CN109187510B - 一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法 - Google Patents

一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及文物检测领域，公布了一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法。本发明先制备了硒化镉/硫化锌量子点珠，标记在修饰了铂的氧化石墨烯上，继而再吸附上羊毛角蛋白抗体形成探针后分别与修饰在工作电极的文物样和羊毛角蛋白孵育一段时间后，可根据电化学扫描下得到的荧光信号判断文物样是否为羊毛织品。本发明具有直观、准确、灵敏性高的特点。

Description

一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法
技术领域
本发明涉及文物检测领域，尤其涉及一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法。
背景技术
中国自古以来就是纺织品大国，生产的纺织品种类丰富，工艺精美，舒适透气。中国古代毛织物是主要以羊毛为原料织成的纺织物，羊毛的蛋白质含量大约为99%，羊毛角蛋白由18种氨基酸组成，其中胱氨酸残基占12%。易受光、热、酸碱、微生物等的影响发生降解，从而造成结晶度、分子量等结构及性能的变化，所以常规的检测方法灵敏度低，受杂质干扰影响大，不适合对文物进行检测，因此需要开发一种灵敏度好，特异性强的检测毛织品文物的方法。
电化学发光分析法具有灵敏度高、仪器设备简单、操作方便、易于实现自动化等特点，广泛地应用于生物、医学、药学、临床、环境、食品、免疫和核酸杂交分析和工业分析等领域。在21世纪中必将继续为解决人类面临的各种重大问题发挥更加显著的作用。但是，由于本发明所要检测的为毛纺织品文物，与常规的检测样不同，因此有必要专门针对毛织品文物这一特殊对象来对电化学发光法进行改进。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法。本发明首创性地将电化学发光技术应用于文物检测，并且本发明针对毛织品文物样这一特殊的检测对象，对工艺进行了诸多改进。利用本发明方法对古代毛织品进行检测，具有直观、准确、灵敏度高的特点。
本发明的具体技术方案为：一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，以µg、mg、g和µl、mL计，包括以下步骤：
A)称取8-12mg硒化镉/硫化锌量子点，58-62mg聚甲基丙烯酸甲酯，38-42mg聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入至0.8-1.2ml的氯仿中，与4.5-5.5ml浓度为1-2mg/ml的十二烷基苯磺酸钠水溶液混合，超声波均化处理，再将氯仿蒸发，将所得水溶性量子点珠离心纯化，用去离子水清洗2-4次。
本发明制备的水溶性量子点珠包含多个硒化镉/硫化锌量子点，发光强度是单个硒化镉/硫化锌量子点的几千倍，在检测过程中起到荧光信号放大的作用，增大检测的灵敏度。
B)称取步骤A）所得水溶性量子点珠0.2-0.22mg，加入1.8-2.2µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1.2-1.4µg的N-羟基琥珀酰亚胺，2.6-2.8ml的PBS 7.4缓冲液，反应1.5-2.5h。
C)将氧化石墨烯溶液与六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入硼氢化钠反应后，离心，用去离子水洗涤，烘干。
D)向浓度为0.08-0.12wt%的步骤C)中所得产物的水溶液中加入浓度为0.03-0.05wt%的氢氧化钠溶液，超声分散2-4h，加入盐酸调节pH为6.8-7.2，用去离子水离心洗涤，将所得产物用去离子水分散至浓度为0.08-0.12wt%，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐至浓度为0.3-0.5wt%，滴入三乙烯四胺至浓度为0.4-0.6%，超声分散3-7min，室温下搅拌反应20-30h，透析烘干。
E)向步骤B）所得的混合溶液中加入8-12µl的2mg/ml的步骤D）所得的产物，反应1.5-2.5h后，离心除去上清液，加入8-12µl稀释至1000倍的羊毛角蛋白抗体，在1-5℃环境下孵育过夜，加入8-12µl的1wt%牛血清蛋白孵育1-3h后，将溶液离心浓缩至5µl。
本发明将具有优秀的催化性能的铂修饰于氧化石墨烯表面，更可以催化量子点珠的发光，放大电化学发光信号。本发明制备所得的石墨烯具有良好的生物相容性，较大的比表面积和良好的吸附性能，是一种理想的固定量子点珠和抗体的载体，可以放大电化学发光信号，提高检测的灵敏度。
F)称取8-12g羊毛添加至180-200ml乙醇中，在35-45℃下搅拌1-3h后，用去离子水冲洗3-5次烘干。
G)取4-6g烘干的羊毛以1：18-20 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1-1.4g亚硫酸钠，在55-65℃下反应25-35min，用去离子水冲洗3-5次烘干。
本发明使用亚硫酸钠对羊毛进行还原预处理，破坏鳞片层，为后续的羊毛溶解打开通道。
H)取13-17wt%的硫酸铜溶液加入到13-17wt%的氢氧化钠溶液中，直至完全沉淀，使氢氧化钠稍过量，用去离子水清洗沉淀3-5次并抽滤3次，得到氢氧化铜沉淀。
I)取氢氧化铜沉淀13-17g，加入18-22ml去离子水，在16-18℃下缓慢加入无水乙二胺，同时用玻璃棒搅拌，直至沉淀完全溶解，得到铜乙二胺溶液。
J)将经步骤G）中处理后的羊毛放入45-55ml铜离子浓度为1.4-1.6mol/L的铜乙二胺溶液中，在50-60℃下溶解1-1.5h后冷却至室温过滤。
K)将步骤J）中过滤所得溶液装入透析袋透析，冷冻干燥，对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白。
L)取10µl浓度为2-3g/ml的壳聚糖溶液滴在抛光好的玻碳电极1和2上，晾干后滴加10µl 1.8-2.2µl的2%戊二酮溶液，室温孵育1-3h，在电极1上滴加20ul用CB9.6缓冲液稀释的100µg/ml羊毛角蛋白作为对照，在电极2上滴加20ul经处理后的文物样，在1-5℃冰箱里包被过夜，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗3-5遍，电极1，2上滴加28-32ul的1wt%牛血清蛋白，室温孵育1-3h，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗3-5遍。
本发明中使用的壳聚糖具有良好的生物相容性，是一种很好的抗原载体。
M)取步骤E）所得的5µl浓缩液分别滴加至经步骤L)中处理的电极1，2上，在室温下孵育0.5-1.5h，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗3-5遍，晾干。
N)将步骤M） 中处理的电极置于含有0.1M过硫酸钾和0.1M氯化钾的PBS 7.4缓冲液中进行电化学扫描，得到电化学发光信号；若两电极均有发光信号，则判定文物样中有羊毛，若只有电极1有发光信号，则判定文物样中无羊毛。
本发明先制备了硒化镉/硫化锌量子点珠，标记在修饰了铂的氧化石墨烯上，继而再吸附上羊毛角蛋白抗体形成探针后分别与修饰在工作电极的文物样和羊毛角蛋白孵育一段时间后，可根据电化学扫描下得到的荧光信号判断文物样是否为羊毛织品。本发明具有直观、准确、灵敏性高的特点。
作为优选，步骤A）中，离心速率为8000-12000rpm，离心时间为8-12min。
作为优选，步骤C）具体为：取4ml的0.2-0.3 mg/ml 氧化石墨烯溶液与180µl-220µl的1mM六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入0.8-1.2mg的硼氢化钠反应1h后，离心，使用去离子水洗涤2-4次，烘干。
作为优选，步骤E）中，羊毛角蛋白抗体用1wt%的牛血清蛋白进行稀释。
作为优选，步骤K）中，所得溶液用截留分子量为3500-4000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔5-7h换一次水，然后在真空冷冻干燥2-3天。
作为优选，步骤L）中，所述文物样的处理方法为：取0.02-0.2g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：
(1)本发明制备的量子点珠包含多个硒化镉/硫化锌量子点，发光强度是单个硒化镉/硫化锌量子点的几千倍，在检测过程中起到荧光信号放大的作用，增大检测的灵敏度。
(2)本发明使用的石墨烯具有良好的生物相容性，较大的比表面积和良好的吸附性能，是一种理想的固定量子点珠和抗体的载体，可以放大电化学发光信号，提高检测的灵敏度。铂有优秀的催化性能，将其修饰与氧化石墨烯表面，更可以催化量子点珠的发光，放大电化学发光信号。
(3)本发明使用亚硫酸钠对羊毛进行还原预处理，破坏鳞片层，为后续的羊毛溶解打开通道，增大羊毛角蛋白的提取率。
(4)本发明样品用量少，可以直观、准确、高灵敏性地检测出古代毛织品。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1：
A)称取10mg硒化镉/硫化锌量子点，58mg聚甲基丙烯酸甲酯，38mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入0.8ml的氯仿中，与4.5ml的1.5mg/ml的十二烷基苯磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为8000rpm，离心时间为8min，用去离子水清洗2次。
B)称取步骤A）中量子点珠0.2mg，加入1.8µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1.2µg N-羟基琥珀酰亚胺，2.6ml的PBS 7.4缓冲液，反应2h。
C)取4ml的0.2 mg/ml 氧化石墨烯溶液与180µl的1mM六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入0.8mg的硼氢化钠反应1h后，离心，使用去离子水洗涤2次，烘干。
D)向质量分数为0.1%的步骤C)中所得产物水溶液加入质量分数为0.04%的氢氧化钠溶液，超声分散3h后，加入盐酸调节pH为7.0后用去离子水离心洗涤，将所得产物用去离子水分散至质量分数0.1%，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐至质量分数为0.4%，滴入三乙烯四胺至质量分数为0.5%，超声分散5min，室温下搅拌反应24h，透析烘干。
E)往步骤B）中的混合溶液中加入8µl 2mg/ml的步骤D）处理后的产物，反应2h后，离心除去上清液，加入8µl用1wt%牛血清蛋白稀释到1000倍的羊毛角蛋白抗体，在4℃环境下孵育过夜，加入8µl的1wt%牛血清蛋白孵育2h后，将混合溶液离心浓缩至5µl。
F)称取8g羊毛添加至180ml乙醇中，在40℃下搅拌2h后，用去离子水冲洗3次烘干。
G)取5g步骤F)中烘干的羊毛以1：18 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1g亚硫酸钠，在60℃下反应25min，用去离子水冲洗3次烘干。
H)取适量15%硫酸铜溶液加入15%氢氧化钠溶液，直至完全沉淀，氢氧化钠稍微过量，用去离子水清洗沉淀3次并抽滤3次，得到氢氧化铜沉淀。
I)取步骤H）中的氢氧化铜15g，加入18ml去离子水，在16℃下缓慢加入无水乙二胺，同时用玻璃棒搅拌，直至沉淀完全溶解，得到铜乙二胺溶液。
J)将经步骤G）中处理后的羊毛放入45ml铜离子浓度为1.4mol/L的铜乙二胺溶液中，在50℃下溶解1h后冷却至室温过滤。
K)将步骤J）中过滤所得溶液置于截留分子量为3500的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔5h换一次水，将羊毛角蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥2天，对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白。
L)取10µl 2g/ml的壳聚糖滴在抛光好的玻碳电极上1，2晾干后滴加1.8µl的2%戊二酮，室温孵育两小时，在电极1上滴加20ul用CB9.6缓冲液稀释的100µg/ml羊毛角蛋白作为对照，在电极2上滴加20ul经处理后的文物样，在4℃冰箱里包被过夜，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗3-5遍，电极1，2上滴加28ul的1wt%牛血清蛋白，室温孵育2h，干燥后用PBS7.4缓冲液缓慢冲洗3-5遍。
其中，文物样的处理：取0.02g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
M)将步骤E）中的5µl浓缩液分别滴加至经步骤L)中处理的电极1，2后在室温下孵育1h，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗3遍，晾干。
N)将步骤M） 中处理的电极置于含有0.1M过硫酸钾和0.1M氯化钾的PBS 7.4缓冲液中进行电化学扫描，得到电化学发光信号。如果两电极都有发光信号说明，文物样中有羊毛，如果只有电极1有发光信号说明文物样中无羊毛。
其中PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
CB 9.6缓冲液配制：称取1.5 g碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至9.6。
实施例2：
A)称取10mg硒化镉/硫化锌量子点，60mg聚甲基丙烯酸甲酯，40mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入1ml的氯仿中，与5ml的1.5mg/ml的十二烷基苯磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为10000rpm，离心时间为10min，用去离子水清洗3次。
B)称取步骤A）中量子点珠0.21mg，加入2 µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1.3 µg N-羟基琥珀酰亚胺，2.7ml的PBS 7.4缓冲液，反应2h。
C)取4ml的0.25 mg/ml 氧化石墨烯溶液与200µl的1mM六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入1mg的硼氢化钠反应1h后，离心，使用去离子水洗涤3次，烘干。
D)向质量分数为0.1%的步骤C)中所得产物水溶液加入质量分数为0.04%的氢氧化钠溶液，超声分散3h后，加入盐酸调节pH为7.0后用去离子水离心洗涤，将所得产物用去离子水分散至质量分数0.1%，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐至质量分数为0.4%，滴入三乙烯四胺至质量分数为0.5%，超声分散5min，室温下搅拌反应24h，透析烘干。
E)往步骤B）中的混合溶液中加入10µl 2mg/ml的步骤D）处理后的产物，反应2h后，离心除去上清液，加入10µl用1wt%牛血清蛋白稀释到1000倍的羊毛角蛋白抗体，在4℃环境下孵育过夜，加入10µl的1wt%牛血清蛋白孵育2h后，将混合溶液离心浓缩至5µl。
F)称取10g羊毛添加至190ml乙醇中，在40℃下搅拌2h后，用去离子水冲洗4次烘干。
G)取5g步骤F)中烘干的羊毛以1：19 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1.2g亚硫酸钠，在60℃下反应30min，用去离子水冲洗4次烘干。
H)取适量15%硫酸铜溶液加入15%氢氧化钠溶液，直至完全沉淀，氢氧化钠稍微过量，用去离子水清洗沉淀4次并抽滤3次，得到氢氧化铜沉淀。
I)取步骤H）中的氢氧化铜15g，加入20ml去离子水，在17℃下缓慢加入无水乙二胺，同时用玻璃棒搅拌，直至沉淀完全溶解，得到铜乙二胺溶液。
J)将经步骤G）中处理后的羊毛放入50ml铜离子浓度为1.5mol/L的铜乙二胺溶液中，在55℃下溶解1.25h后冷却至室温过滤。
K)将步骤J）中过滤所得溶液置于截留分子量为3500的纤维素透析袋在去离子水中透析2天，并每隔5h换一次水，将羊毛角蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥2天，对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白。
L)取10µl 2.5g/ml的壳聚糖滴在抛光好的玻碳电极上1，2晾干后滴加2µl的2%戊二酮，室温孵育两小时，在电极1上滴加20ul用CB9.6缓冲液稀释的100µg/ml羊毛角蛋白作为对照，在电极2上滴加20ul经处理后的文物样，在4℃冰箱里包被过夜，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗4遍，电极1，2上滴加30ul的1wt%牛血清蛋白，室温孵育2h，干燥后用PBS7.4缓冲液缓慢冲洗4遍。
其中，文物样的处理：取0.11g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
M)将步骤E）中的5µl浓缩液分别滴加至经步骤L)中处理的电极1，2后在室温下孵育1h，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗4遍，晾干。
N)将步骤M） 中处理的电极置于含有0.1M过硫酸钾和0.1M氯化钾的PBS 7.4缓冲液中进行电化学扫描，得到电化学发光信号。如果两电极都有发光信号说明，文物样中有羊毛，如果只有电极1有发光信号说明文物样中无羊毛。
其中PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
CB 9.6缓冲液配制：称取1.5 g碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至9.6。
实施例3：
A)称取10mg硒化镉/硫化锌量子点，62mg聚甲基丙烯酸甲酯， 42mg的聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入1.2ml的氯仿中，与5.5ml的1.5mg/ml的十二烷基苯磺酸钠水溶液混合后用超声波均化器处理，之后再将氯仿蒸发。然后将所得水溶性量子点珠离心纯化，离心速率为12000rpm，离心时间为12min，用去离子水清洗4次。
B)称取步骤A）中量子点珠0.22mg，加入2.2 µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1.4 µg N-羟基琥珀酰亚胺， 2.8ml的PBS 7.4缓冲液，反应2h。
C)取4ml的0.3 mg/ml 氧化石墨烯溶液与220µl的1mM六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入1.2mg的硼氢化钠反应1h后，离心，使用去离子水洗涤4次，烘干。
D)向质量分数为0.1%的步骤C)中所得产物水溶液加入质量分数为0.04%的氢氧化钠溶液，超声分散3h后，加入盐酸调节pH为7.0后用去离子水离心洗涤，将所得产物用去离子水分散至质量分数0.1%，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐至质量分数为0.4%，滴入三乙烯四胺至质量分数为0.5%，超声分散5min，室温下搅拌反应24h，透析烘干。
E)往步骤B）中的混合溶液中加入12µl 2mg/ml的步骤D）处理后的产物，反应2h后，离心除去上清液，加入12µl用1wt%牛血清蛋白稀释到1000倍的羊毛角蛋白抗体，在4℃环境下孵育过夜，加入12µl的1wt%牛血清蛋白孵育2h后，将混合溶液离心浓缩至5µl。
F)称取12g羊毛添加至200ml乙醇中，在40℃下搅拌2h后，用去离子水冲洗5次烘干。
G)取5g步骤F)中烘干的羊毛以1： 20 的浴比添加至CB 9.6缓冲液中，加入1.4g亚硫酸钠，在60℃下反应35min，用去离子水冲洗5次烘干。
H)取适量15%硫酸铜溶液加入15%氢氧化钠溶液，直至完全沉淀，氢氧化钠稍微过量，用去离子水清洗沉淀5次并抽滤3次，得到氢氧化铜沉淀。
I)取步骤H）中的氢氧化铜15g，加入22ml去离子水，在18℃下缓慢加入无水乙二胺，同时用玻璃棒搅拌，直至沉淀完全溶解，得到铜乙二胺溶液。
J)将经步骤G）中处理后的羊毛放入55ml铜离子浓度为1.6mol/L的铜乙二胺溶液中，在60℃下溶解1.5h后冷却至室温过滤；
K)将步骤J）中过滤所得溶液置于截留分子量为4000的纤维素透析袋在去离子水中透析3天，并每隔7h换一次水，将羊毛角蛋白溶液在真空冷冻干燥机中冷冻干燥3天，对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白。
L)取10µl 3g/ml的壳聚糖滴在抛光好的玻碳电极上1，2晾干后滴加10µl 2.2µl的2%戊二酮，室温孵育两小时，在电极1上滴加20ul用CB9.6缓冲液稀释的100µg/ml羊毛角蛋白作为对照，在电极2上滴加20ul经处理后的文物样，在4℃冰箱里包被过夜，干燥后用PBS7.4缓冲液缓慢冲洗5遍，电极1，2上滴加32ul的1wt%牛血清蛋白，室温孵育2h，干燥后用PBS7.4缓冲液缓慢冲洗5遍；
其中，文物样的处理：取0.2g文物样溶解于100mlCB 9.6缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
M)将步骤E）中的5µl浓缩液分别滴加至经步骤L)中处理的电极1，2后在室温下孵育1h，干燥后用PBS 7.4缓冲液缓慢冲洗5遍，晾干。
N)将步骤M） 中处理的电极置于含有0.1M过硫酸钾和0.1M氯化钾的PBS 7.4缓冲液中进行电化学扫描，得到电化学发光信号。如果两电极都有发光信号说明，文物样中有羊毛，如果只有电极1有发光信号说明文物样中无羊毛。
其中PBS 7.4缓冲液的配制：称取0.2 g 氯化钾，0.27 g磷酸二氢钾，8 g氯化钠和1.42 g磷酸氢二钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至7.4。
CB 9.6缓冲液配制：称取1.5 g碳酸钠和2.9 g碳酸氢钠加入到800 mL 去离子水中均匀搅拌直至完全溶解后用容量瓶定容至1000 mL，调节溶液的pH至9.6。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (6)

1.一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，以µg、mg、g和µl、mL计，包括以下步骤：
A)称取8-12mg硒化镉/硫化锌量子点，58-62mg聚甲基丙烯酸甲酯，38-42mg聚马来酸酐-十八烯共聚物，加入至0.8-1.2ml的氯仿中，与4.5-5.5ml浓度为1-2mg/ml的十二烷基苯磺酸钠水溶液混合，超声波均化处理，再将氯仿蒸发，将所得水溶性量子点珠离心纯化，用去离子水清洗2-4次；
B)称取步骤A）所得水溶性量子点珠0.2-0.22mg，加入1.8-2.2µg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1.2-1.4µg的N-羟基琥珀酰亚胺，2.6-2.8ml的pH=7.4的PBS缓冲液，反应1.5-2.5h；
C)将氧化石墨烯溶液与六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入硼氢化钠反应后，离心，用去离子水洗涤，烘干；
D)向浓度为0.08-0.12wt%的步骤C)中所得产物的水溶液中加入浓度为0.03-0.05wt%的氢氧化钠溶液，超声分散2-4h，加入盐酸调节pH为6.8-7.2，用去离子水离心洗涤，将所得产物用去离子水分散至浓度为0.08-0.12wt%，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐至浓度为0.3-0.5wt%，滴入三乙烯四胺至浓度为0.4-0.6%，超声分散3-7min，室温下搅拌反应20-30h，透析烘干；
E)向步骤B）所得的混合溶液中加入8-12µl的2mg/ml的步骤D）所得的产物，反应1.5-2.5h后，离心除去上清液，加入8-12µl稀释至1000倍的羊毛角蛋白抗体，在1-5℃环境下孵育过夜，加入8-12µl的1wt%牛血清蛋白孵育1-3h后，将溶液离心浓缩至5µl；
F)称取8-12g羊毛添加至180-200ml乙醇中，在35-45℃下搅拌1-3h后，用去离子水冲洗3-5次烘干；
G)取4-6g烘干的羊毛以1：18-20 的浴比添加至pH=9.6的CB缓冲液中，加入1-1.4g亚硫酸钠，在55-65℃下反应25-35min，用去离子水冲洗3-5次烘干；
H)取13-17wt%的硫酸铜溶液加入到13-17wt%的氢氧化钠溶液中，直至完全沉淀，使氢氧化钠稍过量，用去离子水清洗沉淀3-5次并抽滤3次，得到氢氧化铜沉淀；
I)取氢氧化铜沉淀13-17g，加入18-22ml去离子水，在16-18℃下缓慢加入无水乙二胺，同时用玻璃棒搅拌，直至沉淀完全溶解，得到铜乙二胺溶液；
J)将经步骤G）中处理后的羊毛放入45-55ml铜离子浓度为1.4-1.6mol/L的铜乙二胺溶液中，在50-60℃下溶解1-1.5h后冷却至室温过滤；
K)将步骤J）中过滤所得溶液装入透析袋透析，冷冻干燥，对干燥后的样品进行研磨，得到羊毛角蛋白；
L)取10µl浓度为2-3g/ml的壳聚糖溶液滴在抛光好的玻碳电极1和2上，晾干后滴加10µl 1.8-2.2µl的2%戊二酮溶液，室温孵育1-3h，在电极1上滴加20ul用pH=9.6的CB缓冲液稀释的100µg/ml羊毛角蛋白作为对照，在电极2上滴加20ul经处理后的文物样，在1-5℃冰箱里包被过夜，干燥后用pH=7.4的PBS缓冲液缓慢冲洗3-5遍，电极1，2上滴加28-32ul的1wt%牛血清蛋白，室温孵育1-3h，干燥后用pH=7.4的PBS缓冲液缓慢冲洗3-5遍；
M)取步骤E）所得的5µl浓缩液分别滴加至经步骤L)中处理的电极1，2上，在室温下孵育0.5-1.5h，干燥后用pH=7.4的PBS缓冲液缓慢冲洗3-5遍，晾干；
N)将步骤M） 中处理的电极置于含有0.1M过硫酸钾和0.1M氯化钾的pH=7.4的PBS缓冲液中进行电化学扫描，得到电化学发光信号；若两电极均有发光信号，则判定文物样中有羊毛，若只有电极1有发光信号，则判定文物样中无羊毛。
2.如权利要求1所述的一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，步骤A）中，离心速率为8000-12000rpm，离心时间为8-12min。
3.如权利要求1所述的一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，步骤C）具体为：取4ml的0.2-0.3 mg/ml 氧化石墨烯溶液与180µl-220µl的1mM六氯合铂酸钠溶液混合，在冰水浴中反应，然后在剧烈搅拌下，加入0.8-1.2mg的硼氢化钠反应1h后，离心，使用去离子水洗涤2-4次，烘干。
4.如权利要求1所述的一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，步骤E）中，羊毛角蛋白抗体用1wt%的牛血清蛋白进行稀释。
5.如权利要求1所述的一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，步骤K）中，所得溶液用截留分子量为3500-4000的纤维素透析袋在去离子水中透析2-3天，并每隔5-7h换一次水，然后真空冷冻干燥2-3天。
6.如权利要求1所述的一种基于电化学发光法检测古代毛织品的方法，其特征在于，步骤L）中，所述文物样的处理方法为：取0.02-0.2g文物样溶解于100ml pH=9.6的CB缓冲液，混合搅拌均匀，静置，取上清液。
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