CN111041063A - 一种基于atp快速评价饮用水中微生物稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，包括：制作待测管网水样的微生物ATP含量与异养菌平板计数、异养菌平板计数与菌落总数的标准曲线；根据饮用水中菌落总数的限值计算计算微生物ATP含量的限值，作为微生物ATP含量的动态限值；采集测定待测管网中待测采样点不同采样时间的水样，检测水样的微生物ATP含量；若符合情况(a)或/和(b)，则该待测采样点的微生物稳定性差，否则该待测采样点的微生物稳定性好；(a)待测采样点的水样微生物ATP含量超过所述的动态限值；(b)同一待测采样点的不同采样时间采集的水样微生物ATP含量变化量超过预设阈值。本发明的检测时间只需几分钟，成本较低，结果准确可靠。

Description

一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法

技术领域

本发明涉及水质检测与保护技术领域，尤其涉及一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法。

背景技术

传统的评价饮用水水质微生物稳定性方法主要是基于测定水中限制微生物生长的营养物质浓度，判定饮用水中可生物降解有机物支持异养菌生长的潜力。除营养物质浓度外，管网中微生物群落结构、微生物活性、生存状态也是评价水质微生物稳定性的重点。配水系统中微生物稳定性差会造成饮用水水质容易受到污染，如条件致病菌的再生长，感官不佳(引起异嗅异味、色度超标)，“黄水”、“红水”等卫生安全问题。

目前用于饮用水生物稳定性的评价方法主要有基于培养的可生物同化有机碳(AOC)、可生物降解有机碳(BDOC)、平板计数等。我国《生活饮用水卫生标准》(GB5749)中用于评价微生物指标是否合格主要还是根据群落总数来判定。这些基于培养的评价方法其测定步骤繁琐、检测所需时间长，具有滞后性，并且很大部分的微生物不能培养，近年来很多学者质疑基于培养法作为评价微生物稳定性的可靠性。因此亟需快速、准确的饮用水微生物评价方法。近年来有研究基于三磷酸腺苷(ATP)测定饮用水中微生物活性来快速判定水中微生物量变化。

三磷酸腺苷(ATP)是活细胞的基本能量单位，水中ATP浓度可以准确反应水中的微生物含量。在水样中加入细菌裂解液将细菌内的ATP释放出来，然后通过测定ATP变化，可以直接反应出管网中微生物活性的变化及微生物稳定性问题。目前研究普遍接受ATP作为量化细菌量的方法，但是没有统一的方法将其作为衡量微生物稳定性的标准。另外，不同的管网，微生物群落结构存在差异，优势菌也不同，并且单细菌产的ATP也存在较大差异，需要对特定区域、特定管网提出动态限值作为评价该地区的微生物稳定性。

发明内容

本发明提供了一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，该方法操作简单，检测时间只需几分钟，成本较低，结果准确可靠。

具体技术方案如下：

一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，包括以下步骤：

(1)取待测管网的水样，检测水样中微生物ATP含量、异养菌平板计数和菌落总数，分别通过直线线性回归拟合得到待测管网水样的微生物ATP含量与异养菌平板计数、异养菌平板计数与菌落总数的标准曲线；

(2)根据饮用水中菌落总数的限值计算异养菌平板计数的限值，再根据异养菌平板计数的限值计算微生物ATP含量的限值，作为微生物ATP含量的动态限值；

(3)采集测定待测管网中待测采样点不同采样时间的水样，检测水样的微生物ATP含量；若符合情况(a)或/和(b)，则该待测采样点的微生物稳定性差，否则该待测采样点的微生物稳定性好；

(a)待测采样点的水样微生物ATP含量超过所述的动态限值；

(b)同一待测采样点的不同采样时间采集的水样微生物ATP含量变化量超过预设阈值。

本发明根据饮用水中菌落总数、异养菌平板计数、微生物ATP含量的关系，通过菌落总数的限值计算得到水样中微生物ATP含量的限值，再通过待测取样点水样的微生物ATP含量及其变化可快速判别该待测取样点的微生物量的变化，从而可快速评价该待测取样点的微生物稳定性。检测过程方便快捷，准确可靠。该方法可用于同一个管网微生物稳定性评价，并且可通过相应的系数修正、调整用于其他城市管网微生物稳定性评价。

优选的，步骤(1)中，采用M5酶标仪(SynergyMx M5；Molecular Devices，USA)和BacTiter-GloTM(G8230，Promega)试剂盒检测水样的微生物ATP含量；进一步的，包括以下步骤：

(1-i)以无菌水稀释的浓度呈梯度的ATP溶液为标准溶液，检测标准溶液的生物发光强度，绘制ATP含量-生物发光强度标准曲线；

(1-ii)检测待测水样、无菌滤膜过滤后的待测水样的生物发光强度，通过ATP含量-生物发光强度标准曲线计算待测水样、无菌滤膜过滤后的待测水样的ATP含量；

(1-iii)待测水样的ATP含量与无菌滤膜过滤后的待测水样的ATP含量之间的差值，即为待测水样的微生物ATP含量。

优选的，步骤(1)中，异养菌平板计数的检测方法为：将水样用无菌水稀释成浓度呈梯度分布的菌液，将菌液均匀涂布在培养基上，25℃恒温培养7天后计数；进一步的，异养菌平板计数有效值为每个平板30～300CFU。

优选的，步骤(1)中，根据微生物指标的标准检验方法检测水样中的菌落总数；进一步的，所述的标准检验方法为生活饮用水检验标准GBT5750-2006中微生物指标的检验方法。

优选的，步骤(1)中，异养菌平板计数与菌落总数的线性关系为y＝0.1168x-72.39，R²＝0.8552；y为菌落总数，单位为CFU/mL；x为异养菌平板计数，单位为CFU/mL。

优选的，步骤(1)中，异养菌平板计数与微生物ATP含量的线性关系为y＝0.0037x+2.3138，R²＝0.7609；y为ATP含量，单位为ng/L；x为异养菌平板计数，含量为CFU/mL。

优选的，步骤(2)中，根据《生活饮用水卫生标准》(GB5749)，饮用水中菌落总数的限值为100CFU/mL，计算得到微生物ATP含量的动态限值为7.76ng/L。

优选的，步骤(3)中，所述的预设阈值为±20％。

根据大量实际管网中微生物量的测定及文献报道的生物量变化量确定出，当生物量变化量超过±20％时，该管网中微生物稳定性较差。

优选的，步骤(3)中，生物量变化量的计算公式为：

生物量变化量＝(ATP_i-ATP₀)/ATP₀；

其中：ATP_i为第i次取样水样的微生物ATP含量，ATP₀为该取样点的微生物ATP含量平均值。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明根据《生活饮用水卫生标准》(GB5749)的水样菌落总数的限值100CFU/mL，通过水样异养菌平板计数与菌落总数、微生物ATP含量与异养菌平板计数的关系，提出水样微生物ATP含量的动态限值，通过水样微生物ATP含量的变化可快速判定水样中微生物量的变化从而快速评价其微生物稳定性。本发明检测过程方便快捷，准确可靠。该方法可用于同一个管网微生物稳定性评价，并且可通过相应的系数修正、调整用于其他城市管网微生物稳定性评价。

附图说明

图1为本发明中ATP含量和发光强度的标准曲线图；

图2为本发明中实施例1某J市管网HPC与菌落总数的关系曲线图；

图3为本发明中实施例1某J市管网ATP含量与HPC的关系曲线图；

图4为本发明中实施例2某J市管网采样点编号；

图5为本发明中实施例2某J市管网中两次不同采样时间微生物稳定性评价情况；

图6为本发明中实施例3中某J市管网中两个监测点不同时间下微生物稳定性评价情况。

具体实施方式

ATP含量标准曲线的建立：

采用M5酶标仪和BacTiter-GloTM通过生物发光法测定的ATP浓度的标准曲线为Y＝3.298X+14.93，R²＝0.9998，ATP浓度的检出限为0.5ng/L。

以下实施例中，ATP的检测采用M5酶标仪(SynergyMx M5；Molecular Devices，USA)和BacTiter-GloTM(G8230，Promega)试剂盒。

本说明中如无特殊说明，测定ATP时采用的M5酶标仪，通过化学发光测定光信号。样品与试剂的体积比为100μL：50μL，反应温度设为40℃，反应时间1min。具体操作如下：

(1)绘制ATP标准曲线。取1mL用无菌水稀释的不同浓度梯度(10-3～10nM)的ATP标准溶液和50μL试剂盒混合液，在40℃下加热1min；取100μL ATP标准溶液加入50μL试剂盒混合液，在40℃控温反应20s后立即测化学发光信号。所有的检测都重复3次取平均值。以ATP浓度为横坐标，生物发光强度为纵坐标，绘制ATP标准曲线。

(2)样品ATP测定。取1mL水样(测总ATP)和1mL用0.1μm无菌滤膜过滤之后的水样(测胞外ATP)代替上述ATP标准溶液重复以上步骤，测定发光强度，换算成总ATP和胞外ATP浓度，两者之差即为活细菌ATP。

样品的异养菌平板计数(HPC)和菌落总数测定分别如下：

异养菌平板计数：将样品用无菌水稀释成以10倍为梯度的菌液，取50μL菌液于R2A琼脂培养基上，用玻璃涂布棒涂布均匀，经过25℃恒温培养7天后计数。所有样品测定都重复3次取平均值，异养菌平板计数有效值为每个平板30～300CFU。

菌落总数：根据生活饮用水标准检验方法(GBT5750-2006)中微生物指标检测方法。

由于不同管网，微生物的多样性会有所差异，不同细菌的ATP产量也不相同，需取若干个与待测水样处于同一管网的测试水样，测量该测试水样中的ATP浓度、HPC及菌落总数。

生物量变化量的确定：

生物量变化量的计算公式为：

生物量变化量＝(ATP_i-ATP₀)/ATP₀，

其中：ATP_i为第i次取样样品的ATP值，ATP₀为该取样点的ATP浓度平均值。

实施案例1

取某J市管网不同点水样ATP、HPC、菌落总数的检测：

用灭菌瓶采集管网水，用一次性的灭菌滤头过滤水样测胞外ATP含量，水样不过滤直接测总ATP含量，两者之差即为水样中活菌的ATP含量。

通过平板计数测定对应水样的HPC和菌落总数，分别建立水样HPC与菌落总数、水样HPC与活菌ATP含量的线性关系，分别如图2、3所示。

如图2所示，HPC与菌落总数的线性关系为y＝0.1168x-72.39，R²＝0.8552；y为菌落总数(CFU/mL)，x为HPC(CFU/mL)。二者线性相关性较好，说明该地区管网中异养菌和菌落总数存在某种线性关系。

《生活饮用水卫生标准》(GB5749)中规定饮用水中菌落总数的限值为100CFU/mL，根据HPC与菌落总数的线性关系可以计算出水样中HPC超过1476CFU/mL时生物安全性较差。

如图3所示，HPC与ATP含量的线性关系为y＝0.0037x+2.3138，R²＝0.7609；y为ATP含量(ng/L)，x为HPC(CFU/mL)。二者线性相关性较好，通过HPC的限值1476CFU/mL可以计算出水样中ATP含量超过7.76ng/L时微生物稳定性安全性较差，其值可视为该管网ATP的动态限值。

实施案例2

取某J市管网其他不同点水样(管网点编号如图4所示)，比较两次不同采样时间的水样ATP含量，结果如图5所示。

(1)编号为32、43的采样点的两次不同采样时间的ATP含量均大于7ng/L，且两次不同采样时间的ATP含量变化较大，多为大于动态限值。这两个采样点位于管网末端，水中余氯都小于0.05mg/L，存在水质恶化风险，水中异养菌数(HPC)超过200CFU/mL，生物量较大，且变化较大，判定该点生物稳定性较差。

(2)编号为50、53、58、59、60的采样点两次不同采样时间的ATP含量虽然都低于动态限值7.76ng/L，但不同采样时间生物量变化较大，ATP含量的变化量分别为40％、22％、38％、27％、58％，判定这些采样点微生物稳定性也较差。这五个采样点位于管网末端，部分采样点余氯虽然大于0.1mg/L，但其生物量变化较大，采样点58的异养菌数(HPC)甚至高达1275CFU/mL。

(3)编号为2的采样点两次不同采样时间的ATP含量也低于动态限值7.76ng/L，但两次采样的生物量变化较大(26％)，该点位于靠近水厂附近，正常情况下余氯大于0.5mg/L，第二次采样时，余氯低于0.05mg/L，浊度大于1NTU，存在水质异常，且生物量较大(215CFU/mL)，判定其生物稳定性较差。

综上，当管网中同一个采样点不同时间点的ATP变化量超过20％，或ATP值超过动态限值，生物稳定性较差。

可见，针对同一管网的不同采样点，只要水样满足ATP含量的检测限，不需要通过培养的方法去测定水样菌落总数，通过水样的ATP值就能判定其微生物稳定性。根据该地区管网所建立的ATP与HPC的关系以及HPC与菌落总数的关系，通过测定ATP值以及其变化情况可实现微生物稳定性快速判定，并且可以对突发水质异常快速评价。

实施案例3

取某J市管网两个监测点不同时间的水样，评价其各自微生物稳定性问题，结果如图6所示，监测点1的ATP平均值为2.57ng/L，虽然其ATP值低于动态限值7.7ng/L，但其变化量为55％，尤其在8h至14h时ATP明显减少，而在44h至68h又明显增加，判定其也为微生物不稳定性。而监测点2的ATP平均值为1.3ng/L，且变化量为12％，判定其为微生物稳定性较好。这与实际情况相同，说明本发明的快速评价方法准确有效。

以上所述的实施例对本发明的技术方案和有益效果进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充和等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)取待测管网的水样，检测水样中微生物ATP含量、异养菌平板计数和菌落总数，分别通过直线线性回归拟合得到待测管网水样的微生物ATP含量与异养菌平板计数、异养菌平板计数与菌落总数的标准曲线；

(2)根据菌落总数的限值计算异养菌平板计数的限值，再根据异养菌平板计数的限值计算微生物ATP含量的限值，作为微生物ATP含量的动态限值；

(3)采集测定待测管网中待测采样点不同采样时间的水样，检测水样的微生物ATP含量；若符合情况(a)或/和(b)，则该待测采样点的微生物稳定性差，否则该待测采样点的微生物稳定性好；

(a)待测采样点的水样微生物ATP含量超过所述的动态限值；

(b)同一待测采样点的不同采样时间采集的水样微生物ATP含量变化量超过预设阈值。

2.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)中，采用M5酶标仪和BacTiter-GloTM试剂盒检测水样的微生物ATP含量。

3.根据权利要求2所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，微生物ATP含量的检测包括以下步骤：

(1-i)以无菌水稀释的浓度呈梯度的ATP溶液为标准溶液，检测标准溶液的生物发光强度，绘制ATP含量-生物发光强度标准曲线；

(1-ii)检测待测水样、无菌滤膜过滤后的待测水样的生物发光强度，通过ATP含量-生物发光强度标准曲线计算待测水样、无菌滤膜过滤后的待测水样的ATP含量；

(1-iii)待测水样的ATP含量与无菌滤膜过滤后的待测水样的ATP含量之间的差值，即为待测水样的微生物ATP含量。

4.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)中，异养菌平板计数与菌落总数的线性关系为y＝0.1168x-72.39，R²＝0.8552；y为菌落总数，单位为CFU/mL；x为异养菌平板计数，单位为CFU/mL。

5.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(1)中，异养菌平板计数与微生物ATP含量的线性关系为y＝0.0037x+2.3138，R²＝0.7609；y为ATP含量，单位为ng/L；x为异养菌平板计数，含量为CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(2)中，根据《生活饮用水卫生标准》，饮用水中菌落总数的限值为100CFU/mL，计算得到微生物ATP含量的动态限值为7.76ng/L。

7.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的预设阈值为±20％。

8.根据权利要求1所述的基于ATP快速评价饮用水中微生物稳定性的方法，其特征在于，步骤(3)中，生物量变化量的计算公式为：

生物量变化量＝(ATP_i-ATP₀)/ATP₀；

其中：ATP_i为第i次取样水样的微生物ATP含量，ATP₀为该取样点的微生物ATP含量平均值。

Images