CN103808929A - 一种gbss1比酶活测定方法 - Google Patents

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刘德瑞
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Abstract

本发明涉及一种GBSS1比酶活测定方法。提供了一种颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)比酶活测定的方法，应用ELISA技术对酶提取物在GBSS1蛋白水平上进行了定量，并对以往的GBSS1酶活测定步骤进行了简化。

Description

一种GBSS1比酶活测定方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域；更具体地，本发明涉及一种GBSS 1比酶活测定方法。
背景技术
水稻蜡质基因(Wx)编码的GBSS1(Granule-Bound Starch Synthase 1，2.4.1.242)负责水稻种子胚乳中直链淀粉的合成(Sano Y et al(1985).GammaField Symp,24:63-77；Shapter et al(2009).J.Cereal Sci,49:4-11)。水稻蜡质基因的表达量、GBSS1酶活的高低与胚乳中直链淀粉的含量呈显著正相关(WangZY et al(1995).The Plant Journal,7:613-622；Sano Y et al(2008).Theor ApplGenet,116:979-989)。近20多年来，水稻蜡质基因的表达与调控规律的研究及其在稻米品质改良上的应用研究取得了极大的进展。在上述研究过程中，GBSS1酶活的测定是经常用到的常规实验方法。
已有的GBSS1酶活的测定方法有两种，两种方法的原理都是根据GBSS1参与的酶促反应。第一种方法是用14C标记GBSS1酶促反应底物ADPG(腺苷二磷酸葡萄糖)中的葡萄糖加入反应体系，然后根据14C掺入反应产物中的量来定义其酶活水平(Singletary GW et al(1997).Plant Physiol,113:293-304)。第二种是间接测定的方法，它根据GBSS1参与的酶促反应中葡萄糖分子被转移入淀粉后，底物ADPG释放出ADP，再通过两步反应，最后检测NADPH的量来间接反映GBSS1的酶活。反应过程如下：
第一步反应是
Figure BDA00002376247700011
第二步反应是
Figure BDA00002376247700012
第三步反应是
Figure BDA00002376247700021
上述两种方法能获得的都是样品中GBSS1酶活，但无法判断样品中酶活的不同是由于酶蛋白的量不同引起的还是比酶活的不同引起的。
因此，本领域有必要开发改进的GBSS1酶活测定方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种GBSS1比酶活测定方法。
在本发明的第一方面，提供一种测定作物种子中颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)的比酶活的方法，所述方法包括：
(1)从作物种子中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)获得待测样品(GBSS1提取液)中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量；
(2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行如(I)反应并记录颗粒结合型淀粉合成酶反应时间：
之后加入磷酸烯醇式丙酮酸(或其盐)、丙酮酸激酶，进行如(II)反应：
Figure BDA00002376247700023
(3)测定反应(II)中生成的产物ATP的量，除以步骤(1)获得的颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量以及步骤(2)记录的颗粒结合型淀粉合成酶反应时间，获得颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)的比酶活。
在另一优选例中，所述的作物种子为未成熟种子。
在另一优选例中，步骤(1)中，采用制作标准曲线的方法获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
在另一优选例中，为了获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量，标准曲线如下制作：将颗粒结合型淀粉合成酶标准品(较佳地，为原核表达纯化的，纯度>99%)进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。
在另一优选例中，获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量包括：将待测样品进行蛋白变性，应用颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的颗粒结合型淀粉合成酶的浓度；进而获得颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
在另一优选例中，采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。较佳地，将ATP标准品(较佳地，纯度>99%)进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。
在另一优选例中，测定产物ATP量的方法包括：测定产物中ATP的发光值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的ATP浓度；进而获得产物ATP量。
在另一优选例中，对所述的待测样品、产物进行倍数稀释。
在另一优选例中，(I)反应包括：将待测样品(如GBSS1酶提取液)加入到反应液I中，待测样品与反应液I体积比为：1:(1.5-2.1)，反应10-30min，终止反应后冰浴；其中反应液I包括：50mmol/L HEPES-NaOH；1.6mmol/L ADPG；0.7mg/ml支链淀粉；15mmol/L DTT(较佳地，各组分可±20%；更佳地±10%)。
在另一优选例中，(II)反应包括：在(I)反应的产物中加入反应液II，30±2℃反应20±10min，终止反应；其中反应液II包括：50mmol/L HEPES-NaOH；4mmol/LPEP-K(磷酸烯醇式丙酮酸钾)；200mmol/L KCl；10mmol/L MgCl2；1.2单位丙酮酸激酶(较佳地，各组分可±20%；更佳地±10%)。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、酶标仪记数得到的ELISA数值/lg(GBSS1浓度)标准曲线。
图2、生物发光仪记数得到的lg(发光值)/lg(ATP)标准曲线。
图3、不同直链淀粉含量的水稻品种中GBSS1比酶活的测定结果及各品种GBSS1蛋白含量。(A)不同直链淀粉含量的水稻品种中GBSS1的比酶活；(B)不同直链淀粉含量的水稻品种中GBSS1的蛋白含量。
图4、开花后不同天数未成熟种子中GBSS1酶比活以及GBSS1蛋白表达量。(A)ELISA定量GBSS1，开花后不同天数未成熟种子中GBSS1比酶活；(B)开花后不同天数胚乳中GBSS1浓度。
具体实施方式
水稻GBSS1负责胚乳中直链淀粉合成，它的酶活高低在很大程度上与稻米中直链淀粉的含量和稻米的食用及蒸煮品质有关。本发明人经过深入的研究，提供了一种水稻颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)比酶活测定的方法，应用ELISA技术对酶提取物在GBSS1蛋白水平上进行了定量，并对以往的GBSS1酶活测定步骤进行了简化。在此基础上完成了本发明。
本发明的方法主要包括：(1)从作物种子(较佳地，为未成熟种子)中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定(ELISA)获得待测样品(较佳地为GBSS1提取液)中GBSS1的蛋白量；(2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行反应并记录GBSS1反应时间；之后加入磷酸烯醇式丙酮酸(或其盐)、丙酮酸激酶，进行反应：(3)测定产物ATP量，除以步骤(1)获得的GBSS1的蛋白量以及步骤(2)记录的GBSS 1反应时间，获得水稻颗粒结合型淀粉合成酶(GBSS1酶)的比酶活。
在现有技术中，针对GBSS1的比酶活测定，一直是一个难以攻克的难题。这是由于GBSS1这一蛋白本身的特点决定的。GBSS1是非水溶性的蛋白，在样品中，其易于与淀粉颗粒结合，常规的蛋白测定方法难以实现准确的蛋白定量。为了克服这一困难，本发明人在研究初期尝试了多种蛋白定量测定手段，最后借助于ELISA的定量技术实现了准确测定，从而发展了GBSS1的比酶活测定方法。
作为本发明的优选方式，步骤(1)中采用制作标准曲线的方法获得待测样品中GBSS1的蛋白量。较佳地，标准曲线如下制作：将GBSS1标准品(较佳地，原核表达纯化的，纯度>99%)进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶GBSS1特异性抗体以及与酶GBSS1特异性抗体结合的带HRP标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。
将待测样品进行蛋白变性，应用酶GBSS1特异性抗体以及与酶GBSS1特异性抗体结合的带HRP标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的GBSS1的浓度；进而获得GBSS 1的蛋白量。
在完成步骤(2)的反应后，本发明人采取了直接测定ATP的量的方法，而不再进行反应形成ADP这一步骤，这有利于简化反应程序。之后，结合ELISA对GBSS1的定量数据来反映GBSS1的比酶活。
作为本发明的优选方式，步骤(3)中采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。将ATP标准品(较佳地，纯度>99%)进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。
测定产物中ATP的发光值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的ATP浓度；进而获得产物ATP量。
ATP发光值的测定是本领域技术人员熟知的技术，例如根据荧光素酶催化荧光素产生荧光时需要ATP提供能量的原理来进行测定，当荧光素酶和荧光素都过量时，在一定的浓度范围内荧光的产生和ATP的浓度成正比，这样就可以高灵敏地检测溶液中的ATP浓度。现有技术中已经有商品化的ATP检测试剂盒(ATP Assay Kit)，可以用于检测普通溶液中或细胞或组织内的ATP水平。
在进行测定时，可对所述的待测样品、产物进行倍数稀释，这是本领域技术人员易于理解并操作的。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
材料
粳稻品种中花11；32657、南粳46；美锋6号、38138；LP54、Kasalath均种植在中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所人工气候室，温度控制为29±1℃，湿度控制在45-75%，自然光照照射。
实施例1、GBSS1酶提取液的制备
取1粒水稻种子在液氮中冷冻1min，人工去壳、种皮以及胚后磨碎(此步操作皆在0-2℃进行)。每个水稻品种进行各取三粒，作为三次重复。按Nakamura等(Nakamura Y et al(1989).Plant Cell Physiol,30:833-839)所述的方法，用1ml抽提缓冲液悬浮磨碎的组织，12,000g，4℃离心10min，沉淀物用1ml抽提缓冲液重复洗2-3次，最终将沉淀物悬浮在100ul抽提缓冲液中，制成GBSS1酶提取液。
实施例2、酶提取液中GBSS1蛋白的定量测定
2.1总蛋白量的测定
依据Bradford法(Bradford MM(1976).Anal Biochem,72:248-254)制备牛血清白蛋白的标准曲线，并将水稻的GBSS 1酶提取液作1:100稀释后测定总蛋白的量。
2.2ELISA方法测定酶抽提液中GBSS1的蛋白量
2.2.1原核表达的GBSS 1蛋白浓度标准曲线的制定
原核表达的GBSS1经Ni柱和Superdex200柱纯化后，GBSS1蛋白含量在99%以上的样品作为标准样品。样品用Brandford方法和2.1中制作的标准曲线测定蛋白浓度。然后，标准样品作梯度稀释，使蛋白浓度在1.0×10-4-1.0×10-2mg/ml之间，等体积加入缓冲液(0.05mol/L，Tris pH6.8，2.8%SDS，10%甘油，5%巯基乙醇)，沸水浴5min，使蛋白变性，再加入等体积上述缓冲液并吸取上清。用Gaastra(Gaastra W(1984),Methods Mol Biol,1:349-55)所建立起的ELISA方法对每个稀释样品中的GBSS1蛋白量进行测定，测定方法具体为：以10ul上清混合90ul包被稀释液(0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3缓冲液，pH9.6)进行包被，包被条件37℃，4小时。然后用10%BSA(用洗涤液(NaCl 0.14mol/L，KH2PO40.0015mol/L，Na2HPO4.12H2O 0.008mol/L，KCl 0.0027mol/L，Tween200.05%)配制)封闭，37℃，1小时。用洗涤液洗涤酶标板3次，每次3-5min。而后用1抗和2抗稀释液(用样本稀释液(不含Tween20的洗涤液)稀释)分别处理，各自在37℃下孵育1小时，中间分别用洗涤液洗涤酶标板3次，3-5min。抗GBSS1的兔一抗(英基公司制备)和HRP标记的山羊二抗(购自CW-Bio公司)的稀释倍数均为1:5000。用TMB-过氧化氢尿素溶液(购自Amresco公司)37℃避光放置3-5min，再用0.2mol/L H2SO4终止液进行显色反应。各反应液在酶标仪(BioTek SynergyTM2Multi-Mode Microplate Reader)上450nm波长处分别测定光吸收值，每个梯度级作三次重复，取平均值，然后将光吸收值对蛋白浓度做成标准曲线(图1)。用Excel软件分析，获得计算公式1：
ELISA数值=0.3432×(lgGBSS1浓度+5)-0.0658，因此得出GBSS1定量的计算公式2：
GBSS1的量=Power{10,[(ELISA数值+0.0658)÷0.3432-5]}×酶反应中所用粗提液体积。
酶标仪记数得到的ELISA数值/lg(GBSS1浓度)标准曲线如图1。
2.2.2酶提取液中GBSS1蛋白的定量
水稻的酶提取液加入等体积缓冲液(0.05mol/L Tris pH6.8，2.8%SDS，10%甘油，5%巯基乙醇)，沸水浴5min，使蛋白变性，吸取上清，经适当稀释，按2.2.1节的方法测定GBSS1蛋白浓度，按计算公式2得到GBSS1蛋白的量。
实施例3、ATP定量标准曲线的制作
精确称量购自SIGMA公司的ATP粉剂，配制成1.0×10-8至1.0×10-4mol/l的梯度溶液，然后用SIGMA公司的试剂盒(ATP assay kit for Luciferase/Luciferin)进行反应，在Promega GloMax-20/20Luminometer上测定发光值，并据此获得发光值相对ATP浓度的标准曲线。用Excel软件获得计算公式3：lg发光值=1.0114×(lgATP浓度+9)+1.052。
生物发光仪计数得到的lg(发光值)/lg(ATP)标准曲线如图2。
实施例4、GBSS1的比酶活测定
第一步，取10μl GBSS 1酶提取液加入18μl反应液I(50mmol/LHEPES-NaOH pH 7.4；1.6mmol/L ADPG；0.7mg/ml土豆来源的支链淀粉(Fluka公司)；15mmol/L DTT)，30℃反应20min。然后置于沸水浴中2min终止反应，冰浴中冷却。
第二步，冰浴冷却的反应液中加10μl反应液II(含50mmol/L HEPES-NaOH，pH7.4；4mmol/L PEP-K；200mmol/L KCl；10mmol/L MgCl2；1.2unit丙酮酸激酶)，30℃反应20min。沸水浴中保持2min终止反应，然后于10,000g离心10min，吸取上清。
第三步，反应产物的上清液作100倍稀释，按照100ul加入100ul 625倍稀释的SIGMA试剂盒ATP assay kit for Luciferase/Luciferin中的ATP assay反应液的比例，测定发光值，根据发光值和稀释倍数以及计算公式3，计算得到上述反应上清中的ATP总量。
第四步，按公式4：
GBSS1比酶活(mol/g/min)=ATP总量÷反应液中的GBSS 1总量÷酶反应时间；
计算获得GBSS1的比酶活值。
实施例5、基于ELISA技术测定GBSS1酶比活的应用
5.1直链淀粉含量相近水稻品种中GBSS1比酶活分析
依据(Williams PC et al(1970).Cereal Chemistry,47:411-420)的方法对一些水稻品种胚乳中的直链淀粉含量进行测定，本发明人发现了三组直链淀粉含量相近的水稻品种:32657及与之相近的南粳46，美锋6号及与之相近的38138，LP54及与之相近的Kasalath。不同水稻品种的直链淀粉含量测定结果如表1作为比酶活测定材料，收集其开花后7天的未成熟种子胚乳进行比酶活测定。
表1.不同水稻品种的直链淀粉含量测定结果
  材料   直链淀粉含量(%)
  32657   4.84
  南粳46   6.10
  美锋6号   15.38
  38138   13.82
  LP54   20
  Kasalath   26
根据方法2.1提取上述四组水稻未成熟种子胚乳的GBSS1酶提取液，并按方法2.2.1所述Bradford法测定提取液中的总蛋白浓度，以内参Actin的蛋白量为调平上样的标准，取等量总蛋白分别进行SDS-PAGE电泳、Western blot检测和GBSS1比酶活的测定(图3)。
如图3所示，在总蛋白一致前提下，GBSS1在各材料中的含量存在明显差异(图3B)；在直链淀粉含量接近的水稻品种中，GBSS1的比酶活也不尽相同(图3A)。在32657和南粳46以及LP54和Kasalath两组水稻品种中，虽然都是前一个水稻品种的GBSS1比酶活明显高于后者，但是在胚乳中GBSS1的蛋白量前者都要比后者少很多(32657中GBSS 1的蛋白含量相当于南粳46中的60.58%；LP54中的GBSS1蛋白含量相当于Kasalath中的79.97%，Tanon公司GIS2010凝胶成像系统GIS软件计算获得)，因此它的直链淀粉含量要比后者略低；在美锋6号和38138中，前者的GBSS1比酶活也是高于后者，同时两种水稻品种胚乳中GBSS1的相对含量也比较接近，所以最终种子中直链淀粉的含量略高于后者。根据上述比较可见，本发明的方法测得的比酶活是准确的。
而在Nakamura等(1989)的酶活测定方法中，单纯以颖果的颗数或总蛋白量为定量标准，获得的酶活数值不能反映酶蛋白本身的比活性高低，而是酶蛋白量和比酶活的一个综合体现。
5.2开花后不同天数水稻胚乳中GBSS1的酶活分析
本发明人收集了粳稻中花11开花后3至11天的未成熟种子，按实施例1中所述的方法制备了GBSS1酶提取液，采取借助于ELISA技术的GBSS1比酶活测定方法(实施例2-4)测定了GBSS1的比活。
结果表明，从开花后3天开始，GBSS1的比活呈慢慢降低趋势(图4A)。接着本发明人又对粳稻中花11开花后3至11天的未成熟种子中取等量的总蛋白，进行SDS-PAGE电泳，并用抗GBSS1的抗体进行Western blot检测。按本发明人设定的电泳上样量，GBSS1蛋白在开花后5天开始被检查到，从第8天起蛋白量明显增强(图4B)。因此，虽然在开花后3天，GBSS1的酶比活相对最高，但是它的蛋白含量非常少，以致用普通的western blot都检测不到它的量。由于GBSS1的表达于开花后5天之后达到最高(http://signal.salk.edu/cgi-bin/RiceGE)，因此可以看出，水稻胚乳中直链淀粉的合成主要在开花后5天开始。
综上所述，本发明发展了一种基于ELISA技术定量GBSS1的比酶活测定方法，一方面，可以方便地在不具同位素操作条件的实验室中使用，而且与已报道的非同位素测定方法相比，增加了GBSS1蛋白的定量步骤，简化了后续的酶反应步骤，大大提高了实验的精确度。另一方面，将本发明改进的测量方法运用于水稻或其他作物的GBSS1酶活机理研究中，可以判断作物胚乳中影响GBSS1酶活的不同因素，为其酶活机理研究提供便利。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种测定作物种子中颗粒结合型淀粉合成酶的比酶活的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)从作物种子中提取颗粒结合型淀粉合成酶，获得酶提取液，作为待测样品；采用酶联免疫吸附测定获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量；
(2)将待测样品与支链淀粉、底物ADPG进行如(I)反应并记录颗粒结合型淀粉合成酶反应时间：
Figure FDA00002376247600011
之后加入磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸激酶，进行如(II)反应：
(3)测定反应(II)中生成的产物ATP的量，除以步骤(1)获得的颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量以及步骤(2)记录的颗粒结合型淀粉合成酶反应时间，获得颗粒结合型淀粉合成酶的比酶活。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用制作标准曲线的方法获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，标准曲线如下制作：将颗粒结合型淀粉合成酶标准品进行梯度稀释，记录每一梯度酶浓度，蛋白变性后，应用酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后显色反应，测定光吸收值，将每一梯度酶浓度样品的光吸收值对酶浓度制成标准曲线。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于，获得待测样品中颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量包括：将待测样品进行蛋白变性，应用颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体以及与酶颗粒结合型淀粉合成酶特异性抗体结合的带显色标记的二抗进行免疫反应，之后进行显色反应，测定光吸收值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的颗粒结合型淀粉合成酶的浓度；进而获得颗粒结合型淀粉合成酶的蛋白量。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，采用制作标准曲线的方法测定产物ATP量。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，将ATP标准品进行梯度稀释，测定每一梯度浓度ATP的发光值，将获得的每一梯度浓度ATP的发光值对ATP浓度制成标准曲线。
7.如权利要求5或6所述的方法，其特征在于，测定产物ATP量的方法包括：
测定产物中ATP的发光值；根据该获得的光吸收值，从标准曲线中获得相应的ATP浓度；进而获得产物ATP量。
8.如权利要求2-7任一所述的方法，其特征在于，对所述的待测样品、产物进行倍数稀释。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(I)反应包括：将待测样品加入到反应液I中，待测样品与反应液I体积比为：1:(1.5-2.1)，反应10-30min，终止反应后冰浴；其中反应液I包括：50mmol/L HEPES-NaOH；1.6mmol/L ADPG；0.7mg/ml支链淀粉；15mmol/L DTT。
10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(II)反应包括：在(I)反应的产物中加入反应液II，30±2℃反应20±10min，终止反应；其中反应液II包括：50mmol/LHEPES-NaOH；4mmol/L PEP-K；200mmol/L KCl；10mmol/L MgCl2；1.2单位丙酮酸激酶。
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