP umgewandelt wird, wird die Reaktion gestoppt. Eine cAMP-Standardkurve
kann gleichzeitig aufgenommen werden, um zu überprüfen, dass alle Reaktionen angemessen
funktionieren. Eine Reinigungsreaktion wird vorgeschaltet, um alle
nicht-cyclischen Adeninnucleotide abzubauen. Das übrig bleibende
cAMP wird invers proportional zu der natürlich vorliegenden plus der
hinzugefügten
Menge Phosphodiesterase sein. Zur Messung wird cAMP dann mit einer
herkömmlichen
Methode zu AMP umgewandelt.
-
Spezifisch
wird eine Gewebeprobe in einem SET-Puffer (0,5 M Saccharose, 0,03
M Tris, 2 mM EDTA) aufgelöst,
und zu dem erhaltenen Gemisch wird das doppelte Volumen an PDE-Gemisch
(50 mM Tris, 50 μM cAMP)
hinzugefügt
und für
20 Minuten bei 37°C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird für 30 Minuten auf 80°C erhitzt.
Das Reinigungsreaktionsgemisch wird in einem Volumen, das dem Vierfachen
der Gewebeprobe entspricht, zum Reaktionsgemisch hinzugegeben und
für 1 Stunde
bei 37°C
inkubiert. Das Reaktionsgemisch wird für 30 Minuten auf 80°C erhitzt.
Das Umwandlungsreaktionsgemisch wird in einem Volumen, das dem Zehnfachen
der Gewebeprobe entspricht, dem Reaktionsgemisch hinzugegeben und
für 1 Stunde
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fluoreszenzintensität des so
erhaltenen NADPH wird mit Hilfe der Nachweisreaktionen gemessen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt eine Zubereitung bereit, umfassend
Enzyme oder Puffer, die in Form eines Kits zu verwenden sind. Die
Reaktionsmaterialien jedes Schritts können einfach in einem Kit zubereitet werden,
wie z.B. einem Reinigungsreaktionsgemisch-Kit, einem Umwandlungsreaktionsgemisch-Kit,
einem Cyclisierungsreaktionsgemisch-Kit, einem Nachweisreaktionsgemisch-Kit.
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Die
in der vorliegenden Erfindung verwendeten Enzyme werden zum Beispiel
in Form von wässrigen Lösungen,
lyophilisierten oder festen Formulierungen in einem Behälter wie
z.B. einem Fläschchen,
einer aus einem geeigneten Glas oder Plastik hergestellten Ampulle
bereitgestellt.
-
Die
Enzyme können
in Puffern, Elektrolyten, destilliertem Wasser gelöst werden
oder sie können
getrennt in verschiedene Behälter
gegeben und direkt vor dem Gebrauch mit diesen gemischt werden.
-
Zusatzstoffe
wie z.B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, Färbemittel, Excipienten, pH-Regulatoren und
dergleichen können
passend dazugegeben werden.
-
Zusätzlich zu
der Amplifikationsreaktion der vorliegenden Erfindung kann der Test,
wie in der vorliegenden Erfindung beschrieben, geeignete automatische
Untersuchungsgeräte
nutzen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt einen neuen, nicht-radioaktiven, enzyma tischen,
fluorimetrischen Test für
Adenylatcyclase-Aktivität
und cAMP wie auch für
cAMP spezifische Phosphodiesterase-Aktivität und die biologische Aktivität regulatorischer
G-Proteine bereit. Und sie stellt auch einen nicht-radioaktiven,
enzymatischen, fluorimetrischen Test für Guanylatcyclase-Aktivität und cGMP
bereit.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung bietet mehrere Vorteile gegenüber derzeit
verfügbaren
Methoden im Vergleich zu herkömmlichen
Verfahren zur Messung der Adenylatcyclase-Aktivität und dergleichen. Im
Gegensatz zu den früher
von Y. Salomon et al., in Anal. Biochem. 58, 541 (1974) und Adv.
Cyclic Nucleotide Res. 10, 35 (1979) offenbarten Test, verwendet
der vorliegende Test keinerlei radioaktives Material. Außerdem ist
dieser Test sensitiver und einfacher durchzuführen als die früheren Tests.
-
Und
gemäß der vorliegenden
Erfindung kann auch die Reaktionsdauer in dem Prozess extrem verkürzt werden
und die Durchführung
wird einfacher im Vergleich zu einem Verfahren, welches früher von
dem Erfinder und anderen entwickelt worden ist. Siehe Sugiyama et
al., Anal. Biochem. 218, 20 (1994); A. Sugiyama et al., J. Clin.
Lab. 8, 437 (1994); A. Sugiyama et al., Anal. Biochem. 225, 368
(1995); A. Sugiyama et al., Yamanashi Med. J. 10, 11 (1995). Außerdem wird
ein Problem, dass eine Probe trüb
wird, was sich in herkömmlichen
Verfahren nicht vermeiden lässt,
dadurch gelöst,
dass ein Chelatbildner wie z.B. EDTA eingesetzt wird. Und der cAMP-Gehalt
in einer biologischen Probe in der Größenordnung von μg kann genau
auf der pMol- oder fMol-Ebene gemessen werden.
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Die
Reinigungsreaktion der vorliegenden Erfindung kann das gesamte endogene
ATP, ADP und AMP entfernen, welche in einer weit höheren Konzentration
als cAMP vorliegen und ansonsten den Leerwert erheblich erhöhen würden. Durch
die Reinigungsreaktionen können
zusätzlich
das gesamte endogene Glyucose-6-Phosphat
und Glycogen als störende
Substanzen in der Probe entfernt werden. Diese Reinigungsreaktionen
sind wichtig für
die Verbesserung der Sensitivität
des Tests.
-
Man
hat herausgefunden, dass die Reaktionsdauer von 1 Stunde herkömmlicher
Verfahren erheblich auf etwa 5–10
Minuten verkürzt
werden konnte, indem die 5'-Nucleotidase
von den vier Enzymen, d.h. Apyrase, 5'-Nucleotidase, alkalische Phosphatase
und Adenosindeaminase, welche in den herkömmlichen Reinigungsreaktionen
eingesetzt worden sind, weggelassen wurde.
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Nach
den cyclischen Reaktionen wird die Probe nicht trüb, da Mg2+ von einem Chelatbildner abgefangen wird
und der Enzymüberschuss
ohne Erhitzen inaktiviert wird.
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Die
Sensitivität
dieses Tests kann auch dadurch erhöht werden, indem die Reaktionsvolumina
verringert werden. Sie kann auch weiter dadurch erhöht werden,
indem die Konzentrationen von Glycogen und anorganischem Phosphat
im Reaktionsgemisch variiert werden, wie von Meinrich et al., und
E. Helmrich et al., Biochemistry 52, 647 (1964) berichtet. Nach
der vorliegenden Erfindung ist eine Messung der Adenylatcyclase-Aktivität in Gewebebiopsieproben
von Säugern
möglich,
die so wenig wie 10,0 μg
Membranprotein umfassen.
-
Im
Gegensatz zu radioaktiven Methoden, bei denen die Sensitivität durch
die spezifische Aktivität
des [α-32P]-cAMP und durch die Größe des Volumens
für die
chromatographische Auftrennung und dergleichen beschränkt ist,
gibt es keine wesentlichen Hürden,
die Sensitivität
des vorliegenden fluorimetrischen Verfahrens weiter zu erhöhen. cAMP
ist zum Beispiel über
einen breiten Konzentrationsbereich von 1 fMol–1 mMol gemessen worden.
-
BEISPIELE
-
Die
Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die folgenden ausführlichen
Beispiele beschrieben werden, bei denen die verwendeten Enzyme,
Substrate und Cofaktoren von Boehringer Mannheim erhalten wurden,
mit Ausnahme von Apyrase und 5'-Nucleotidase,
die von Sigma, St. Louis, MO waren. Das [α-32P]-ATP, 3H-cAMP
und der Aquasol-Szintillations-Cocktail wurden von New England Nuclear
bezogen. Neutrales chromatographisches Aluminiumoxid WN-3 wurde
von Bio-Rad erhalten.
-
Beispiel 1
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Bestimmung der Dauer der
Reinigungsreaktion
-
Ein
Volumen von 3 μl
eines ATP-Standards (0, 10, 100, 1000 und 10.000 pMol/Röhrchen)
wurde in ein 10 × 57-Pyrex®-Teströhrchen gegeben.
Bei Raumtemperatur wurden 25 μl
des Reinigungsreaktions-Gemisches (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM
MgCl2; 2 U/ml Apyrase; 10 U/ml Adenosindeaminase;
40 U/ml alkalische Phosphatase, ausschließlich 5'-Nucleotidase) zu jedem Teströhrchen hinzugefügt. Das
Gemisch wurde bei 37°C
für 0,
5, 10, 15 und 20 Minuten inkubiert. Dann wurden Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen
(Umwandlung zu AMP), Optionale Umwandlungsreaktionen (Umwandlung
zu ATP), Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2 sequenziell durchgeführt und eine Fluoreszenzintensität bei 340
nm wurde gemessen, um die Inkubationsdauer zu bestimmen, bei der
ATP vollständig
verschwunden war. Die Ergebnisse sind in 1 gezeigt.
Auf Grund der Ergebnisse hat man gefunden, dass eine störende Substanz,
d.h. ATP nach längstens
10 Minuten Inkubation im Wesentlichen verschwand.
-
Vergleichsbeispiel
-
Dieser
Test wurde durchgeführt,
um die Reinigungsreaktionen der vorliegenden Erfindung mit denen Reinigungsreaktionen
zu vergleichen, welche 5'-Nucleotidase enthalten.
-
Herstellung eines Reinigungsreaktionsgemisches,
das 5'-Nucleotidase
enthält
-
Tris-HCl
(pH 8,0), MgCl
2, 5'-Nucleotidase, Apyrase, Adenosindeaminase
und alkalische Phosphatase wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde
Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 25 μl hinzugegeben. Das Reinigungsreaktionsgemisch
wurde mit den in Tabelle 1 gezeigten Endkonzentrationen hergestellt. Tabelle
1 Ein
Reinigungsreaktionsgemisch, das 5'-Nucleotidase enthält
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| 5'-Nucleotidase | 2,5
U/ml |
| Apyrase | 2
U/ml |
| Adenosindeaminase | 10
U/ml |
| Alkalische
Phosphatase | 20
U/ml |
| Wasser | bis
zu einem Gesamtvolumen von 25 μl |
-
Die
Reinigungsreaktionen können
in den folgenden Reaktionsschemata dargestellt werden.
-
-
Bestimmung der Dauer der
Reinigungsreaktion
-
Die
Reinigungsreaktionen wurden unter Verwendung des vorstehend hergestellten
Reinigungsreaktionsgemisches, wie in Beispiel 1 beschrieben, durchgeführt.
-
Ein
Volumen von 3 μl
eines ATP-Standards (0, 10, 100, 1000 und 10.000 pMol/Röhrchen)
wurde in ein 10 × 57-Pyrex®-Teströhrchen gegeben.
Bei Raumtemperatur wurden 25 μl
des Reinigungsreaktions-Gemisches (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM
MgCl2; 2 U/ml Apyrase; 2,5 U/ml 5'-Nucleotidase 0,1
U/ml Adenosindeaminase; 20 U/ml alkalische Phosphatase) zu jedem
Teströhrchen
hinzugefügt.
Das Gemisch wurde bei 37°C
inkubiert. Dann wurden Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen, Cyclische
Reaktionen und Nachweisreaktionen, wie in Beispiel 2 nachstehend
beschrieben, durchgeführt
und eine Absorption bei 340 nm wurde gemessen, um die Inkubationsdauer
zu bestimmen, bei der ATP vollständig
verschwunden war. Als Ergebnisse hat man gefunden, dass ATP nach
etwa 1 Stunde Inkubation vollständig
verschwunden war.
-
Beispiel 2
-
Mikro-cAMP-Messung in
Gewebekulturen mit dem Enzymatischen Fluorimetrischen Test.
-
(1) Herstellung von Proben
und Reaktionsgemischen
-
A. Herstellung der biologischen
Proben
-
(Präparation von ventrikulären Myocyten)
-
Isolierte
ventrikuläre
Myocyten wurden aus Herzen von 1 Tag alten Ratten erhalten, in Primärkulturen gezüchtet. Es
gab ungefähr
5 Millionen lebensfähige
myokardiale Zellen pro Herz. Nach dem Aussäen bei einer Dichte von ungefähr 1 Million
Zellen pro 100 mm-Platte ließ man
die Zellen in minimalem essentiellen Medium mit Hanks balancierter
Salzlösung
wachsen, welche 5% Kälberserumzellen
enthielt. Simpson et al., Cir. Res. 51, 787 (1982). Am Tag 4 wurde
das Medium gewechselt. Die Kulturen enthielten > 90% myokardiale Zellen und die Zellzahlen
waren über
die Zeit konstant. Simpson et al., Cir. Res. 51, 787 (1982); Rocha-Singh et
al., J. Clin. Invest. 88, 204 (1991); und Rocha-Singh et al., J.
Clin. Invest. 88, 706 (1991).
-
Sechs
Platten von Myocyten wurden zufallsgemäß in zwei Gruppen aufgeteilt
(n = 3 Platten pro Gruppe). Der Phosphodiesterase-Hemmer 3-Isobutyl-1-methylxanthin
(IBMX) wurde zu dem Medium jeder Gruppe hinzugegeben, um eine Endkonzentration
von 2 μM
zu erreichen. Nach 5 Minuten wurde Isoproterenol zu der stimulierten
Gruppe hinzugefügt,
um eine Endkonzentration von 1 μM
zu erreichen, wohingegen die Kontrollgruppe keinen weiteren Wirkstoff
erhielt. Nach 5 Minuten wurden Zellen von allen sechs Platten und
Platten mit Kulturmedium ohne Zellen mit insgesamt 5 ml 100% Ethanol
eluiert. Ein Zehntel des Eluats (0,5 ml) von jeder Platte wurden
entfernt und in einem 12 × 75
mm-Borsilikatglas-Röhrchen
luftgetrocknet und bei –80°C gelagert.
Die anderen 4,5 ml wurden auf ähnliche
Weise luftgetrocknet und gelagert. Zum Zeitpunkt des Tests wurde
das Pellet aufgetaut und in 100 μl
0,5 N Perchlorsäure
resuspendiert. Die Extrakte wurden für 2 Minuten bei 4°C gerührt und
für 1 Minute
mit Hilfe eines Ultraschallgeräts
(Branson Cleaning Equipment Co., ein Smith-Kline-Unternehmen, USA)
mit Ultraschall behandelt. Der Extrakt wurde mit 25 μl 2 N KOH
neutralisiert, bei 2000 × g
für 30
Minuten zentrifugiert und 80 μl
des Überstands
wurden für
den Test entfernt.
-
B. Herstellung des Reinigungsreaktionsgemisches
-
(Siehe Schritt 1 – Reinigungsreaktionen)
-
400 μl 1 M Tris-HCl
(pH 8,0); 40 μl
0,2 mM MgCl
2; 32 μl 500 U/ml Apyrase; 4 μl 4000 U/ml
alkalische Phosphatase, ausschließlich 5'-Nucleotidase wurden gemischt, und zu
dem Gemisch wurde Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 4 ml hinzugefügt, um das
Reinigungsreaktionsgemisch herzustellen (Tabelle 2). Tabelle
2 Reinigungsreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| Apyrase | 4
U/ml |
| Adenosindeaminase | 10
U/ml |
| Alkalische
Phosphatase | 40
U/ml |
| Wasser | bis
zu einem Gesamtvolumen von 4 ml |
-
Nachdem
die in Beispiel 2 (1) hergestellte Präparation von ventrikulären Ratten-Myocyten
auf Eis gekühlt
worden waren, wurden 0,4 μl
des Reaktionsgemisches von Schritt 1 – Optionale Reinigungsreaktion
(100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 3 mM MgCl2; 3
U/ml Apyrase; 150 μg/ml
Adenosindeaminase; 30 U/ml alkalische Phosphatase und 75 μg/ml Glycogenphosphorylase-α) zu der
Präparation
hinzugefügt,
um sämtliche
endogenen Adeninnucleotide, Glycogen und Glucose-6-phosphat zu entfernen.
Nach der Inkubation für
1 Stunde bei 37°C wurden
die Enzyme durch Erhitzen auf 80°C
für 30
Minuten inaktiviert.
-
C. Herstellung des Umwandlungsreaktionsgemisches
-
(Siehe Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen
und Schritt 2 – Optionale
Umwandlungsreaktionen)
-
400 μl 1 M Tris-HCl
(pH 8,0); 40 μl
0,2 mM MgCl
2; 10 μl 4% Rinderserumalbumin; 600 μl 1 M KCl,
80 μl 0,01
M Dithiothreit; 16 μl
0,1 μM ATP;
24 μl 0,5
M Phosphoenolpyruvat; 24 μl
2 U/ml Phosphodiesterase; 24 μl
720 U/ml Myokinase und 160 μl
2000 U/ml Pyruvatkinase wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde Wasser
bis zu einem Gesamtvolumen von 4 ml hinzugefügt, um das Umwandlungsreaktionsgemisch
herzustellen (Tabelle 3). Tabelle
3 Umwandlungsreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| Rinderserumalbumin | 0,01% |
| KCl | 150
mM |
| Dithiothreit | 2
mM |
| ATP | 40
nM |
| Phosphoenolpyruvat | 3
mM |
| Phosphodiesterase | 12
mU/ml |
| Myokinase | 4,5
U/ml |
| Pyruvatkinase | 80
U/ml |
| Wasser | bis
zu einem Gesamtvolumen von 4 ml |
-
D. Herstellung des Cyclisierungsreaktionsgemisches
-
(Siehe Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2)
-
400 μl 1 M Tris-HCl
(pH 8,0); 40 μl
0,2 mM MgCl
2; 10 μl 4% Rinderserumalbumin; 30 μl 0,1 M Fructose, 160 μl 1500 U/ml
Hexokinase wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde Wasser bis
zu einem Gesamtvolumen von 4 ml hinzugefügt, um Cyclisierungsreaktionsgemisch
herzustellen (Tabelle 4). Tabelle
4 Cyclisierungsreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| Rinderserumalbumin | 0,01% |
| Fructose | 3
mM |
| Hexokinase | 60
mM |
| Wasser | bis
zu einem Gesamtvolumen von 4 ml |
-
E. Herstellung des Nachweisreaktionsgemisches
-
(Siehe Schritt 3 – Nachweisreaktion
2)
-
2000 μl 1 M Tris-HCl
(pH 8,0); 320 μl
0,2 mM EDTA; 120 μl
0,1 M NADP
+; 6 μl 3500 U/ml Phosphoglucoseisomerase;
6 μl 1750
U/ml Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde Wasser bis zu einem Gesamtvolumen
von 4 ml hinzugefügt,
um das Cyclisierungsreaktionsgemisch herzustellen (Tabelle 5). Tabelle
5 Nachweisreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| EDTA | 3,2
mM |
| NADP+ | 0,01% |
| Phosphoglucoseisomerase | 1
U/ml |
| Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase | 60
mM |
| Wasser | bis
zu einem Gesamtvolumen von 4 ml |
-
(2) Mikro-cAMP-Messung
in Gewebekulturen mit dem Enzymatischen Fluorimetrischen Test
-
Gemäß dem Enzymatischen
Fluorimetrischen Test, welcher eine Reihe von Reinigungsreaktionen, Umwandlungsreaktionen,
cyclischen Reaktionen und Nachweisreaktionen umfasst, wurde das
cAMP in der Präparation
ventrikulärer
Myocyten gemessen, die in (A) als eine Probe vorbereitet wurde.
-
1) Reinigungsreaktionen
-
(Schritt 1 – Reinigungsreaktionen)
-
Ein
Volumen von 3 μl
eines neutralisierten Myocyten-Extrakts (entweder 2,4% oder 0,24%
des gesamten Eluats von einer 100 mm-Platte) oder 3 μl eines ATP-Standards (0, 3,6,
7,2, 14,4, 21,6 und 28,8 pMol/20 μl)
wurden in ein 10 × 57-Pyrex®-Teströhrchen hinzugegeben
(Iwaki Glas). Bei Raumtemperatur wurden 25 μl von nach (B) zubereiteten
Reinigungsreaktionsgemisch (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM MgCl2; 2 U/ml Apyrase; 10 U/ml Adenosindeaminase;
40 U/ml alkalische Phosphatase, ausschließlich 5'-Nucleotidase) zu jedem der Teströhrchen hinzugefügt.
-
Das
Gemisch wurde für
10 Minuten bei 37°C
inkubiert. Die Enzyme wurden dann durch Erhitzen auf 90°C für 30 Minuten
inaktiviert. Eine interne Gewebeleerkontrolle wurde auf ähnliche
Weise vorbereitet.
-
2) Umwandlungsreaktionen
-
(Schritt 2 – Umwandlungsreaktionen
(Umwandlung zu AMP) und Optionale Umwandlungsreaktionen (Umwandlung
zu ATP))
-
Ein
Volumen von 25 μl
des nach (C) zubereiteten Umwandlungsreaktionsgemisches (100 mM Tris-HCl,
pH 8,0; 2 mM MgCl2; 0,01% Rinderserumalbumin;
150 mM KCl; 2 mM Dithiothreit; 40 nM ATP; 3 mM Phosphoenolpyruvat;
12 U/ml Phosphodiesterase; 4,5 U/ml Myokinase und 80 U/ml Pyruvatkinase)
wurde zu jedem der Teströhrchen
der Reinigungsreaktionen hinzugefügt. Das Gemisch wurde über Nacht
bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktionen wurden durch Erhitzen
auf 90°C
für 5 Minuten
gestoppt.
-
3) Cyclische Reaktionen
-
(Schritt 3 – Cyclische
Nachweisreaktionen 2)
-
Ein
Volumen von 25 μl
des nach (D) zubereiteten Cyclisierungsreaktionsgemisches (100 mM
Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM MgCl2; 0,01% Rinderserumalbumin;
3 mM Fructose; 60 U/ml Hexokinase) wurde zu jedem der Teströhrchen der
Umwandlungsreaktionen hinzugefügt.
Im Hinblick auf die hohen Enzym-Konzentrationen pro Reaktion war
es wichtig, diese Reaktionen bei 0°C anzusetzen, um die gleiche
Startzeit für
alle Teströhrchen zu
gewährleisten.
Das Gemisch wurde für
2 Stunden bei 37°C
inkubiert (etwa 4000–10.000
Zyklen).
-
4) Nachweisreaktionen
-
(Schritt 3 – Nachweisreaktionen
2)
-
Ein
Volumen von 125 μl
des nach (E) zubereiteten Nachweisreaktionsgemisches (100 mM Tris-HCl, pH
8,0; 3,2 mM EDTA; 0,6 mM NADP+; 1 U/ml Phosphoglucoseisomerase;
0,5 U/ml Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase) wurde zu jedem der Teströhrchen der
cyclischen Reaktionen hinzugefügt.
Nach 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Endkonzentration von
NADPH mit einem Fluorometer (Optical Technology Devices Inc., NY)
gemessen. Das Fluorometer wurde so eingestellt, dass eine Anzeige
von 10 fluorimetrischen Einheiten 1 nMol NADPH in 900 μl Puffer
(50 mM Tris-HCl, pH 8,0) entsprach.
-
Die
einzelnen Schritte des Tests wurden überprüft, indem gleichzeitig interne Kontrollen
mit bekannten Konzentrationen des jeweiligen Substrates getestet
wurden, zum Beispiel wurde zusätzliches
ATP eingesetzt, um die Reinigungsreaktionen zu überprüfen, eine AMP-Standardkurve
wurde verwendet, um die Umwandlungsreaktionen zu testen und eine
ATP-Standardkurve wurde verwendet, um die cyclischen Reaktionen
zu testen.
-
5) Ergebnisse
-
Messung
der Absorption des cAMP-Standards (0, 3,6, 7,2, 14,4, 21,6 und 28,8
pMol/20 μl)
bei 340 nm brachte die in 2 gezeigte
cAMP-Standardkurve hervor.
-
cAMP-Werte
der Kontrollgruppe, welche keinen zusätzlichen Wirkstoff erhielt,
und von Isoproterenol-stimulierten Zellen aus (1) (A) wurden für ein Zehntel
des Eluents von jeder Platte mit Zellen gemessen, wobei die cAMP-Standardkurve
(2) verwendet wurde, um einen tatsächlichen
cAMP-Wert von 680 pMol/100 mm-Platte
zu ergeben.
-
Die
Ergebnisse der Messung des cAMP-Gehalts unter Verwendung des fluorimetrischen
Tests der vorliegenden Erfindung, eines immuncolorimetrischen Tests
(Amersham International) und eines Radioimmuntests (Amersham International)
werden in 3 gezeigt. Die Werte, die von
den cAMP-Messungen erzeugt wurden, stimmen ausreichend mit den Werten überein,
die mit einem im Handel erhältlichen
radioaktiven Test erhalten werden, mit einer Streuung von üblicherweise
weniger als 5%.
-
Außerdem wurde
die Adenylatcyclase-Aktivität
von den Ergebnissen einer quantitativen cAMP-Messung mit dem Test
der vorliegenden Erfindung, einem Radioimmuntest und dem Salomon-Verfahren
gemessen. Die Werte von drei Verfahren werden in 4 gezeigt.
Die Werte der Adenylatcyclase-Aktivität werden über die cAMP-Mengen (pMol)
bestimmt, die pro Minute von 1 mg Protein erzeugt werden.
-
Beispiel 3
-
Die
jeweils passende Menge von 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,2 mM MgCl
2, 1 M K
2HPO
4, 0,1 mM AMP, 4000 U/ml alkalische Phosphatase
und 10 mg/ml Glycogenphosphorylase wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde
Wasser hinzugefügt, um
ein Reinigungsreaktionsgemisch in den wie nachstehend gezeigten
Endkonzentrationen herzustellen. Tabelle
6 Reinigungsreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| K2HPO4 + | 5
mM |
| AMP | 0,1
mM |
| Alkalische
Phosphatase | 20
U/ml |
| Glycogenphosphorylase | 10 μg/ml |
| Wasser | – |
-
Die
jeweils passende Menge von 1 M Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM MgCl
2, 0,1 M AMP, 0,1 M Dithiothreit, 1 mM Glucose-1,6-diphosphat,
4% Rinderserumalbumin, 0,1 M NADP und 10 mg/ml Glycogenphosphorylase, 10
mg/ml Phosphoglucomutase und 5 mg/ml Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase
wurden gemischt, und zu dem Gemisch wurde Wasser hinzugefügt, um ein
Umwandlungsreaktionsgemisch in den wie nachstehend gezeigten Endkonzentrationen
herzustellen. Tabelle
7 Reinigungsreaktionsgemisch
| Verbindung | Endkonzentration
in der Reaktion |
| Tris-HCl
pH 8,0 | 100
mM |
| MgCl2 | 2
mM |
| K2HPO4 | 5
mM |
| AMP | 0,1
mM |
| Dithiothreit | 1
mM |
| Glucose-1,6-diphosphat | 4 μM |
| Rinderserumalbumin | 0,01% |
| NADP | 0,2
mM |
| Glycogenphosphorylase | 20 μg/ml |
| Phosphoglucomutase | 4 μg/ml |
| Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase | 2 μg/ml |
| Wasser | – |
-
1) Reinigungsreaktionen
-
(Schritt 1 – Optionale
Reinigungsreaktionen 2)
-
Eine
wässrige
Glycogenlösung,
die 206 μM
Glycogen umfasste, wurde hergestellt und in 12 Pyrex®-Teströhrchen verteilt
(Iwaki Glas, 10 × 57
mm), jeweils drei Röhrchen
in einer Menge von 0, 20, 40 und 80 μl, und zu jedem Teströhrchen wurde
Wasser bis zu einem Gesamtvolumen von 80 μl hinzugefügt. Bei Raumtemperatur wurden
zu jedem Teströhrchen
500 μl Reinigungsreaktionsgemisch
(100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM MgCl2; 5
mM K2HPO4; 0,1 mM
AMP; 20 U/ml alkalische Phosphatase; und 10 μg/ml Glycogenphosphorylase)
hinzugegeben. Das Gemisch wurde bei 37°C für 60 Minuten inkubiert.
-
2) Nachweisreaktionen
-
(Schritt 3 – Nachweisreaktionen
1)
-
Ein
Volumen von 500 μl
des Umwandlungsreaktionsgemisches (100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 2 mM MgCl2; 5 mM K2HPO4; 0,1 mM AMP; 1 mM Dithiothreit; 4 μM Glucose-1,6-diphosphat; 0,01%
Rinderserumalbumin; 0,2 mM NADP und 20 μg/ml Glycogenphosphorylase,
4 μg/ml
Phosphoglucomutase und 2 μg/ml
Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase)
wurde zu jedem Teströhrchen
hinzugefügt.
Das Gemisch wurde bei 37°C für 30 Minuten
inkubiert. Die Fluoreszenzwellenlänge von 460 nm wurde für jedes
Teströhrchen
bei einer Anregungswellenlänge
von 340 nm gemessen. Im Ergebnis bestätigten die Werte, dass das
Glycogen in der Glycogenlösung
durch die Reinigungsreaktionen vollständig entfernt wurde.
-
Beispiel 4
-
Vorbeugende Wirkung gegen
die Trübung
durch Chelatbildner
-
Ein
Volumen von 125 μl
des Nachweisreaktionsgemisches ohne EDTA (100 mM Tris-HCl, pH 8,0;
0,6 M NADP+; 1 U/ml Phosphoglucoseisomerase;
0,5 U/ml Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase) wurde zu jedem Teströhrchen nach
den cyclischen Reaktionen in Beispiel 2 hinzugefügt. Das Gemisch wurde für 30 Minuten bei
90°C inkubiert
und die Enzyme wurden inaktiviert. Die Trübung in der Testlösung wurde
per Sichtkontrolle überwacht.
Die Lösung
von Beispiel 2, zu welcher Nachweisgemisch mit EDTA hinzugefügt wurde,
wurde als Kontrolle verwendet. Die Enzyme in der Kontrolle wurden
durch EDTA bei Raumtemperatur inaktiviert.
-
Im
Ergebnis wurde das durch Erhitzen inaktivierte Gemisch trübe, wohingegen
die Kontrolle klar war.
-
INDUSTRIELLE
ANWENDBARKEIT
-
Die
vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Bestimmung des cAMP-Gehalts oder der
Adenylatcyclase-Aktivität
in einer biologischen Probe ohne Verwendung von radioaktiven Agentien
bereit.
-
Das
heißt,
die Reinigungsreaktionen gemäß der vorliegenden
Erfindung können
endogene nicht-cyclische Adeninnucleotide wie z.B. ATP, ADP und
AMP sowie Glucose-6-phosphat, welche als störende Substanzen bei dem cAMP-Test
fungieren, selektiv und wirksam entfernen. Nach der Umwandlung von
cAMP in einer Probe in AMP wird AMP enzymatisch zu ATP umgewandelt.
ATP wird dann über
Fructose-6-phosphat zu Glucose-6-phosphat umgewandelt, um NADPH
zu erhalten, die Konzentration von NADPH wird schließlich mit
einem fluorimetrischen Verfahren bestimmt. Durch die Korrelation
mit der Endkonzentration von NADPH kann der cAMP-Gehalt oder die
Adenylatcyclase-Aktivität
nur durch enzymatische oder chemische Reaktionen ohne die Verwendung
radioaktiver Agentien sicher erhalten werden.
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Insbesondere
sind nach der vorliegenden Erfindung die in den Reinigungsreaktionen
eingesetzten Enzyme auf Apyrase, alkalische Phosphatase und Adenosinphosphatase
beschränkt,
ausschließlich
5'-Nucleotidase.
Auch gelingt es der vorliegenden Erfindung durch Anpassung der Konzentrationen
die Bestimmungsschritte erheblich zu vereinfachen und deren Reaktionsdauer
extrem auf etwa 5 bis 10 Minuten zu verkürzen, d.h. von einem Zwölftel bis
zu einem Sechstel im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren.
-
Da
der cAMP-Gehalt von der Eutrophie, von der Proliferation, von der
Differenzierung, von der Anpassung der Zellen und von Änderungen
in der Sensitivität
abhängt,
stellt die Messung von cAMP eine nützliche Methode bereit, die
Lebensfähigkeit
der Zellen, die Achsenfunktion endokriner Hormone, die Adenylatcyclase-Aktivität und die
Phosphodiesterase-Aktivität
zu testen. Daher kann der Wert des cAMP-Gehalts ein hervorragender
Index auf den Gebieten der Grundlagen- und der klinischen Medizin
sein.
-
Nach
dem Verfahren der vorliegenden Erfindung können der cAMP-Gehalt und die
Adenylatcyclase-Aktivität,
welche dem cAMP entspricht, sicher und mit hoher Sensitivität bestimmt
werden.
