CN113930478A - 一种高通量快速检测水样急性毒性的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，属于环境检测分析领域。上述方法以发光菌为受试生物，检测步骤包括：样品处理、发光菌工作液制备、样品检测和毒性表征。本方法通过对水样的萃取处理，可避免无机盐离子对有机物毒性的干扰；在检测过程中，通过对发光菌的“驯化”，有效提高了其检测的灵敏度；结合微板法操作，可实现同时对多个水样急性毒性的批量检测。此外，本发明提供了以氯化汞为参照化合物时的水样急性毒性等级的评估体系，将本发明方法测得的TEQ直接用于评估，减少了其他检测方法的转化过程，具有更广的适用性，在水样毒性监测趋于常态化的背景下，本发明方法具有广泛推广性。
Description
技术领域
本发明属于环境检测分析领域，具体地，涉及一种高通量快速检测水样急性毒性的方法。
背景技术
随着废水水质安全排放和回用要求的不断提高，废水毒性监测越来越受到重视。发光菌因其对毒性物质敏感，且生长快、反应时间短等特点，在废水急性毒性评估中被广泛使用。
水样的发光菌急性毒性取决于水样中化学物质的类型、浓度及其累积效应，但由于废水中存在的一些金属离子(例如铜离子)会对发光菌产生“低促高抑”的作用，使得在使用传统发光菌法检测原水样生物毒性时，金属离子会对废水中有机污染物的毒性效应产生一定程度的掩盖，从而低估废水的急性毒性。另一方面，传统发光菌法利用新复苏的发光菌冻干粉进行毒性检测，其灵敏度受限，无法准确反应污染程度较低的水样的急性毒性当量。此外，传统发光菌法通过2mL或5mL测试管规格的生物发光光度计检测水样的发光亮，通量较低，不利于多个水样的批量处理。
随着废水毒性监测越来越朝向常规水质监测发展，开发高通量快速检测水样急性毒性的方法具有重要意义。
发明内容
1.要解决的问题
针对传统发光菌法在抗离子干扰、灵敏度低和检测通量低等方面的不足，本发明提供一种可排除无机物干扰、灵敏度高、快速高通量检测水样急性毒性的方法。
2.技术方案
为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：
本发明提供了一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，包括以下步骤：
(a)水样处理：对水样进行萃取处理，浓缩水样中有机物；浓缩水样中的有机物，有利于减少水样中无机物，如金属离子的干扰；
(b)发光菌工作液制备：将发光菌接种于发光菌固体培养基上活化，挑取活化后的发光菌单菌落接种至发光菌液体培养基中培养，将培养后的发光菌菌液稀释制成发光菌工作液，工作液的发光量控制在10000～50000RLU；
(c)样品检测：在样品检测板中分别加入梯度浓度的参照化合物溶液、阴性对照液和梯度浓缩系数的样品，将96孔板至于通风橱中15～20min后迅速在每孔加入已知量发光菌工作液，室温静置15～20min，酶标仪检测每孔发光量(RLU)；
(d)毒性表征：根据式(1)计算各梯度浓度参照化合物和梯度浓缩系数样品的发光度抑制率IR，分别拟合参照化合物浓度和样品浓缩系数的剂量-效应曲线，获得产生x％抑制率时参照化合物的浓度ECx参照化合物(以浓度表示)和产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数ECx样品(以相对浓缩系数表示)，根据式(2)计算样品毒性当量(TEQ)，样品毒性当量是将样品的急性毒性折算成产生同样急性毒性的参照化合物的浓度：
其中，其中，ECx参照化合物(以浓度表示)为产生x％抑制率时参照化合物的浓度，ECx样品(以相对浓缩系数表示)为产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(a)中水样的浓缩倍数不小于20倍，浓缩的样品溶解于甲醇中。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(a)中水样的浓缩采用萃取处理进行浓缩。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(a)中萃取处理包括液-液萃取或固相萃取，浓缩有机物，并记录浓缩倍数，该步骤可以减少无机物的干扰。
作为本发明进一步的改进，上述水样的液-液萃取方法可采用二氯甲烷或乙酸乙酯提取水样中有机物。
作为本发明进一步的改进，上述水样的固相萃取方法可采用Oasis HLB或C18固相萃取柱萃取水样，并用甲醇或乙酸乙酯洗脱。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(b)中培养指活化后的发光菌单菌落接种至发光菌液体培养基中20～25℃培养10～15h。进一步地，22℃培养12h。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(b)中发光菌为明亮发光菌；发光菌固体培养基配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉2.5g/L、氯化铵0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化铁0.01g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠30.0g/L、琼脂13.0g/L；发光菌液体培养基配方除无琼脂外，其余与固体培养基相同。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(b)中培养后的菌液采用3％氯化钠溶液稀释，发光菌工作液的发光量控制在10000～50000RLU，达到此发光量的稀释倍数通常在1000倍左右。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中的参照化合物为氯化汞，氯化汞溶于甲醇中，其梯度溶液的浓度范围为0.2～2.4mg/L，具体浓度可设为0.2mg/L、0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L和2.4mg/L；阴性对照液为甲醇。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中样品检测板包括96孔板等。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中的参照化合物、阴性对照二者的加样体积均为10μL。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中样品的加样体积最大不超过10μL，不足10μL时用甲醇补足，根据样品浓缩倍数和加样量和计算其在反应体系中的相对浓缩系数。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中发光菌工作液的添加量为200μL。
作为本发明进一步的改进，上述步骤(c)中发光菌工作液用排枪添加。
作为本发明进一步的改进，上述方法还包括水样急性毒性级别评估体系，所述毒性等级的评估体系以氯化汞为参照化合物：
a)TEQ≥0.07mg/L，其毒性等级为高毒；
b)0.007mg/L≤TEQ<0.07mg/L，其毒性等级为低毒；
c)TEQ<0.007mg/L，其毒性等级为无毒。
3.有益效果
本发明与现有技术相比，其有益效果在于：
(1)本发明提供的一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，经过萃取浓缩有机物、活化发光菌种等步骤，相较于传统方法灵敏度更高，如实施例1和图2所示，本发明的方法测得的EC50为0.048mg/L，而国标法测得的EC50为0.148mg/L，即本发明的方法灵敏度是国标法的三倍，对于污染程度较低的水样的急性毒性检测具有更好的适用性。
(2)本发明提供的一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，通过96孔板可以同时测定96个样品，而传统方法需要逐一测定，相比之下，本发明方法具有更高的通量，可以在单次试验中批量检测多个样品，同时操作能够提高平行样品的检测稳定性。
(3)本发明提供的一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，提供了以氯化汞为参照化合物时，水样急性毒性等级的评估体系，该体系参考天津地方标准《污水综合排放标准》(DB12/356-2018)中发光菌急性毒性的氯化汞毒性当量阈值，以及急性毒性评估中以1/10阈值为限设置毒性等级，能够准确的评估水样急性毒性，将本发明方法测得的TEQ直接用于评估，减少了其他检测方法的转化过程，具有更广的适用性。
附图说明
图1为本发明高通量快速检测水样急性毒性的方法示意图；
图2为本发明方法氯化汞剂量-效应曲线与国标方法的对比图；
图3为采用本发明方法检测某市政污水样的剂量-效应曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。
本发明中所使用的术语，除另行说明外，均为本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体实施例，并参照附图，对本发明进行进一步详细描述。需注意，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
实施例1
本实施例提供一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，利用发光菌发光量抑制原理结合微板操作，实现对水样急性毒性的高通量快速检测，方法的原理与步骤如图1所示。
(a)水样处理：对水样进行液液萃取或固相萃取，浓缩水样中有机物，浓缩倍数不少于20倍，浓缩水样中的有机物，有利于减少水样中无机物，如金属离子的干扰；
(b)发光菌工作液制备：将发光菌接种于发光菌固体培养基上活化，挑取活化后的发光菌单菌落接种至发光菌液体培养基中培养，将培养后的发光菌菌液稀释制成发光菌工作液，工作液的发光量控制在10000～50000RLU；发光菌固体培养基配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉2.5g/L、氯化铵0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化铁0.01g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠30.0g/L、琼脂13.0g/L，121℃灭菌30min；用稀释涂布法将发光菌接种到固体培养基上，22℃培养48h得到发光菌单菌落。用接种环挑取单菌落接种至发光菌液体培养基中，22℃培养12h；液体培养基配方为：蛋白胨5.0g/L、酵母粉2.5g/L、氯化铵0.3g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化铁0.01g/L、碳酸钙1.0g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠30.0g/L，121℃灭菌30min。
(c)样品检测：在96孔板白板中分别加入梯度浓度的参照化合物溶液、阴性对照液和梯度浓缩系数的样品，将96孔板至于通风橱中15～20min后迅速在每孔加入200μL发光菌工作液，室温静置15～20min，酶标仪检测每孔发光量(RLU)；
(d)毒性表征：根据式(1)计算各梯度浓度参照化合物和梯度浓缩系数样品的发光度抑制率IR，分别拟合参照化合物浓度和样品浓缩系数的剂量-效应曲线，获得产生x％抑制率时参照化合物的浓度ECx参照化合物(以浓度表示)和产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数ECx样品(以相对浓缩系数表示)，根据式(2)计算样品毒性当量(TEQ)，样品毒性当量是将样品的急性毒性折算成产生同样急性毒性的参照化合物的浓度：
其中，其中，ECx参照化合物(以浓度表示)为产生x％抑制率时参照化合物的浓度，ECx样品(以相对浓缩系数表示)为产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数。
实施例2
本实施例提供本发明方法的灵敏度与国标法进行对比，基本方法同实施例1：
用3％氯化钠溶液将得到发光菌液稀释1500倍，取200μL稀释后的菌液加入96孔白板中，酶标仪(型号：BioTek Synergy H1)检测发光量均值为39460RLU，由此得到发光菌工作液。
用甲醇将氯化汞进行梯度稀释，得到浓度分别为0.4mg/L、0.8mg/L、1.2mg/L、1.6mg/L、2.0mg/L和2.4mg/L的氯化汞溶液。取96孔白板，在板中依次加入各稀释浓度的氯化汞溶液10μL，每个浓度3个平行，另设置3孔加入10μL甲醇作为溶剂对照，将96孔板置于通风橱中15min待甲醇完全挥发至无肉眼可见的液态物质，接着每孔加入200μL发光菌工作液，室温静置15min后在酶标仪上检测各孔发光量。
根据公式(1)计算各浓度氯化汞的发光菌发光度抑制率IR，绘制剂量-效应曲线如图2所示。
同时，按照国标GB/T 15441-1995方法检测不同浓度氯化汞的发光菌发光度抑制率，绘制剂量-效应曲线如图2所示。
图中可以看出本方法中发光菌的敏感性明显高于国标法，二者的EC50分别为0.048mg/L和0.148mg/L，本发明方法的灵敏度是国标法灵敏度的三倍左右。
实施例3
本实施例提供利用本发明方法对某市政污水样品的急性毒性进行检测。
采集经生化和深度处理后的某市政污水样品500mL，用盐酸将水样pH调至3，然后过0.45μm孔径的玻璃纤维膜，过滤后的水样采用6cc
HLB柱进行固相萃取，洗脱液先后为10mL甲醇和10mL乙酸乙酯，氮吹至干燥，再用1mL甲醇复溶，得到浓缩倍数为500的样品。
按实施例1方式制备发光菌工作液和氯化汞梯度溶液。取96孔白板，在板中依次加入各浓度的氯化汞溶液10μL，每个浓度3个平行，另设置3孔加入10μL甲醇作为溶剂对照，样品的加样量分别为5μL、2.5μL和1μL，再以甲醇补足至10μL，每个加样体积设3孔平行。加样后将96孔板置于通风橱中15min待甲醇完全挥发至无肉眼可见的液态物质，接着每孔加入200μL发光菌工作液，室温静置15min后在酶标仪上检测各孔发光量。
根据公式(1)计算加样量下样品的发光菌发光度抑制率IR，绘制剂量-效应曲线如图3所示。水样的EC50为4.89，即产生50％抑制率时样品的相对浓缩系数为4.89，根据公式(2)计算得到，样品的氯化汞当量为0.01mg/L。
根据本发明水样急性毒性评估体系，上述水样毒性级别为低毒。
Claims (10)
1.一种高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(a)水样处理：浓缩水样中有机物；浓缩水样中的有机物，有利于减少水样中无机物，如金属离子的干扰；
(b)发光菌工作液制备：将发光菌接种于发光菌固体培养基上活化，挑取活化后的发光菌单菌落接种至发光菌液体培养基中培养，将培养后的发光菌菌液稀释制成发光菌工作液，工作液的发光量控制在10000～50000RLU；
(c)样品检测：在样品检测板中分别加入梯度浓度的参照化合物溶液、阴性对照液和梯度浓缩系数的样品，将96孔板至于通风橱中15～20min后迅速在每孔加入已知量发光菌工作液，室温静置15～20min，酶标仪检测每孔发光量(RLU)；
(d)毒性表征：根据式(1)计算各梯度浓度参照化合物和梯度浓缩系数样品的发光度抑制率IR，分别拟合参照化合物浓度和样品浓缩系数的剂量-效应曲线，获得产生x％抑制率时参照化合物的浓度和产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数，根据式(2)计算样品毒性当量(TEQ)，样品毒性当量是将样品的急性毒性折算成产生同样急性毒性的参照化合物的浓度：
其中，ECx参照化合物(以浓度表示)为产生x％抑制率时参照化合物的浓度，ECx样品(以相对浓缩系数表示)为产生x％抑制率时样品的相对浓缩系数。
2.根据权利要求1所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述步骤(a)中水样的浓缩倍数不小于20倍。
3.根据权利要求2中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述萃取处理包括液-液萃取或固相萃取。
4.根据权利要求3中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述水样的液-液萃取方法可采用二氯甲烷或乙酸乙酯提取水样中有机物。
5.根据权利要求3中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述固相萃取方法可采用Oasis HLB或C18固相萃取柱萃取水样，并用甲醇或乙酸乙酯洗脱。
6.根据权利要求1-5中任一所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述步骤(b)中培养指活化后的发光菌单菌落接种至发光菌液体培养基中20～25℃培养10～15h。
7.根据权利要求6中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述步骤(b)中发光菌为明亮发光菌。
8.根据权利要求6或7中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的参照化合物为氯化汞，氯化汞溶于甲醇中，其梯度溶液的浓度范围为0.2～2.4mg/L；阴性对照液为甲醇。
9.根据权利要求8中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述步骤(c)中的参照化合物、阴性对照、样品的加样体积均为10μL，样品的加样体积不足10μL时用甲醇补足。
10.根据权利要求9中所述的高通量快速检测水样急性毒性的方法，其特征在于，所述方法还包括水样急性毒性级别评估体系：
a)TEQ≥0.07mg/L，其毒性等级为高毒；
b)0.007mg/L≤TEQ<0.07mg/L，其毒性等级为低毒；
c)TEQ<0.007mg/L，其毒性等级为无毒。
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