CN102565018B - 一种水质分析方法和装置 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种水质分析方法，包括以下步骤：A、加入待测样品；B、设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线；D、启动测量，在测量过程中，根据拟合线和生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。本发明还提供了一种水质分析装置。本发明具有无需特殊预处理、广泛适用简单、高效克服背景干扰等优点。
Description
技术领域
本发明涉及一种水质分析方法和装置，尤其是一种在不进行样品预处理时能够扣除背景干扰的水质分析方法和装置。
背景技术
微生物检测是环境或食品安全评估的重要内容，其中，细菌总数、大肠菌和致病微生物等作为国际公认的卫生检测指标，是判定环境或食品是否安全的重要科学依据。通过微生物检测可以正确评价环境或食品的微生物污染程度，为各项卫生管理工作提供科学依据，为相关疾病的针对性防治提供重要的科学指导，以确保人们的身体健康；同时，微生物检测对提高环境或食品质量、避免经济损失、保证出口等方面具有重要的意义。
传统的微生物检测方法为培养法，采用液体培养或膜过滤后固体培养的细菌扩增模式，在细菌浓度达到较高水平时进行形态观察或显微镜检；此类方法需要较长的培养时间，且步骤繁琐、工作量大，导致耗时较长，往往需要24-72小时甚至更久才能得到检测结果。目前，酶底物法已成为微生物检测的重要手段，此方法是利用微生物代谢产生的特异指示酶和相应发光底物水解反应后产生的光信号变化实现定性分析，再结合MPN计数法实现定量分析，可于18-24小时内获得检测结果，然而该方法的检测速度仍显滞后，检测结果也还不够准确。
为解决传统的酶底物法用时较长的问题，二十世纪初期，研究人员在自动化连续检测技术的基础上，利用酶底物反应信号与微生物浓度的关联性，结合阈值分析模式，展开了快速定性定量分析的研究。
如图1所示，该方法主要是根据微生物生长曲线，即微生物生长产生的信号与检测时间的关系曲线的特点，选择微生物指数增长期显著抬升段的酶底物反应的光信号绝对值或变化值作为阈值，并以此阈值作为检测终点的判断依据；然后依据微生物的检测信号和检测时间建立微生物浓度与检测时间的标准曲线，如图，2所示；最后结合待测微生物的检测时间和标准曲线可得待测微生物的浓度。该方法的检测时间由微生物的浓度决定，浓度越大，检测时间越短；与传统的微生物检测方法相比，可将检测时间缩短至4-18小时。
但是，在实际水样应用中，由于分析水样组成成分复杂，可能存在大量游离酶以及非待测微生物源酶，会随着检测任务的启动快速催化底物分解反应，持续产生背景信号，表现为检测信号在微生物生长延迟期的快速抬升，导致检测终点判定前即达到信号饱和，如图3所示，从而无法实现检测时间的有效分析。此外，由于不同样品可能存在不同的背景信号抬升幅度，导致阈值参数需要针对不同样品予以调整，这对操作人员的技术要求较高，并且需要经常改变阈值参数设置，为仪器的应用推广带来了许多不便。
针对这一问题，实验室常采用水样过滤处理措施分离待测微生物和游离酶，并对滤膜一侧截留的微生物进行反冲洗收集，再在检测容器内加入培养基和反应底物进行酶底物检测分析。但由于上述方式存在微生物残留、操作繁琐、滤膜使用寿命短和难以实现自动化等问题，在在线式仪表中难以有效应用。故此，目前存在的同类检测设备还缺乏有效的在线式背景酶干扰克服措施，同时更缺乏针对不同背景样品的阈值参数稳定设置方法。
发明内容
为了解决现有技术中的上述不足，本发明提供了一种无需特殊预处理的、广泛适用的简单、高效的水质分析方法和装置。
为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种水质分析方法，包括以下步骤：
A、加入待测样品；
B、设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；
C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线；
D、启动测量，在测量过程中，根据拟合线和生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。
作为优选，所述目标曲线经过拟合线和生长曲线相减或相除得到。
作为优选，所述预判期和延迟期的时间起算点相同。
进一步，在步骤B中，根据延迟期及设定的预判期选择底物添加方式并添加相应目标物，其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基；
在步骤D中，若步骤B中为方式一，则需加入培养基后再启动测量；若步骤B中为方式二，则直接启动测量。
进一步，所述预判期的时间与延迟期的比值小于M时，底物添加方式为方式一，反之为方式二。
作为优选，M小于1/3。
进一步，在步骤C中，还包括增益调整步骤，所述增益调整步骤为若预判期内的信号超过仪器量程上限值，则进行增益调整后得到预判期内信号的拟合线。
作为优选，所述增益调整步骤为将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
本发明还提供了一种水质分析装置，包括检测单元和分析单元，其特点是：
所述分析单元包括预判模块、拟合模块和背景扣除模块；
所述预判模块用于设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；
所述拟合模块对检测单元测得的添加特异底物的待测样品在预判期内的信号进行拟合，得到拟合线；
所述背景扣除模块用于在测量过程中，根据拟合线和检测单元测得的待测样品的生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。
作为优选，所述背景扣除模块将拟合线和生长曲线相减或相除后得到目标曲线。
作为优选，所述预判期和延迟期的时间起算点相同。
进一步，所述预判模块还根据延迟期及设定的预判期提示底物添加方式，并在拟合模块得到拟合线后、启动测量前提示是否需要加入培养基；其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基。
进一步，所述预判期与延迟期的比值小于M时，获得拟合曲线之前，所述预判模块指示底物添加方式为方式一，获得拟合曲线之后，指示添加培养基后再进行测量；
反之获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式二，获得拟合曲线之后，指示直接进行测量。
作为优选，M小于1/3。
进一步，所述分析单元还包括增益模块，所述增益模块用于在检测单元测得的预判期内的信号超过仪器量程上限值时，将预判期内的信号进行增益调整；
所述拟合模块根据增益调整后的信号得到拟合线。
作为优选，所述增益模块将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
进一步，所述检测单元包括蠕动泵和多通道选向阀，所述待测样品、底物和用于装待测样品的测量池分别与所述多通道选向阀连通。
本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
1、相比传统的培养检测方法，增加水样预分析过程。
在短时间内分析水样背景干扰信号，调整量程，即能实现高背景样品的检测分析，又可避免对水样进行特殊前处理，使操作简单高效。
2、结合信号增益调节，实现背景扣除方法，使延迟期信号归于平稳，并可在原测量区间予以完整显示。
对于分析同一样品不同目标菌的情况，将拟合曲线与生长曲线做差，得到基于零线的阈值转换，使得阈值参数设定统一化；对于不同样品，同样得到基于零线的阈值转换，也使得阈值参数设定统一化；对于不同样品及相同样品不同目标菌的繁琐参数设置步骤，降低了对操作人员的技术要求，增强分析准确性和比较分析能力。
3、根据待测目标微生物的特点，可以采用特异底物单独添加方式。避免传统方法直接加入含底物培养基分析时，可能由于微生物生长而影响背景趋势预判断。
4、针对不同目标微生物，可以通过切换不同底物来实现酶底物检测分析，无需更换营养培养基，提高多种不同样品的检测效率。
附图说明
图1为背景技术中微生物的生长曲线；
图2为背景技术中微生物的标准曲线；
图3为高背景样品的微生物响应信号曲线；
图4为微生物生长曲线；
图5为实施例2中粪大肠菌群各曲线示意图。
具体实施方式
实施例1
一种水质分析装置，包括检测单元和分析单元，所述检测单元包括采样模块和检测模块，所述分析单元包括预判模块、拟合模块和背景扣除模块；
1、检测单元
所述检测单元用于采集待测样品并将检测到的待测样品和培养基的混合液的反应信号转换为电信号，并传送到分析单元，所述电信号与检测时间相对应；
作为优选，所述采样模块包括蠕动泵、多通道选向阀、检测模块，所述待测样品、底物、培养基和用于装待测样品的测量池分别与所述多通道选向阀的通道连通，所述检测模块检测待测样品信号并将其出递给分析单元。
所述底物可与微生物特异指示物反应并直接或者间接地发出可测量信号；
所述培养基适用于待测样品中的待测菌群。
2、分析单元
2.1、预判模块
请参阅图4，微生物生长周期内生长曲线对应区间分别为：I延迟期，II对数期，III稳定期，IV衰亡期；
在延迟期I内，目标菌未增殖，不会大量分泌指示酶，故，在此段时间对待测样品进行检测，信号的抬升是样品中游离酶分解造成的。在该段时间内，样品中的游离酶的量相对固定，在荧光底物充足、催化温度恒定的条件下，酶促分解底物速率会保持恒定。所以此段时间内的信号变化可近似认为是线性的，在延迟期内可以充分得到背景信号的信息。
若不加培养基则细菌不会进入生长周期，即没有开始延迟期。
所述预判模块用于设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内。预判期的时间起算点可以与延迟期时间起算点相同，也可以不同。
作为优选，预判期与延迟期时间起算点相同。
进一步，所述预判模块还根据延迟期及设定的预判期提示底物添加方式，并在拟合模块得到拟合线后、启动测量前提示是否需要加入培养基；其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基。
进一步，所述预判期与延迟期的比值小于M时，获得拟合曲线之前，所述预判模块指示底物添加方式为方式一，获得拟合曲线之后，指示添加培养基后再进行测量；
反之获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式一，获得拟合曲线之后，指示直接进行测量。
作为优选，M小于1/3。
根据待测目标微生物的特点，采用不同系的底物添加方式，其中包括特异底物单独添加方式。这就避免了传统方法直接加入含底物培养基分析时，可能由于微生物生长而影响背景趋势的预判断。
针对不同目标菌，可以通过切换不同底物来实现酶底物检测分析，无需更换营养培养基，提高多种不同样品的检测效率。
2.2、拟合模块
所述拟合模块对检测单元测得的添加特异底物的待测样品在预判期内的信号进行拟合，得到拟合线；
由于待测样品中的游离酶对检测信号有贡献，故在检测过程中，若待测样品中的菌量过大时，会使得检测信号超出仪器量程上限。
进一步，所述分析单元还包括增益模块，所述增益模块用于在检测单元测得的预判期内的信号超过仪器量程上限值时，将预判期内的信号进行增益调整；所述拟合模块根据增益调整后的信号得到拟合线。
经过增益调整之后，仪器量程范围内均可显示检测信号。
作为优选，所述增益模块将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
2.3、背景扣除模块
所述背景扣除模块用于在测量过程中，根据拟合线和检测单元测得的待测样品的生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。
作为优选，所述背景扣除模块将拟合线和生长曲线相减或相除得到目标曲线。
目标曲线的获得，可以将生长曲线变化特征由接近饱和状态拉低至仪器可显示范围内，同时仍保留生长曲线变化特征。
这种操作方式，对于分析同一样品不同目标菌的情况，将拟合曲线与生长曲线做差，得到基于零线的阈值转换，使得阈值参数设定统一化；对于不同样品，同样得到基于零线的阈值转换，也使得阈值参数设定统一化；对于不同样品及相同样品不同目标菌的繁琐参数设置步骤，降低了对操作人员的技术要求，增强分析准确性和比较分析能力。
本实施例还提供了一种水质分析方法，包括以下步骤：
A、向样品池中加入待测样品；
B、设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；
C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线；
D、启动测量，在测量过程中，根据拟合线和生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。
作为优选，所述目标曲线经过拟合线和生长曲线相减或相除得到。
结合设定的阈值检出时间，通过事先建立的标准分析模型，计算目标菌的初始数量。标准模型的建立为本领域的现有技术，在此不再赘述。
作为优选，所述预判期与延迟期的时间起算点相同。
进一步，所述预判模块还根据延迟期及设定的预判期提示底物添加方式，并在拟合模块得到拟合线后、启动测量前提示是否需要加入培养基；其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基。
进一步，所述预判期与延迟期的比值小于M时，获得拟合曲线之前，所述预判模块指示底物添加方式为方式一，获得拟合曲线之后，指示添加培养基后再进行测量；
反之获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式二，获得拟合曲线之后，指示直接进行测量。
作为优选，M小于1/3。
进一步，在步骤C中，还包括增益调整步骤，所述增益调整为若预判期内的信号超过仪器量程上限值，则将预判期内的信号调整增益后得到拟合线。
作为优选，所述增益调整步骤为将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
相比传统的培养检测，引入预判期内样品的信号拟合，并结合拟合信号调整量程，扣除背景干扰，能实现高背景样品的检测分析，又可避免对水样进行特殊前处理，使操作简单高效。
实施例2
一种水质分析装置，包括检测单元和分析单元，所述检测单元包括采样模块和检测模块，所述分析单元包括预判模块、拟合模块和背景扣除模块；
待测样品为含有目标菌为粪大肠菌群的水样；特异底物为4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷酸(MUGal)溶液；
MUGal与粪大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)。
所述采样模块包括蠕动泵和多通道选向阀，所述待测样品、底物和用于装待测样品的测量池分别与所述多通道选向阀连通。
因粪大肠菌群延迟期通常在2小时左右，本实施例中预判期在延迟期内，且预判期与延迟期的时间起算点相同，预判期与延迟期比值M设定为1/5，则本实施例的预判模块设定的目标菌对应的预判期对应的时间为30min，其与延迟期时间的比值为1/4，大于M，则，在获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式一，仅添加特异底物，获得拟合曲线之后，还要提示加入培养基再进行测量。
检测模块用于检测样品的荧光信号，并将其传递给分析单元。检测模块数据采集频率为每分钟一次。
拟合模块对检测模块检测的待测样品加入底物后产生的荧光信号获得的测量值进行拟合，获得拟合曲线斜率值k。
通常100mL体积水样的单个粪大肠菌群检出时间为14小时左右，仪器荧光信号采集范围在0-35000unit，则预判断标准斜率值K＝量程上限/延迟期时间≈42unit/分钟；
若实际水样预判期背景变化趋势曲线的斜率值即拟合曲线的斜率值k小于K，则加入无底物的培养基后开启测量；若k大于等于K，则调整信号增益倍数，调整比例以K/k值为准。调整增益后，加入无底物的培养基并开启测量。
背景扣除模块将拟合线和生长曲线相减，结合已设定的阈值检出时间，通过定量模型计算粪大肠菌群的初始数量。
本实施例还提供了一种水质分析方法，包括以下步骤：
A、采用本实施例的水质分析装置；
A1、建立定量分析模型：
通过采样模块将含有粪大肠菌群的标准样品输送至样品池中，加入特异底物4-甲基伞形酮-β-D半乳糖苷酸(MUGal)溶液和培养基溶液；
MUGal与粪大肠菌群生长产生的代谢指示物β-D-半乳糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)；检测样品荧光信号，结合阈值获得样品检测终止时间，得到初始细菌浓度对检测终止时间的定量分析模型；定量分析模型所对应的函数表达式T＝-94.47lgC+857.62
A2、采样模块将含有粪大肠菌群的待测样品送至样品池中；
B、采用方式一先加入特异底物MUGal溶液，MUGal与水样中存在的游离β-D-半乳糖苷酶发生反应，检测单元以每分钟采集数据一次的频率连续监测30分钟作为预判期；
C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线，请参阅图5，拟合线a为Y＝13336.15+67.13X，线性系数为0.999；获得的拟合线的斜率值k为67.13，K为42unit/分钟，则k＞与K，需要进行增益调整；
D、需加入培养基后启动测量：将拟合线a和生长曲线b相减后得到目标曲线c，结合已设定的阈值检出时间得出粪大肠菌群初始数量。
实施例3
一种水质分析装置，与实施例2中的水质分析装置不同的是：
1、待测样品为含有目标菌为大肠杆菌的水样；特异底物4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷酸(MUG)溶液；
MUG与大肠杆菌生长产生的代谢指示物β-D-葡糖醛酸糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)。
2、因大肠杆菌延迟期通常在2小时左右，本实施例中预判期与延迟期时间比M设定为1/3，则本实施例的预判模块设定的目标菌对应的预判时间为10min，其与延迟期的比值为1/12，小于M，则，在获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式二，添加特异底物与培养基，获得拟合曲线之后，直接进行测量。
3、背景扣除模块将拟合线和生长曲线相除，结合已设定的阈值检出时间，通过定量模型计算粪大肠菌群的初始数量。
本实施例还提供了一种水质分析方法，包括以下步骤：
A、采用本实施例的水质分析装置；
A1、建立定量分析模型：
通过采样模块将含有大肠杆菌的标准样品输送至样品池中，加入特异底物4-甲基伞形酮-β-D葡萄糖苷酸(MUG)溶液和培养基溶液；
MUG与大肠杆菌生长产生的代谢指示物β-D-葡糖醛酸糖苷酶发生特异性反应，产生荧光信号(激发波长为365nm，发射波长为450nm)；检测样品荧光信号，结合阈值获得样品检测终止时间，得到初始细菌浓度对检测终止时间的定量分析模型；所述分析模型为T＝-100.90lgC+1040.75
A2、采样模块将含有大肠杆菌的待测样品送至样品池中；
B、采用方式二加入特异底物MUG溶液和培养基，MUG与样品中存在的游离β-D-葡糖醛酸糖苷酶发生反应，检测单元以每分钟采集数据一次的频率连续监测10分钟作为预判期；
C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线，拟合线a为Y＝10276.75+27.33X，线性系数为0.999；获得拟合线的斜率值k为27.33，K为42unit/分钟，则k＜与K，不需要增益调整；
D、启动测量：将拟合线和生长曲线相除后得到目标曲线，结合已设定的阈值检出时间得出大肠杆菌初始数量。
上述实施方式不应理解为对本发明保护范围的限制。本发明的关键是：通过测量预判时间内样品信号进行样品背景的扣除，使阈值参数设定统一化。在不脱离本发明精神的情况下，对本发明做出的任何形式的改变均应落入本发明的保护范围之内。
Claims (15)
1.一种水质分析方法，包括以下步骤：
A、加入待测样品；
B、设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；根据延迟期及设定的预判期选择底物添加方式并添加相应目标物，其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基；
C、对预判期内采集的信号进行拟合，得到拟合线；
D、若步骤B中为方式一，则需加入培养基后再启动测量；若步骤B中为方式二，则直接启动测量；
启动测量，在测量过程中，根据拟合线和生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阂值检出时间，得出目标菌初始量。
2.根据权利要求1所述的水质分析方法，其特征在于：所述目标曲线经过拟合线和生长曲线相减或相除得到。
3.根据权利要求1所述的水质分析方法，其特征在于：所述预判期与延迟期的时间起算点相同。
4.根据权利要求1所述的水质分析方法，其特征在于：所述预判期的时间与延迟期的比值小于M时，底物添加方式为方式一，反之为方式二。
5.根据权利要求4所述的水质分析方法，其特征在于：M小于1/3。
6.根据权利要求1～5任一所述的水质分析方法，其特征在于：在步骤C中，还包括增益调整步骤，所述增益调整步骤为若预判期内的信号超过仪器量程上限值，则将预判期内的信号进行增益调整后得到拟合线。
7.根据权利要求6所述的水质分析方法，其特征在于：所述增益调整步骤为将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
8.一种水质分析装置，包括检测单元和分析单元，其特征在于：
所述分析单元包括预判模块、拟合模块和背景扣除模块；
所述预判模块用于设定目标菌对应的预判期，所述预判期在延迟期内；
所述拟合模块对检测单元测得的添加特异底物的待测样品在预判期内的信号进行拟合，得到拟合线；
所述背景扣除模块用于在测量过程中，根据拟合线和检测单元测得的待测样品的生长曲线得到目标曲线，目标曲线结合已设定的阈值检出时间，得出目标菌初始量。
9.根据权利要求8所述的水质分析装置，其特征在于：所述背景扣除模块将拟合线和生长曲线相减或相除后得到目标曲线。
10.根据权利要求8所述的水质分析装置，其特征在于：所述预判模块还根据延迟期及设定的预判期提示底物添加方式，并在拟合模块得到拟合线后、启动测量前提示是否需要加入培养基；其中，方式一特异底物，方式二含特异底物的培养基。
11.根据权利要求10所述的水质分析装置，其特征在于：
所述预判期与延迟期的比值小于M时，获得拟合曲线之前，所述预判模块指示底物添加方式为方式一，获得拟合曲线之后，指示添加培养基后再进行测量；
反之获得拟合曲线之前，所述预判模块提示底物添加方式为方式二，获得拟合曲线之后，指示直接进行测量。
12.根据权利要求10所述的水质分析装置，其特征在于：M小于1/3。
13.根据权利要求8所述的水质分析装置，其特征在于：
所述分析单元还包括增益模块，所述增益模块用于在检测单元测得的预判期内的信号超过仪器量程上限值时，将预判期内的信号进行增益调整；
所述拟合模块根据增益调整后的信号得到拟合线。
14.根据权利要求13所述的水质分析装置，其特征在于：所述增益模块将拟合线的斜率调整至目标菌标准斜率值以下，所述目标菌标准斜率值是仪器量程上限值与目标菌延迟期时间比值。
15.根据权利要求8～14任一所述的水质分析装置，其特征在于：所述检测单元包括蠕动泵和多通道选向阀，所述待测样品、底物和用于装待测样品的测量池分别与所述多通道选向阀连通。
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2011
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