CN105588831A - 一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法。所述淡水发光菌为青海弧菌Q67，步骤为将待检样品处理并稀释、调pH值；将活化后的青海弧菌Q67菌液加入到待检样品中进行反应；同时用稀释所用的稀释液代替待检样品作为对照；采用生物发光测定仪检测待检样品和对照的发光强度；结果计算，设定标准参比毒物ZnSO₄，根据结果判定毒性效应。快速、灵敏、准确，便于推广应用。同时采用淡水发光菌青海弧菌作为测试菌种，避免了海洋发光菌所需盐度对发光的影响。参比毒物为ZnSO₄，减少了对生态环境和人体健康的影响。

Description

一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法

技术领域

本发明涉及环境污染检测和评价技术领域，尤其涉及一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法。

背景技术

目前在环境监测领域中，污染物的种类和浓度一般采用各种仪器与化学分析手段可以比较快速而灵敏地分析测定出来，但大部分测定项目或参数还需定期采样。因而只能反映采样瞬时的污染物浓度，不能反映环境已经发生的变化。而生物监测是20世纪初在一些国家开展起来，近些年在水污染的生物监测成为活跃的研究领域。生物监测是从生物学角度出发对环境质量的检测和评价依据，其可以通过生物个体、种群或群落对环境污染或变化所产生的响应及时反映污染物的综合毒性效应及可能对环境产生的潜在危害。在实际环境中，环境污染通常不仅是由单一污染物引起，而是由多种污染物同事存在形成的复合污染。生物监测则可以更真实、更直接地反映出多种污染物在自然条件下对生物的综合影响，从而更客观、更全面地评价各种环境状况。此外，生物监测能连续监测污染史，成本低廉简单易行，可以灵敏简便地反映长期的污染效果。目前生物监测主要应用于地表水体，饮用水，河流、湖泊沉积物，大气，土壤等的检测，鲜见针对稀土尾矿库周边地下水的污染检测及相关研究。稀土尾矿库周边地下水属于静态水，循环更新周期长，水质参数变化慢，一旦污染很难恢复，取出后水质状况容易发生改变，长期储存会使水质真实性受到影响。由于地下水地质作用可以冲刷、溶蚀和搬运沉积物或岩石，破坏颗粒间的结合力，侵蚀岩石，并将侵蚀产物搬运，所以与土壤，地表水等相比，该区域地下水含有更多的金属、氯、硫酸根和碳酸氢根等离子。同时在稀土尾矿库周边地下水，往往还会由于尾矿库污染物泄露、污染物地表径流、降水等原因而遭到不同程度污染，特别是一些放射性稀土元素可能进入地下水系统，使环境情况相比地表水尤为复杂，这方面的生物监测工作研究起步较晚，所以我国目前监测领域针对该区域地下水开展的生物监测工作十分有限。

目前现有的国标水质急性毒性的测定发光细菌法仅适用于工业废水、耐污水体及实验室条件下可溶性化学物质的水质急性毒性监测，应用于稀土尾矿库区地下水污染监测还有一定的局限性和较大的不确定性。国标方法中采用明亮发光杆菌发光强度来响应环境污染程度，明亮发光杆菌是一种海洋发光细菌，高度适应海洋生态环境，只有在盐度3％，及丰富的钠离子存在时才能良好生长和发光。所以检测土壤、湖泊河流或地下水等时必须要满足他们对盐度和钠离子存在的需求，所得结果才比较可靠。然而，过多的钠离子或氯离子均可能影响某些物质生物学毒性的表现。并且国标测定方法选用HgCl₂作为参比毒物，毒性较强，使用后排入环境对生态环境和人体健康危害较严重。此外，国标法或者已报道的其他参考方法在测定水体毒性时未考虑水质浊度的影响，会造成结果的偏差，导致准确度降低。因此，需要开发一种简单快速检测稀土尾矿库周边地下水污染状况的急性毒性测试方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种采用淡水发光细菌青海弧菌针对稀土尾矿库周边污染的地下水污染急性毒性测试的方法，克服以往生物监测方法的缺陷与不足，减少传统方法各种因素带来的可能影响，使检测结果更可靠。

为实现上述目的，应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述淡水发光菌为青海弧菌Q67。

进一步，步骤为，

将待检样品处理并稀释、调pH值；

将活化后的青海弧菌Q67菌液加入到待检样品中进行反应；同时用所述稀释所用的稀释液代替待检样品作为对照；

设定标准参比毒物ZnSO₄，用所述稀释液稀释成不同浓度的ZnSO₄溶液，测定相应的发光强度；采用origin9.0软件对ZnSO₄浓度与发光强度进行非线性拟合，建立剂量-效应曲线拟合方程；

采用生物发光测定仪检测待检样品和对照的发光强度RLU；

计算相对抑制率，并将相对抑制率代入剂量-效应曲线拟合方程，求出与样品急性毒性相当的对应的ZnSO₄的浓度,判定毒性效应。

进一步，所述待检样品的处理为将样品进行过滤或沉淀，使其浊度小于300NTU。

进一步，所述稀释是指用0.85wt％NaCl溶液来稀释，使检测的发光强度RLU为200-600万即可。具体的，本发明的稀释是用0.85wt％NaCl来稀释，稀释的合适程度通过检测发光强度(200-600万)来调整控制。发光强度的检测是将100ul合适稀释的待检样品与900ul的0.85wt％NaC1溶液混合，生成1000ul的反应体系在发光仪中检测，读取发光强度。

进一步，所述调pH值为用盐酸或者氢氧化钠调pH值在6-9范围内。

进一步，所述反应为常温反应15-30min；优选的，常温反应20min。

进一步，所述标准参比毒物ZnSO₄是用于建立剂量-效应曲线拟合方程；用稀释液将ZnSO₄稀释成不同浓度的溶液，检测相应的发光强度，建立并检验参比毒物稀释浓度与其相对抑制率的剂量-效应拟合曲线。

进一步，所述相对抑制率计算所采用的公式为，

相对抑制率(R,％)＝(1－样品的RLU/对照的RLU)×100；

所述根据结果判定毒性效应为：

检测样品对应ZnSO₄的浓度C＜1.0mg/L时，判定为无毒；

对应ZnSO₄的浓度1.0mg/L≤C＜1.6mg/L时，判定为轻微毒性；

对应ZnSO₄的浓度1.6mg/L≤C＜2.7mg/L时，判定为中等毒性；

对应ZnSO₄的浓度2.7mg/L≤C＜5.2mg/L时，判定为强毒性；

对应ZnSO₄的浓度C≥5.2mg/L时，判定为超强毒性。

本发明通过对淡水发光菌检测条件优化，以及对稀土金属冶选尾矿库周边地下水的毒性综合响应加以实际验证，形成了快速、灵敏准确的检测稀土尾矿库周边地下水污染的测试体系，便于推广应用。同时采用淡水发光菌青海弧菌作为测试菌种，避免了海洋发光菌所需盐度对发光的影响。测试快速方便，反应时间仅需20min,对样品pH值的要求比较广，在6-9之间即可，样品浊度低于300NTU不需进行过滤处理，样品稀释液选用0.85％NaCl溶液，配制简便省时，参比毒物为ZnSO₄，减少了对生态环境和人体健康的影响。

本发明广泛适用于尾矿库周边地下水污染的检测。

本发明淡水发光细菌测试条件优化为：最佳反应时间为20min；测试用pH值控制在6-9之间；稀释液选择0.85％NaCl；样品浊度控制在300NTU以下，不需要进行过滤处理；标准参比毒物为ZnSO₄。

附图说明

图1是不同反应时间对测试发光强度的影响图。

图2是不同pH值对样品测试相对抑制率的影响图。

图3是发光细菌对不同pH值的GW-7样品的相对抑制率的响应图。

图4是不同稀释液对发光强度的影响图。

图5是样品不同浊度对青海弧菌相对抑制率的影响图。

图6为函数拟合不同浓度的ZnSO₄(1)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。

图7为函数拟合不同浓度的MnCl₂(2)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。

图8为函数拟合不同浓度的AgNO₃(3)对发光菌相对抑制率的剂量-效应曲线图。

图9为原位稀土尾矿库17个地下水样品对青海孤菌相对抑制率的影响图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

菌种活化：将装有青海弧菌Q67(Vibrio.QinhaiensisQ67)冻干粉(购于北京滨松光子学商贸(中国)有限公司)的安瓿瓶先置于室温内约l0-15min，在超净工作台中切开安瓿瓶，取已灭菌的0.85wt％NaC1溶液100μL点在培养皿平板上，用接种环取一环菌种蘸取点的溶液在平板上划线，倒置放于恒温培养箱中于22℃培养24h。

新鲜菌液制备：挑取单个菌落接种于斜面培养基上，于22℃培养24h后转接于斜面，活化为第3代菌种；将培养好的第3代菌种接种到15mL液体培养基中22℃振荡培养16-18h(处于对数期)，待用。

待测样品：以不同浓度的Na₂SO₄溶液作为受硫酸盐污染的地下水样品。

液体培养基：淡水发光细菌Q67培养基成分见表1。

表1.发光细菌Q67培养基配方表

检测发光细菌发光强度：打开生物发光测定仪(BERTHODLB9501发光仪，德国)，预热15min，调零，备用。取适量体积的已灭菌0.85wt％NaC1溶液，调整菌液浓度，测其发光强度(RLU为200-600万)。实验前用0.85wt％NaC1溶液稀释待测样品和ZnSO₄，设置不同的稀释度，分别取0.9mL加入化学/生物发光仪的低背景管中，每个稀释度做3个平行，以0.85wt％NaC1溶液为对照，为减少仪器测定延长反应时间所引起的误差，每隔20s向同一平行管的另外管中加0.1mL菌悬液到样品管中，混匀后控制待测反应时间在20min。

按各管原来加菌液的顺序，当某管达到记录的反应时间，立即将测试管放入仪器测试舱，读出并记录其发光强度。

计算测试样品急性毒性：根据试验测得的发光强度RLU(RelativeLightUnits)，计算样品的相对发光抑制率：相对抑制率(R,％)＝(1－试样的RLU/对照的RLU)×100。

建立标准参比毒物ZnSO₄的剂量-效应曲线，origin9.0软件拟合ZnSO₄浓度与发光强度的关系方程：

y＝3.32+101.1/(1+10^((5.3-x)*1.25))。见图6。

实施例1：反应时间和pH值的选择试验

该试验对测试方法中的测试反应时间以及样品pH值适用范围进行优化。

分别配制并稀释不同浓度的Na₂SO₄溶液(500、1000和10000mg/L)，在该溶液基础上进行反应时间以及pH值的优化实验。

反应时间优化：分别设置不同的反应时间0、3、7、10、15、20、30、40、60、80、100和120min。

pH值优化：分别将待测样品调节pH值至4、5、6、7、8、9、10、11和12。

反应时间优化结果见图1，图1为不同反应时间对测试发光强度的影响图，其中CK即为0.85wt％NaCl，500mg/L，1000mg/L及10000mg/L分别表示500mg/L的Na₂SO₄，1000mg/L的Na₂SO₄及10000mg/L的Na₂SO₄。从图1可以看出，反应时间控制在15-30min以内，发光强度相对比较稳定，但随反应时间的延长，发光菌发光强度会有所增加。采用不同浓度的硫酸钠(500mg/L，1000mg/L和10000mg/L)进一步验证也表明反应时间在15-30min内发光强度比较稳定。基于测试快速的考虑，本发明确定采用优化反应时间为20min，并用于后续优化实验中。

设定青海弧菌Q67在pH＝7条件下相对发光强度为100％，配制不同pH值(pH＝4-12)不同浓度的Na₂SO₄溶液，测定其发光强度变化。结果见图2。图2为不同pH值对样品测试相对抑制率的影响图，其中0mg/L即0.85wt％的NaCl，500mg/L及1000mg/L分别代表了500mg/L的Na₂SO₄及1000mg/L的Na₂SO₄。可以看出青海弧菌Q67在pH＝5-10的范围内，相对抑制率相对比较稳定。

本发明以实地稀土金属冶选尾矿库周边硫酸盐污染的地下水样品GW-7为例，进一步验证是样品不同pH对测定结果的影响，结果表明样品在pH6-9的范围内(图3)，相对抑制率比较稳定，适用于本发明针对稀土尾矿库周边污染地下水的测试环境，即所用样品不需调pH值，即可直接用于相对抑制率的测定。

实施例2：样品稀释液的选择试验

在测定过程中，由于待测样品可能含有某些毒物的浓度相对较高，致使发光细菌对毒性不产生响应，无法获得准确的检测结果。因此需要对待测样品进行适当稀释后再进行测定。

分别配制模拟天然水(成分见表2)、0.85wt％NaCl和10％乳糖溶液三种稀释液，用这三种稀释溶液配制或稀释成1000mg/L的Na₂SO₄溶液。依据上述方法测定，样品在这三种不同稀释液中的相对抑制率见图4。图4为不同稀释液对相对抑制率的影响图，其中CK为不含Na₂SO₄的相应的稀释液，从图4可以看出，10wt％的乳糖测定结果波动相对较大，稳定性较差。在模拟天然水和0.85wt％NaCl溶液中，发光菌相对抑制率比较稳定，但是由于模拟天然水配制较0.85wt％NaCl溶液复杂费时，所以选用0.85wt％NaCl溶液为后续试验的最优样品稀释液。

表2模拟天然水配方表

实施例3：样品浊度的影响试验

样品的浊度会一定程度影响发光细菌发光强度的读取，如果样品浊度过大则需要对样品进行过滤或沉淀等处理。本实施例采用细砂，对样品进行充分研磨后，过100目滤筛。用蒸馏水搅拌24h，清洗数次。用0.85wt％NaCl稀释成14个不同浊度的稀释液样品(0NTU-4800NTU)，采用浊度计测定各稀释液的浊度并依据上述方法测定发光细菌抑光率，结果见图5，图5为样品不同浊度对青海孤菌相对抑制率的影响图。

从图5可以看出，随着稀释液浊度的减少，发光菌相对抑制率也在逐渐减小，说明浊度对发光菌发光的干扰逐渐降低。在10号样品即浊度小于252个NTU(NephelometricTurbidityUnits，射浊度单位)时，浊度对发光菌的干扰可以忽略不计。该结果表明若待测样品浊度高于约300个NTU时需要对样品进行过滤或沉淀处理。

实施例4：毒性参比物选择实验

选择毒性较低的化合物AgNO₃、MnCl₂和ZnSO₄，并按国标配制成不同浓度的溶液。将AgNO₃的浓度分别设定为0.02、0.04、0.08、0.1、0.14、0.18和0.24mg/L。MnCl₂和ZnSO₄溶液的浓度分别设定为0.05、0.15、0.35、0.9、2.4、5.6、14和20mg/L。

采用origin9.0软件进行函数拟合，推算三种化合物的EC₅₀，并比较各自拟合函数的相关系数，选择最优毒性参比物，结果见图6-8。其中图6为函数拟合不同浓度的ZnSO₄(1)对发光菌相对抑制率的影响变化图；图7为函数拟合不同浓度的MnCl₂(2)对发光菌发光强度的影响变化图；图8为函数拟合不同浓度的AgNO₃(3)对发光菌相对抑制率的影响变化图。从图中可以看出，只有ZnSO₄在0-20mg/L范围内符合剂量-效应曲线，而MnCl₂和AgNO₃在该范围内相对抑制率没有达到50％，计算得到的EC₅₀准确性比较低。通过origin软件计算得到AgNO₃的EC₅₀为13.27mg/L，R²＝0.999；ZnSO₄的EC₅₀为2.0862mg/L，R²＝0.9994；MnCl₂的EC₅₀为10.246mg/L，R²＝0.98。综上，ZnSO₄的EC₅₀最小，相关系数最高，选用ZnSO₄作为本发明的毒性参比物。依据国标水质急性毒性的测定(发光菌法)(GB/T15441-1995)中发光菌相对抑制率对应的氯化汞毒性，本实施例确定ZnSO₄的毒性级别及相应的浓度范围，具体参照表3。

表3.ZnSO₄的毒性级别及对应的浓度范围参照表

实施例5：检测稀土尾矿库周边硫酸盐污染地下水的急性毒性试验

原位采集的不同来源的地下水样品1-17号4℃分别保存于实验室，经pH值测定，表明地下水样品pH范围均在6.8-7.9之间，采用0.47μm聚酯胺纤维素膜过滤，使其浊度均小于300NTU，用0.85wt％NaC1溶液对地下水样品1-17号进行稀释；将活化后的青海弧菌Q67分别加入到地下水样品1-17号中常温反应20分钟；同时用0.85wt％NaC1溶液代替样本作为对照；采用生物发光测定仪检测待检样品和对照的发光强度。计算公式为：相对抑制率(％)＝(1－检测样本的RLU/对照的RLU)×100或相对发光强度(％)＝检测样本的RLU/对照的RLU；

图9为原位稀土尾矿库17个地下水样品对青海孤菌相对抑制率的影响图，1号-17号原位稀土尾矿库地下水样品的相对抑制率分别为：18.6％(1号)，85.5％(2号)，91％(3号)，38％(4号)，15％(5号)，35％(6号)，52％(7号)，31％(8号)，92％(9号)，97％(10号)，11％(11号)，69％(12号)，37％(13号)，92％(14号)，18％(15号)，18％(16号)，36％(17号)。

分别将相对抑制率代入剂量-效应曲线拟合方程，求出与样品急性毒性相当的对应的ZnSO₄的浓度,依据表3的判断依据，判定原位地下水毒性级别如下：

样品3、9、10、14为超强毒性；

样品2和12为强毒性；

样品4、6、7、8、13、17为中等毒性；

样品1、5、11、15、16为轻微毒性。

尽管上面已经展示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (8)

1.一种应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述淡水发光菌为青海弧菌Q67。

2.权利要求1所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，步骤为，

将待检样品处理并稀释、调pH值；

将活化后的青海弧菌Q67菌液加入到待检样品中进行反应；同时用所述稀释所用的稀释液代替待检样品作为对照；

设定标准参比毒物ZnSO₄，用所述稀释液稀释成不同浓度的ZnSO₄溶液，测定相应的发光强度；采用origin9.0软件对ZnSO₄浓度与发光强度进行非线性拟合，建立剂量-效应曲线拟合方程；

采用生物发光测定仪检测待检样品和对照的发光强度RLU；

计算相对抑制率，并将相对抑制率代入剂量-效应曲线拟合方程，求出与样品急性毒性相当的对应的ZnSO₄的浓度,判定毒性效应。

3.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述待检样品的处理为将样品进行过滤或沉淀，使其浊度小于300NTU。

4.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述稀释是指用0.85wt％NaCl溶液来稀释，使检测的发光强度RLU为200-600万即可。

5.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述调pH值为用盐酸或者氢氧化钠调pH值在6-9范围内。

6.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述反应为常温反应15-30min；优选的，常温反应20min。

7.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述标准参比毒物ZnSO₄是用于建立剂量-效应曲线拟合方程；用稀释液将ZnSO₄稀释成不同浓度的溶液，检测相应的发光强度，建立并检验参比毒物稀释浓度与其相对抑制率的剂量-效应拟合曲线。

8.权利要求2所述应用淡水发光细菌检测稀土尾矿库周边地下水污染急性毒性的方法，其特征在于，所述相对抑制率计算所采用的公式为，

相对抑制率(R,％)＝(1－样品的RLU/对照的RLU)×100；

所述根据结果判定毒性效应为：

检测样品对应ZnSO₄的浓度C＜1.0mg/L时，判定为无毒；

对应ZnSO₄的浓度1.0mg/L≤C＜1.6mg/L时，判定为轻微毒性；

对应ZnSO₄的浓度1.6mg/L≤C＜2.7mg/L时，判定为中等毒性；

对应ZnSO₄的浓度2.7mg/L≤C＜5.2mg/L时，判定为强毒性；

对应ZnSO₄的浓度C≥5.2mg/L时，判定为超强毒性。