CN1680805A

CN1680805A - 环境水体微生物快速检测方法及试剂

Info

Publication number: CN1680805A
Application number: CN 200410026795
Authority: CN
Inventors: 张菊梅; 吴清平; 吴慧清; 郭伟鹏
Original assignee: Guangzhou Huankai Biotechnology Co Ltd; Guangdong Institute of Microbiology
Current assignee: Guangzhou Huankai Microbial Sci&tech Co ltd; Guangdong Detection Center of Microbiology of Guangdong Institute of Microbiology
Priority date: 2004-04-08
Filing date: 2004-04-08
Publication date: 2005-10-12
Anticipated expiration: 2024-04-08
Also published as: CN100507525C

Abstract

本发明涉及一种快速、定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞数量的检测方法及试剂，首先将水样依次经过不同孔径(由大到小)的微孔滤膜过滤，取下滤膜进行ATP发光检测；同时进行ATP标准溶液和空白微孔滤膜的发光检测，根据ATP浓度与其发光脉冲计数的对数关系作线性回归方程：Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]；最后根据滤膜的CPM值推算样品的ATP浓度及水体中细菌和微藻细胞等微生物的含量。本发明可以解决目前ATP生物发光法用于环境水体微生物快速检测过程中存在的干扰问题，显著提高检测的灵敏度和缩短检测所需的时间。

Description

环境水体微生物快速检测方法及试剂

[所属技术领域]

本发明涉及一种快速、定量检测江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等水体中细菌总数、微藻细胞等微生物数量的快速检测方法及试剂。

[背景技术]

江河湖水、工业用水、生活饮用水及海水等各种水体中微生物数量是评判其洁净程度的重要指标，常规方式是工作人员采集水样，然后带回实验室分类培养，从培养到肉眼可见的菌落需要1～15天时间(根据微生物种类而定)，且操作繁琐，局限于实验室，对操作人员的技术水平要求高，容易出现人为的误差。而迄今为止，作为自然环境中的微生物，能够进行人工培养的只是很少一部分，一般认为只有5～10％，没有单独一种培养基或一套物理、化学条件能够满足样品中所有微生物的生理要求。同时，培养基的制备、平板培养和菌落计数工作量大、费时、费力。因此，野外环境及生产现场监测迫切需要建立一套简便、灵敏、快速的微生物数量检测方法。

ATP生物发光技术是目前有望实现即时检测微生物的最快的方法，它的原理是萤火虫荧光素酶(Firefly Luciferase)以荧光素(D-Luciferin)、三磷酸腺苷(ATP)和O₂为底物，在Mg²⁺存在时，能将化学能转化为光能。反应式表示为：

ATP既是荧光素酶催化发光的必需底物，又是所有生物生命活动的能量来源，在荧光素酶催化的发光反应中，ATP在一定的浓度范围内，其浓度与发光强度呈线形关系。D’Eustachio和Levin的研究表明，各生长时期的细菌均有较恒定水平的ATP含量，一般范围是0.28×10^-10～8.9×10^-10μg，平均为3×10^-10μg。而微藻细胞ATP含量约是细菌的100倍。因此，提取细菌的ATP，利用生物发光法测出ATP的含量后，即可推算出样品中的含菌量，整个过程仅为几分钟。由于生物发光法无需培养过程，操作简便，灵敏度高，数分钟内可得到结果，它在微生物污染及生物量检测中的应用得到迅速发展，许多国家已将它作为环境卫生现场监督检测的有效手段，而国内尚处于起步阶段。然而ATP生物发光法的灵敏度要求样品中细菌浓度最低不少于10³cells/mL，但这种灵敏度有时达不到检测的要求；另外，ATP生物发光反应是酶反应，样品中的许多因素均会干扰反应，直接使用生物发光法进行微生物快速检测则不能有效地检出其中的含菌量，从而造成假阳性或假阴性。因此，ATP生物发光法虽然灵敏、快速，但上述不足之处使它的应用受到了很大的限制。

[发明内容]

本发明的目的在于提高目前ATP生物发光法的灵敏度，消除样品中干扰酶反应的物质对测定体系的影响，提供环境水体微生物快速检测方法及试剂，解决存在的干扰问题，显著提高检测的灵敏度和缩短检测所需的时间。

本发明所提供的环境水体微生物快速检测方法包括两部分，一是用微孔滤膜进行样品前处理，去除水中干扰物质，将微生物分类、富集；二是用细胞ATP释放剂Ec对样品进行处理，释放出样品中的微生物细胞ATP，然后进行发光检测。

本发明可大大缩短检测时间，15min内可完成细菌总数和微藻细胞数量的检测。

本发明的环境水体微生物快速检测方法具体操作方法：

(1)样品前处理

a.参照常规取样方法取水样100～1000mL(根据样品的洁净程度而定)，振摇使样品分散均匀，然后用经灭菌处理的20μm的微孔滤膜抽真空过滤样品，去除大于20μm的颗粒杂质，洁净的饮用水可省去此步骤；

b.水样再依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；

(2)微生物细胞ATP提取

a.分别取过滤样品后的8μm及0.22μm的微孔滤膜，置于50mL无菌烧杯中，各加入1mL无菌去离子水和1mL微生物细胞ATP释放剂Ec，振荡均匀，作用1～5min；

b.分别取1mL用pH7.8、浓度为25mmol/L的Tricine缓冲液配制的10^-6～10^-10mol/LATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；

c.用空白微孔滤膜做同样处理作为空白样。

(3)ATP生物发光测定

a.吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶-荧光素试剂，立刻摇匀，置于25℃生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

b.同时做10^-6～10^-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测。

(4)样品中ATP浓度的计算

根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系可以作一线性回归方程：Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]。

因此，根据样品的CPM值从回归方程可以计算样品中的ATP含量：

样品中ATP浓度(g/L)＝505×10^(A+BLg[CPM])

注：CPM值为1min发光脉冲计数值，505为ATP的分子量。

(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算：

每个细菌的ATP含量以平均数3×10^-10μg计，微藻细胞ATP含量约是细菌的100倍，即3×10^-8μg，因此：

本发明所提及过滤漏斗和微孔滤膜，前者可用一次性使用无菌制品或经灭菌处理达到无菌要求可反复使用的产品，后者一般为一次性使用无菌制品。

本发明所提及的微生物细胞ATP释放剂Ec含有：

1～30g/L TritonX-100

0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)

0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)

0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)

0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO₄)

制作过程为：每升无菌超纯水中加入1～30g TritonX-100、0.1～5.0g CTAB、0.1～3.0g DMSO、0.01～0.1g EDTA、0.01～0.1g MgSO₄，加热使其溶解，振匀即成，所有试剂采用分析纯。该试剂可在室温条件下1～5min内完成微生物细胞ATP的提取，简便、快速。

本发明所提及的样品处理解抑剂为内含葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物，具体制作过程为：取0.1～15.0g分析纯环糊精溶解于pH 7.8的Tricine缓冲液(内含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO₄、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL，用0.22μm滤膜过滤除菌后分装至5个灭菌的小瓶，于4℃冰箱储存备用。该解抑剂可以排除阳离子、阴离子和两性离子表面活性剂等物质对分析的干扰。

[具体实施方式]

实施例1：河水中细菌总数及微藻细胞数量的快速检测

(1)样品前处理

a.参照常规取样方法取河水样100mL，振摇使样品分散均匀，然后用经灭菌处理的20μm的微孔滤膜抽真空过滤样品，去除大于20μm的颗粒杂质；

(2)微生物细胞ATP提取

b.分别取1mL用pH7.8、浓度25mmol/L的Tricine缓冲液配制的2×10^-6～2×10^-10mol/L ATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；

c.将空白微孔滤膜做上述处理作为空白样；

(3)ATP生物发光测定

b.做2×10^-6～2×10^-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测。

C.1min发光脉冲计数结果见表1。

表1 样品和ATP标准溶液的发光脉冲计数CPM值

编号	发光脉冲计数CPM值
编号	发光脉冲计数CPM值	样品(8μm)	263985
样品(0.22μm)	183846	样品(8μm)	263985
样品(0.22μm)	183846	ATP标准溶液2×10^-6mol/L	1920531
ATP标准溶液2×10^-7mol/L	445764	ATP标准溶液2×10^-6mol/L	1920531
ATP标准溶液2×10^-7mol/L	445764	ATP标准溶液2×10^-8mol/L	29999
ATP标准溶液2×10^-9mol/L	14122	ATP标准溶液2×10^-8mol/L	29999
ATP标准溶液2×10^-9mol/L	14122	ATP标准溶液2×10^-10mol/L	799
CK	377	ATP标准溶液2×10^-10mol/L	799

(4)样品中ATP浓度的计算

根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系可以作一线性回归方程：Lg[ATP]＝-12.763+1.097Lg[CPM](R＝0.984)。

因此，根据样品的CPM值可以从回归方程计算样品中的ATP含量：

样品的ATP浓度(g/L)＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[CPM])}

样品经0.22μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[183846-377])}

＝5.18×10^-5(g/L)

样品经8μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[263985-377])}

＝7.71×10^-5(g/L)

(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算

= \frac{5.18 \times 10^{- 5}}{3 \times 10^{- 13} \times 100}

= {1.73 \times 10}^{6}

= \frac{7.71 \times 10^{- 5}}{3 \times 10^{- 11} \times 100}

= 2.57 \times 10^{4}

实施例2：储水池水细菌总数及微藻细胞数量的快速检测

(1)样品前处理

a.参照常规取样方法取储水池水样1000mL，振摇使样品分散均匀；

b.水样依次抽真空通过8μm及0.22μm的微孔滤膜，并分别用50mL无菌去离子水洗涤过滤漏斗和微孔滤膜；

2、微生物细胞ATP提取

b.分别取1mL用pH7.825mmol/L的Tricine缓冲液配制的2×10^-6～2×10^-10mol/LATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；

c.将空白微孔滤膜做同样处理作为空白样。

(3)ATP生物发光测定

b.同时做2×10^-6～2×10^-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测。；

c.1min发光脉冲计数结果见表2。

表2 样品和ATP标准溶液的发光脉冲计数CPM值

编号	发光脉冲计数CPM值
编号	发光脉冲计数CPM值	样品(8μm)	6742
样品(0.22μm)	7723	样品(8μm)	6742
样品(0.22μm)	7723	ATP标准溶液2×10^-6mol/L	1920531
ATP标准溶液2×10^-7mol/L	445764	ATP标准溶液2×10^-6mol/L	1920531
ATP标准溶液2×10^-7mol/L	445764	ATP标准溶液2×10^-8mol/L	29999
ATP标准溶液2×10^-9mol/L	14122	ATP标准溶液2×10^-8mol/L	29999
ATP标准溶液2×10^-9mol/L	14122	ATP标准溶液2×10^-10mol/L	799
CK	377	ATP标准溶液2×10^-10mol/L	799

(4)样品中ATP浓度的计算

根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系可以作线性回归方程：Lg[ATP]＝-12.763+1.097Lg[CPM](R＝0.984)。

因此根据样品的CPM值可以从回归方程计算样品中的ATP含量：

样品中ATP浓度(g/L)＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[CPM])}

样品经0.22μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[7723-377])}

＝1.52×10^-6(g/L)

样品经8μm滤膜截留的ATP浓度＝505×10^{(-12.763+1.097Lg[6742-377])}

＝1.30×10^-6(g/L)

(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算

= \frac{1.52 \times 10^{- 6}}{3 \times 10^{- 13} \times 1000}

= 5.07 \times 10^{3}

= \frac{1.30 \times 10^{- 6}}{3 \times 10^{- 11} \times 1000}

= 43

Claims

1、一种环境水体微生物快速检测方法，其特征在于：首先将水样依次经过不同孔径(由大到小)的微孔滤膜过滤后，取下滤膜进行ATP发光检测；同时进行ATP标准溶液和空白微孔滤膜的发光检测，根据ATP浓度与其发光脉冲计数CPM值的对数关系作线性回归方程：Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]；最后根据滤膜的CPM值推算样品的ATP浓度及水体微生物的含量。

2、权利要求1所述的检测方法，按下述步骤进行：

(1)样品前处理

(2)微生物细胞ATP提取

b.分别取1mL用pH7.8、浓度25mmol/L的Tricine缓冲液配制的10^-6～10^-10mol/L ATP标准溶液取代1mL无菌去离子水做同样处理作为标准样；

c.用空白微孔滤膜做同样处理作为空白样；

(3)ATP生物发光测定

a.吸取0.1mL样品ATP提取液于发光管中，加入适量解抑剂和25mmol/L Tricine缓冲液，使体积为0.9mL，再加入0.1mL荧光素酶—荧光素试剂，立刻摇匀，置于生物发光检测仪中进行发光脉冲计数；

b.同时做10^-6～10^-10mol/L ATP标准样和空白样的发光检测；

(4)样品中ATP浓度的计算

根据系列浓度的ATP标准溶液与其发光脉冲计数的对数关系作线性回归方程：Lg[ATP]＝A+BLg[CPM]

样品中ATP浓度(g/L)＝505×10^(A+BLg[CPM])

(5)样品中细菌总数和微藻细胞数量的计算：

3、权利要求2所述的检测方法，细胞ATP释放剂Ec含有：

1～30g/L TritonX-100

0.1～5.0g/L十六烷三甲基溴化铵(CTAB)

0.1～3.0g/L二甲亚砜(DMSO)

0.01～0.1g/L乙二胺四乙酸(EDTA)

0.01～0.1g/L硫酸镁(MgSO₄)

4、权利要求2所述的检测方法，解抑剂含有葡萄糖单元分别为6、7、8的环糊精等环状化合物。

5、权利要求4所述的检测方法，解抑剂的制作过程为：取0.1～15.0g环糊精溶解于pH7.8Tricine缓冲液(内含50mmol/L Tricine、10mmol/L MgSO₄、1mmol/L EDTA、1mmol/L DTT)中，使终体积为1000mL。