CN103336001B - 一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法 - Google Patents

Abstract

一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法,属于市政工程的给排水监测领域。本发明结合利用TOC化学分析快速简便的特点以及细菌生长对成分复杂的低浓度有机碳浓度变化敏感的生物特性，同时利用在生物稳定性一定高的水样中，异养菌接种初期阶段生长波动剧烈的特点，建立水样梯度稀释系列的方法，绘制出在短时间内不同时间阶段比增长速度μ与相应稀释梯度TOC浓度的曲线，通过不同时间阶段μ值随TOC浓度变化趋势的对比，找出比增长速度μ与TOC浓度变化趋势随时间和浓度变化最剧烈的曲线段，获得水样有机碳与标准溶液有机碳的近似比例关系，完成对待测饮用水水质生物稳定性的评价。本发明可应用于给水处理和饮用水管网水质生物稳定性分析。

Description

一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法

技术领域

本发明评价方法可应用于给水处理和饮用水管网水质生物稳定性分析，属于市政工程的给排水监测领域。

背景技术

饮用水的生物稳定性是指饮用水中可生物降解有机物支持异养菌生长的潜力，即当营养物质成为异养细菌生长的限制因素时，水中的有机营养物质支持细菌生长的最大可能性，它可以用与其等价的限制微生物生长的营养物质的浓度进行表示。饮用水配水系统中细菌再生问题带来的危害主要有管网水质下降，管材腐蚀增加和饮用水卫生安全威胁等三个方面，当出厂水中含有一定量的有机物，水中生物生长导致色度、浊度增加，产生不好气味，随机附着于管壁的细菌将会利用水中营养基质生长而形成生物膜，并诱发管壁腐蚀与结垢；管壁结垢与腐蚀会降低管网的输水能力，使二级泵站动力消耗，甚至引起爆管；而生物膜与管网水中病原微生物的孳生还会对饮用者的健康构成直接的威胁。

研究表明用于饮用水生物稳定性研究的指标主要有BDOC、AOC、BGP及MAP。其中以AOC指标为主，但由于其测定方法复杂，一些研究表明BDOC用作水质生物稳定性评价指标，但测定时间较长仍然满足不了实际应用的要求。

BDOC(biodegradable dissolved organic carbon，可生物降解溶解性有机碳)测定方法可分为静态培养和动态培养两类。静态培养主要有土著菌接种的悬浮培养法和附着生物膜的砂培养法。具体步骤为先将待测水样通过膜滤去除不溶性物质，接种后在20℃及暗室条件下培养(悬浮培养法为28天，生物砂培养法为10天)，同时测定水样中DOC值的变化量，当DOC值恒定不变时，计算培养前后DOC值之差即为BDOC。这种方法简单易行，但却测定时间长，为了克服这个缺陷，出现了动态培养的方法，目前主要有封闭循环测定法和活塞流测定法，这些方法以生物膜为测定菌群结构，提高了降解有机物的能力，可将测定时间缩短为2-3天，甚至数小时内，但动态培养法一次仅能测定一个水样，很难满足常规研究批量试验的要求，并且BDOC所反映的只是生物生长所消耗的有机碳的量，并不能直接反映生物生长合成的生物质的量。

AOC(assimilable organic carbon，可吸收有机碳)测定法是由Van derKooij,D.提出，主要以给水管网中常见菌荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)P17和螺旋菌(Spirillum sp.)NOX作为测试菌株接种水样，在特定条件下培养3-14天得到生长最大值，利用标准曲线将测试菌在水样中生长的最大值换算为AOC值，以标准基质乙酸钠的碳浓度形式表示。由上可知，常规AOC测定是一个很长的过程，步骤复杂，从而该法难以在实际应用中推广，怎样使其缩短测试时间，简化步骤，是AOC生物测定法研究中的主要问题，因此许多研究致力于改进它。

BRP(bacterial regrowth potential，细菌生长潜力)指标是Sathasivan等基于AOC生物测定提出的，与传统AOC生物测定法的主要不同，是用天然水土著菌替换特定纯种菌接种，以细菌生长的最大值表示BRP值，因此也需要至少3天左右的时间完成测定。相比特定纯种菌，采用天然土著菌落作为测试菌，更易适应本地水样，对可同化有机碳的吸收能力更强；用细菌生长的最大值代替AOC值，可避免建立标准曲线，计算生长因子，节省时间和人力。从BRP的测定方法和机理看，其本质是AOC生物测定法的衍生，这种方法的局限在于可比性差。

MAP(microbially available phosphorus，可生物利用磷)指标由Lehtola等提出，用以评价水中可生物利用磷的水平，该法通过分批培养，建立磷酸氢二钠标准基质浓度与P17菌株生长的最大值之间的标准曲线，其斜率即生长因子，通过对补充非含磷无机盐溶液和足量的有机碳的水样进行P17菌株接种及培养，测定P17菌株生长的最大值，利用生长因子将生长的最大值转换为相对标准磷酸氢二钠的浓度形式表现，即MAP值。MAP测定法是将传统AOC生物测定中的标准基质乙酸碳换成了磷酸二氢钠，将用可同化有机碳换成了可生物利用磷评价水质生物稳定性，主要反映磷源对水质生物稳定性的影响，但是其测定菌量生长最大值仍需要很长时间，测定步骤繁琐。

发明内容

本发明目的在于克服现今测定饮用水水质生物稳定性方法的局限和不足，传统方法测定生物生长最大值，需要长时间培养来确定结果，其测定的结果往往不能及时应用于给水处理和饮用水管网水质生物稳定性的监测和分析,存在测定步骤繁琐、时间长、成本高、不宜实用推广等缺陷,为此本发明提出一种快速定性-半定量饮用水水质生物稳定性评价方法,其测定方法简便快捷，其评价指标应用推广价值高、实用。

本发明给出的技术方案为：本发明结合利用TOC(total organic carbon,总有机碳)化学分析快速简便的特点以及细菌生长对成分复杂的低浓度有机碳浓度变化敏感的生物特性，同时利用高生物稳定性的水样中，异养菌接种初期阶段生长波动剧烈的特点，建立水样梯度稀释系列的方法，绘制出在短时间内不同时间阶段比增长速度μ与相应稀释梯度TOC浓度的曲线，通过不同时间阶段μ值随TOC浓度变化趋势的对比，找出比增长速度μ与TOC浓度变化趋势随时间和浓度变化最剧烈的曲线段，即确定为水样生物稳定性较好的有机碳浓度范围，此范围与用已知的有机碳标准基质溶液生物稳定性较好的范围进行对照，得出等价生物稳定性有机碳浓度条件下，水样有机碳与标准溶液有机碳的近似比例关系，并进一步用近似标准基质有机碳浓度表示水样的生物稳定性高低，由此完成对待测饮用水水质生物稳定性的评价。

进一步限定上述技术方案的保护范围,一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法，其特征在于，该测定方法包括步骤：

(1)以某种已知的唯一碳源作为标准溶液,对其进行TOC测定；同时将待测饮用水水样也进行TOC测定，获得TOC_水值；

再利用缓冲溶液分别对标准溶液和待测水样建立依次稀释至相近TOC最低浓度范围的稀释梯度系列。

(2)对每个稀释梯度样品接种，培养0-3h,在该时间范围内采集若干时间点t0、t1、t2，，，tn测得标准样品和待测水样样品的细菌浓度x；

利用比生长速度计算公式计算细菌的比增长速度值μ＝ln(x/x₀)/t，x₀、x为起始时间点与测试时间点分别测得的细菌浓度，两者间隔时间为t。

(3)以步骤(1)的稀释梯度系列TOC值为横坐标，以步骤(2)的比增长速度值μ为纵坐标，绘制出不同时间阶段稀释系列浓度与其对应梯度浓度下的μ0，μ1，μ2，，，un-1比增长速度的n条“浓度-μ值”曲线，

标准溶液和水样各获得n条“浓度-μ值”曲线，各自将n条“浓度-μ值”曲线合并在一起获得一张合并图。

(4)在合并图中，横轴方向靠近原点的低TOC浓度端，会出现随浓度变化有明显波动的曲线段，

在标准溶液的合并图中定义为标准曲线波动段，在水样合并图中定义为水样曲线波动段，

横轴方向从高TOC浓度端平缓曲线向低TOC浓度端的波动曲线段寻找出两者之间的临界点，该临界点对应的横坐标值即为标准溶液的最大TOC_max标值和水样的最大TOC_max水。

(5)TOC_max标/TOC_max水的比值，就可初步判断该水质易生物同化的程度，比值越大，水质中有机碳越容易被生物同化，

最终待测水样AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水即可定量评定待测水样的生物稳定性。

再进一步限定技术方案的保护范围，其特征在于，该测定方法包括步骤：

(1)以乙酸钠为唯一碳源的标准溶液的配制，并进行TOC测定，用缓冲溶液建立依次稀释两倍的梯度稀释系列,稀释系列中最小TOC浓度小于10μg/L；

同时将待测饮用水水样过滤后进行TOC测定，值为TOC_水，并利用同样缓冲溶液建立依次稀释两倍的稀释梯度系列至最小TOC浓度至少小于10μg/L。

(2)每个稀释梯度样品的体积为10ml，常温接种，接种条件为10ml水样接种20μl浓度范围为10⁶-10⁷CFU/ml的稳定期菌种母液，然后分别测得30℃培养0小时，20分钟，1小时，2小时接种水样的ATP发光强度。

(3)以所述测ATP的发光强度代替公式中菌浓度x和x₀，利用比生长速度计算公式μ＝ln(x/x₀)/t，分别计算出20分钟，1小时，2小时测试水样中细菌的比增长速度值μ0、μ1、μ2；

以稀释梯度系列TOC值为横坐标，以比增长速度值μ为纵坐标，分别绘制出标准溶液和水样稀释系列浓度各自与其对应梯度浓度下的μ0、μ1、μ2的“浓度-μ值”曲线，

标准溶液和水样各获得三条“浓度-μ值”曲线，各自将三条“浓度-μ值”曲线合并在一起获得一张合并图。

(4)在合并图上分别找出进入波动曲线段的临界点，其对应的横坐标值分别为标准溶液的最大TOC_max标值和水样的最大TOC_max水值。

(5)TOC_max标/TOC_max的比值，就可初步判断该水质易生物同化的程度，比值越大，水质中有机碳越容易被生物同化，

最终待测水样AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水即可定量评定待测水样的生物稳定性。

在水样合并图中，如果横轴方向水样的曲线全处于波动段，则水样的水质生物稳定性高于标准溶液曲线上的TOC_max标(一般为100μg/L左右)，从而可以判断得出水样的生物稳定性高于浓度为100μg/L乙酸钠标准溶液的稳定性，水样拟AOC_拟值的计算方程为AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水，其中TOC_水为原水样过滤后的TOC值；如果水样的曲线超过了波动段，则水样的生物稳定性小于于浓度为TOC_max标乙酸钠标准溶液的稳定性，同样其AOC_拟的计算方法如上。由于合并图有三条以上的曲线合并而成，大大降低因生物生长随机性以及人员操作误差导致在低TOC浓度端区域找不到任何一条曲线表现出波动曲线段的概率。

步骤(2)中，所述接种水样的ATP发光强度的测定，其测定条件为100μl水样加100μl活细胞ATP检测试剂。

利用与AOC测定方法相同标准碳源物质乙酸钠，配制标准溶液，建立梯度稀释体系，获得比生长速率与标准溶液有机碳浓度的图谱特征，与所待测水样的图谱相对照，确定图谱波动特征段浓度最大值处的对应TOC值，即可通过乘以稀释倍数得到，用乙酸钠碳浓度表示的水样拟AOC值。生物测定结合水样TOC化学指标，制定水样梯度稀释方案，基于异养菌在生物稳定性好的水样中生长速率在接种初期变化波动明显的特征，判定水样的生物稳定性，实现饮用水水质生物稳定性快速评价，评价结果符合水质生物稳定性特征，能够及时地应用于给水处理和管网水质生物稳定性的管理。

本发明测定法得出的评价结果不但可初步判定水质生物稳定性高低，在生物稳定性低于TOC_max标乙酸钠标准溶液的水样测定中，还可以通过图形比较，大致计算出拟AOC值，另外，还可以根据TOC_max标/TOC_max水的比值，反映出水质有机碳的易被异养细菌同化的程度。

附图说明

图1为实施例鱼蛋白胨配置水样的三条μ-TOC曲线图。

图2为实施例标准液的三条μ-TOC曲线图。

图3为本发明方法流程图。

表1为实施例中1倍标准溶液测试数据分析表。

表2为实施例中1倍鱼蛋白胨配制水样测试数据分析表。

备注说明：图1中谱波动特征为椭圆圈内三条曲线波动明显差异区。图1中矩形框处对应的X轴坐标即水样波动段最大浓度(TOC_max水＝500μg/L)，其对应图2中矩形框处的标准溶液碳浓度值(TOC_max标＝250μg/L)，原水样的TOC值乘以TOC_max标/TOC_max水的比值，即得水样拟AOC值(AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水)。

具体实施方式

以下结合实施例和附图对本发明技术方案作进一步说明。

方法说明

测定仪器、器皿和材料

恒温培养箱；无菌操作台；酒精灯；ATP测定仪；40ml无碳采样瓶；0.22μm、0.45μm的针头过滤器；一次性10ml注射针筒；移液器(2--200μl，1ml，10ml)

测试菌

实施例所用菌为P17(Pseudomonas fluorescense)

测试准备

1、1000╳标准碳溶液的配制(乙酸碳浓度为1000mg/L)

NaAc:5.67g/L

2、1000╳缓冲溶液的配制

3、1╳标准碳溶液的配制(乙酸碳浓度为1000μg/L)

1000╳标准碳溶液:  1ml/L

1000╳缓冲溶液:    1ml/L

4、2╳标准碳溶液的配制(乙酸碳浓度为2000μg/L)

1000╳标准碳溶液:  2ml/L

1000╳缓冲溶液:    1ml/L

5、1╳缓冲溶液的配制

1000╳缓冲溶液:    1ml/L

6、测试接种细菌母液的培养

将P17菌落接种到2╳标准碳溶液中25℃恒温黑暗培养一个月左右。

测试步骤(如图3所示)：

1、鱼蛋白胨水样配好后经0.22μm过滤器过滤后，测定TOC值，为2000μg/L；

2、将水样根据其TOC进行两倍梯度稀释至最小稀释浓度的TOC值小于150μg/L，每个稀释浓度的测试样体积为10ml；

3、将1╳标准碳溶液依次稀释两倍进行梯度稀释至最小稀释浓度的TOC值小于10μg/L，每个稀释浓度的溶液体积为10ml；

4、分别将水样和1╳标准碳溶液的梯度稀释系列进行接种，每10ml接种量为20μl浓度为10⁶-10⁷CFU/ml左右的稳定期P17菌种母液；

5、接种后立即测定初始ATP发光强度，并记录其值为X₀；

6、将接种后的水样和标准碳溶液放入15℃–30℃恒温培养箱中恒温培养，分别测定20分钟，1小时，2小时后的ATP发光强度，分别记录为X₁、X₂、X₃；时间段分别是t₁为20分钟(约0.33小时)，t₂为1小时，t₃为1小时。

7、利用公式μ0＝ln(X₁/X₀)/t₁；μ1＝ln(X₂/X₀)/t₂；μ2＝ln(X₃/X₂)/t₃计算不同稀释浓度梯度的比增长速率，并绘制比生长速率μ0，μ1，μ2与TOC浓度的三条曲线图(μ0-TOC,μ1-TOC，μ2-TOC)。所述波动特征段在不同时间段出现的几率大于一个时间段的曲线，如图所示即μ与TOC浓度变化趋势曲线，随浓度的不同，μ-TOC曲线趋势变化明显，靠近TOC低浓度端的一段曲线，见图1所示。

实例X₁、X₂、X₃；μ0，μ1，μ2如表1、表2所示：

8、将1╳标准碳溶液曲线图与水样的曲线图进行比较，根据水样图谱波动 段的TOC浓度最大值，和其生物稳定性等价的标准碳溶液图谱波动特征段TOC浓度最大值，即可判断水样的拟AOC值是否大于100μg/L(注：如果水样的整个图谱的三条μ-浓度曲线，各自的变化趋势都处于波动剧烈中，则水样的拟AOC值小于标准碳溶液图谱波动特征段浓度最大值；如果水样图谱在X轴零端随时间变化具有波动，在另一端出现变化趋势平缓或吻合，则水样的拟AOC值为：AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水见图1，图2所示，从图1和图2中确定TOC_max标和TOC_{max 水}的值：TOC_max标＝250μg/L，TOC_max水＝500μg/L；

9、确定两个图谱波动特征段浓度最大值处的对应值，即可通过TOC_max标/TOC_{max 水}比例系数乘以原水样的TOC值，得到用乙酸碳浓度表示的拟AOC值；如实例：鱼蛋白胨水样的AOC_拟＝250/500×2000＝1000(μg/L)

10、根据水样TOC_max标/TOC_max水的比值，可在一定程度上反映水质有机碳易被异养细菌同化的程度，其比值大则表明水质有机碳易被同化。

这种快速评价饮用水水质生物稳定性的生物测量方法具有快速定性、半定量水质生物稳定性评价特点，定性判定可以在3小时内快速判定给水水样的生物稳定性是否大于稳定水质AOC指标标准100μg/L(注：建立标准溶液曲线时，接种菌量根据具体实验适当降低，可获得TOC_max标小于或等于100μg/L的曲线)，半定量评价可以根据测定结果大致给出相当于可吸收有机碳的拟AOC值范围。

该快速定性-半定量饮用水水质生物稳定性评价方法通过测定待测水样的TOC值，随后将其两倍系列梯度稀释至最小稀释倍数下的TOC值最好为10μg/L以下，每个稀释梯度样品的总体积小于10ml,接着在常温下进行接种，每10ml接种量大于20μl浓度为10⁶-10⁷CFU/ml左右的稳定期异样菌菌种母液，然后分别测15-30℃培养0小时，10-20分钟，1小时，2小时接种水样的ATP发光强度，此时测定ATP发光强度的条件为100μl水样加100μl活细胞ATP检测试剂，最后利用比生长速度计算公式μ＝ln(x/x₀)/t，以发光强度代替菌浓度x和x₀，分别计算出0小时，1小时，2小时测试水样中细菌的比增长速度值μ0、μ1、μ2，并分别制作稀释系列的TOC-μ0、TOC-μ1、TOC-μ2的三条曲线并将它们合并于一图中，对比曲线零浓度附近随浓度变化有明显波动的曲线段，此段曲线的最大TOC值的生物稳定性与同样条件下利用1000μg/L左右的乙酸钠为唯一碳源稀释梯度溶液接种培养检测后所得曲线波动段的最大TOC值的相同，即可得出比例系数TOC_max标/TOC_max水，在此基础上就可判断水质生物稳定性是否大于TOC_max标，从而定性地判断水样的生物稳定性相对于标准物质溶液TOC_max标大小，同时计算出原水样拟AOC浓度(AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水)。

本发明相对于以往饮用水生物稳定性检测的优点是快速简便，不局限特定的异养菌菌种和接种培养条件，提供的信息紧扣水质生物稳定性的特点，能够及时有效地应用于饮用水水厂及管网系统的水质调控中。

Claims (3)

1.一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法,其特征在于,结合利用TOC化学分析快速简便的特点以及细菌生长对成分复杂的低浓度有机碳浓度变化敏感的生物特性，同时利用高生物稳定性的水样中，异养菌接种初期阶段生长波动剧烈的特点，建立水样梯度稀释系列的方法，绘制出在短时间内不同时间阶段比增长速度μ与相应稀释梯度TOC浓度的曲线，通过不同时间阶段μ值随TOC浓度变化趋势的对比，找出比增长速度μ与TOC浓度变化趋势随时间和浓度变化最剧烈的曲线段，即确定为水样生物稳定性较好的有机碳浓度范围，此范围与用已知的有机碳标准基质溶液生物稳定性较好的范围进行对照，得出等价生物稳定性有机碳浓度条件下，水样有机碳与标准溶液有机碳的近似比例关系，完成对待测饮用水水质生物稳定性的评价。

2.如权利要求1所述的一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法，其特征在于，该评价方法包括步骤：

(1)以某种已知的唯一碳源作为标准溶液,对其进行TOC测定；同时将待测饮用水水样也进行TOC测定，获得TOC_水值；

再利用缓冲溶液分别对标准溶液和待测水样建立依次稀释至相近TOC最低浓度范围的稀释梯度系列；

(2)对每个稀释梯度样品接种，培养0-3h,在该时间范围内采集若干时间点t0、t1、t2，，，tn测得标准样品和待测水样样品的细菌浓度x；

利用比生长速度计算公式计算细菌的比增长速度值μ＝ln(x/x₀)/t，x₀、x为起始时间点与测试时间点分别测得的细菌浓度，两者间隔时间为t；

(3)以步骤(1)的稀释梯度系列TOC值为横坐标，以步骤(2)的比增长速度值μ为纵坐标，绘制出不同时间阶段稀释系列浓度与其对应梯度浓度下的μ₀，μ₁，μ₂，，，u_n-1比增长速度的n条“浓度-μ值”曲线，

标准溶液和水样各获得n条“浓度-μ值”曲线，各自将n条“浓度-μ值”曲线合并在一起获得一张合并图；

(4)在合并图中，横轴方向靠近原点的低TOC浓度端，会出现随浓度变化有明显波动的曲线段，

在标准溶液的合并图中定义为标准曲线波动段，在水样合并图中定义为水样曲线波动段，

横轴方向从高TOC浓度端平缓曲线向低TOC浓度端的波动曲线段寻找出两者之间的临界点，该临界点对应的横坐标值即为标准溶液的最大TOC_max标值和水样的最大TOC_max水；

(5)TOC_max标/TOC_max水的比值，用于判断水质易生物同化的程度，

最终待测水样AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水，用于定量评定待测水样的生物稳定性。

3.如权利要求2所述的一种快速评价饮用水水质生物稳定性的方法，其特征在于，该评价方法步骤具体为：

(1)以乙酸钠为唯一碳源的标准溶液的配制，并进行TOC测定，用缓冲溶液建立依次稀释两倍的梯度稀释系列,稀释系列中最小TOC浓度小于10μg/L；

同时将待测饮用水水样过滤后进行TOC测定，值为TOC_水，并利用同样缓冲溶液建立依次稀释两倍的稀释梯度系列至最小TOC浓度至少小于10μg/L；

(2)每个稀释梯度样品的体积为10ml，常温接种，接种条件为10ml水样接种20μl浓度范围为10⁶-10⁷CFU/ml的稳定期菌种母液，然后分别测得30℃培养0小时，20分钟，1小时，2小时接种水样的ATP发光强度；

(3)以所述测ATP的发光强度代替公式中菌浓度x和x₀，利用比生长速度计算公式μ＝ln(x/x₀)/t，分别计算出20分钟，1小时，2小时测试水样中细菌的比增长速度值μ₀，μ₁，μ₂；

以稀释梯度系列TOC值为横坐标，以比增长速度值μ为纵坐标，分别绘制出标准溶液和水样稀释系列浓度各自与其对应梯度浓度下的μ₀、μ₁、μ₂的“浓度-μ值”曲线，

标准溶液和水样各获得三条“浓度-μ值”曲线，各自将三条“浓度-μ值”曲线合并在一起获得一张合并图；

(4)在合并图上分别找出进入波动曲线段的临界点，其对应的横坐标值分别为标准溶液的最大TOC_max标值和水样的最大TOC_max水值；

(5)TOC_max标/TOC_max水的比值，用以判断该水质易生物同化的程度，最终待测水样AOC_拟＝(TOC_max标/TOC_max水)*TOC_水用以定量评定待测水样的生物稳定性。