CN114814215B - 基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条 - Google Patents

基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条 Download PDF

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Abstract

本发明公开了基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条，属于生物检测技术领域。本发明使用的试纸条含有基于SARS‑CoV‑2‑核衣壳蛋白的指数富集的核酸适体系统进化技术所获得多条序列不同的核酸适体，能够高效、准确地检测样品中是否含有SARS‑CoV‑2。本发明试纸条包括硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸，生产和组装简单，并且检测速度快，检测准确度高，适合大范围检测使用。

Description

基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条。
背景技术
新冠病毒抗原检测跟病毒核酸检测一样，都是通过检测病毒的组分来判定是否存在新冠病毒。新冠病毒颗粒中，特异性结构蛋白含量是病毒核酸分子的数千倍。新冠抗原检测法直接检测新冠病毒的结构蛋白，不存在扩增放大过程，省去了核酸检测过程中占据时间较长的扩增步骤，所以具有快速、简单、便捷、经济、早期诊断、可信度高等特点。目前，新冠病毒抗原检测主要使用可以特异性结合新冠结构蛋白的抗体来制备抗体夹心法试剂盒。但是由于新冠病毒变异迅速，而新冠结构蛋白的特异性抗体的筛选过程较为繁杂漫长，新冠病毒抗原检测试剂盒还存在极大的提升空间。
核酸适体（aptamer）是指通过指数富集的配基系统进化技术（SELEX）筛选分离得到的DNA或者RNA分子，它可以与其它靶标如蛋白质、金属离子、小分子、多肽甚至整个细胞进行高亲和力和特异性的结合，因此在生化分析、环境监测、基础学、新药合成等方面展示广阔的前景。相比于抗体，核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，核酸适体可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。
新型冠状病毒核衣壳蛋白的核酸适体具有结构相对稳定，简单，易于修饰以及短期内可以人工合成的优势。目前，已有报道核酸适体与抗体的混合夹心法检测新型冠状病毒核衣壳蛋白，但是，实现高灵敏度、高特异性仍存在市场需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一种基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条，该试纸条能够迅速。准确地检测与识别SARS-CoV-2。
为达到上述发明目的，采用如下技术方案。
一种基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条，包括：硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸；其中，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线，检测线所使用的抗体包括SARS-CoV-2-核衣壳蛋白抗体，质控线所使用的抗体包括抗链霉亲和素抗体；结合垫上含有核酸适体-乳胶颗粒偶联物。本发明试纸条是制备和组装均易操作，有利于大规模生产。
优选地，核酸适体包括如下序列：
如SEQIDNO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQIDNO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
本发明利用基于SARS-CoV-2-核衣壳蛋白的指数富集的核酸适体系统进化技术所获得多条序列不同的核酸适体，通过对核衣壳蛋白不同位点的特异性识别结合，从而选择最优的组合，实现对SARS-CoV-2-核衣壳蛋白的检测。
优选地，上述核酸适体具有修饰，所述修饰包括但不限于：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、生物素修饰、荧光标记物修饰、放射性同位素修饰。
优选地，试纸条检测线抗体浓度为0.5-2 mg/mL。
优选地，试纸条质控线抗体浓度为0.5-1.5 mg/mL。
优选地，核酸适体-乳胶颗粒偶联物的浓度为0.1-1%，喷涂量为1-10 μL/cm。
优选地，核酸适体-乳胶颗粒偶联物中，乳胶颗粒含有链霉亲和素修饰。
优选地，核酸适体-乳胶颗粒偶联物中，包括核酸适体组合N35/N10/N2-62/N2。
优选地，试纸条的制备方法包括如下步骤：
预处理；喷涂；划膜；组合。
更优选地，预处理包括如下步骤：
样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置10-40 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置10-40 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
抗体透析：将蛋白质稀释到一定浓度装入透析袋中依次放入低浓度溶液（0.005-0.008 mol/L NaCl pH 7.0）和三蒸水中透析。
更进一步优选地，样品垫处理液pH为8.0-9.0，含0.05-1 M Tris-HCl，0.5%-1%PVP，0.5%-1PEG，0.2%-5% BSA。
更进一步优选地，结合垫处理液pH为7.0-8.0，含0.1-0.2 M Tris-HCl缓冲液，1%-5% BSA，0.5%-1% PVP，0.5%-2% PEG，5%-20% 蔗糖。
更进一步优选地，喷涂包括如下步骤：
将质量分数为0.5-0.8%核酸适体-乳胶颗粒偶联物通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，喷量为4-8 μL/cm。
更优选地，划膜包括如下步骤：
将试纸条置于划膜机合适的位置，制备检测线和质控线的抗体溶液，检测线和质控线所用抗体浓度为0.5-2 mg/mL。
更优选地，组合包括如下步骤：
将硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸组装到PVC板上。
更优选地，试纸条的使用方法包括如下步骤：
取待测样品滴加与样品垫；等待15min后进行结果判读。
更优选地，使用试纸条进行检测时的判读标准为：
阳性(+)：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在SARS-CoV-2；
阴性(-)：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有SARS-CoV-2；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
本发明试纸条的使用和检测方法简单，不需要专业技术人员和实验室，因此使用本发明试纸条进行检测更加方便快速。
更优选地，乳胶颗粒偶联核酸适体的方法包括：
混合标记：不同的核酸适体序列偶联至同一个乳胶颗粒标表面；或，
单一标记：同一种核酸适体序列偶联至同一个乳胶颗粒标表面。
更进一步优选地，乳胶颗粒标记的核酸适体通过如下步骤制得：
将链霉素修饰的乳胶颗粒与生物素修饰的核酸适体进行交联，将交联产物通过离心法除去上清液中未结合到乳胶颗粒表面的核酸适体即得乳胶颗粒标记的核酸适体。
更进一步优选地，交联的条件为室温振荡0.5-2.5 h。
更进一步优选地，交联产物离心的条件为2-4 ℃，10000-12000 rpm，5-15 min。
本发明还公开了上述核酸适体在鉴别SARS-CoV-2中的用途。
相比于抗体，核酸适体更加适合鉴别和检测SARS-CoV-2。核酸适体具有分子量小，稳定性更好，易改造修饰，无免疫原性，制作周期短等特点，核酸适体可以通过人工合成等优势，免去了动物免疫、饲养、蛋白提取和纯化等一系列流程。
优选地，核酸适体能够特异性识别并结合SARS-CoV-2的核衣壳蛋白。
核衣壳蛋白是冠状病毒中含量最丰富的蛋白。核衣壳蛋白是一种具有高度免疫原性的磷蛋白，基因序列非常保守。冠状病毒的核衣壳蛋白通常被用作诊断检测标志物。
本发明还公开了一种鉴别SARS-CoV-2的试剂盒，包括上述核酸适体。
优选地，试剂盒最低检出限为10 pg/mL。
核酸适体与抗体的混合夹心策略利用核酸适体分子量小的特征，对靶蛋白的结合更方便，同时可以利用多个核酸适体靶向病毒的多个位点来提高与靶蛋白的结合能力，从而提高灵敏度和检出率。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明试纸条使用核酸适体-抗体的混合夹心的方式制备，使用核酸适体代替传统双抗夹心法中的检测抗体，能够避免与捕获抗体发生交互反应或竞争相同的抗原结合部位，使检测更加准确、灵敏、高效。并且，本发明试纸条的使用和检测方法简单，不需要专业技术人员和实验室，因此使用本发明试纸条进行检测更加方便快速。此外，本发明试纸条能够准确识别SARS-CoV及其突变，突变包括Omicron，D63G-R203M-D377Y三位点突变型；试纸条的检测线限为10 pg/mL，灵敏度高。
附图说明
图1为本发明试纸条检测原理图；
图2为核酸适体-乳胶颗粒偶联物电镜观察结果；
图3为本发明试纸条对不同浓度N蛋白检测结果；
图4为本发明试纸条与商业化试纸条对比的检测结果。
具体实施方式
这里将详细地对示例性实施例进行说明，以下示例性实施例中所描述的实施方式并不代表与本公开相一致的所有实施方式。相反，它们仅是与如所附权利要求书中所详述的、本公开的一些方面相一致的方法的例子。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，或按照制造厂商所建议的条件。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
乳胶颗粒-核酸适体偶联物的制备
准备核酸适体：
如SEQIDNO.1所示序列N35：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG；
如SEQIDNO.2所示序列N10：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.3所示序列N2-62：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
如SEQIDNO.4所示序列N2：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
将上述核酸适体交由上海生工进行合成，并且合成带有生物素的核酸适体。
将链霉亲和素（SA）修饰的乳胶颗粒（质量分数1%，杭州优思达提供）用超纯水稀释一倍至质量分数为0.5%；然后，向质量分数为0.5%的SA修饰的乳胶颗粒加入4倍过量生物素修饰的核酸适体进行交联，交联条件为室温震荡1 h；
将所得到的交联产物通过离心法除去上清液中未结合到乳胶颗粒表面的核酸适体序列，离心条件为4℃，10000 rpm，10 min；然后通过离心法用超纯水洗涤交联产物两次，最终用50 μL的点胶液定容待后备用；
按照上述操作方法，制备乳胶颗粒-核酸适体偶联物，当使用多条核酸适体与乳胶颗粒制备乳胶颗粒-核酸适体偶联物时，有如下标记方法：
1）混合标记，即不同的核酸适体序列标记至同一个乳胶颗粒标表面；
2）单一标记，即同一种核酸适体序列标记至同一个乳胶颗粒标表面，然后将不同的乳胶微球进行混合使用；
根据不同的标记方法以及不同的核酸适体，制备出不同的乳胶颗粒-核酸适体偶联物，偶联物的电镜照片如图2所示，该偶联物为表1中所示的偶联物15。
实施例2
试纸条的制备
1、预处理
按配方配制如下处理液：
样品垫处理液：1 M Tris-HCl缓冲液，1% PVP，1% PEG，5% BSA，pH为9.0；
结合垫处理液：0.2 M Tris-HCl缓冲液，5% BSA，1% PVP，2% PEG，20% 蔗糖，pH为8.0；
透析液：0.008 mol/L NaCl，pH 7.0；
配制完成后进行预处理：
样品垫处理：将玻璃纤维浸润在样品垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
结合垫处理：将玻璃纤维浸润在结合垫处理液中，静置30 min后取出，沥干水分，自然干燥后备用；
抗体透析：将抗体稀释后装入透析袋中依次放入透析液和三蒸水中透析12 h；
2、喷涂乳胶颗粒
将实施例2中制得的乳胶颗粒-核酸适体偶联物通过划膜机喷涂于预处理后的结合垫上，乳胶颗粒-核酸适体偶联物质量分数为0.5%，喷量为6 μL/cm；
3、划膜
使用划膜机进行划膜，检测线（T线）使用的抗体为：核衣壳蛋白抗体Cov6，浓度为2mg/mL；
质控线（C线）使用的抗体为：抗链霉亲和素抗体，浓度为1 mg /mL；
4、组合
依次将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸组装到PVC板上即得试纸条；
按照上述方法制备不同的试纸条，试纸条的检测原理如图1所示。
实施例1和2中制得的乳胶颗粒-核酸适体偶联物以及试纸如表1所示。
表1 乳胶颗粒-核酸适体偶联物以及试纸
试纸序号（同偶联物序号） 核酸适体组合 标记方法 试纸序号（同偶联物序号） 核酸适体组合 标记方法
1 N35 单一标记 14 N2/N2-62/N10 单一标记
2 N2 单一标记 15 N35/N2/N10/N2-62 单一标记
3 N10 单一标记 16 N35/N2 混合标记
4 N2-62 单一标记 17 N35/N2-62 混合标记
5 N35/N2 单一标记 18 N35/N10 混合标记
6 N35/N2-62 单一标记 19 N2/N2-62 混合标记
7 N35/N10 单一标记 20 N2/N10 混合标记
8 N2/N2-62 单一标记 21 N2-62/N10 混合标记
9 N2/N10 单一标记 22 N35/N2/N2-62 混合标记
10 N2-62/N10 单一标记 23 N35/N2/N10 混合标记
11 N35/N2/N2-62 单一标记 24 N35/N2-62/N10 混合标记
12 N35/N2/N10 单一标记 25 N2/N2-62/N10 混合标记
13 N35/N2-62/N10 单一标记 26 N35/N2/N10/N2-62 混合标记
试验例1
试纸条特异性和灵敏度检测
试纸条对N蛋白的检测
取SARS-CoV-2-核衣壳蛋白配制成10 pg/mL和100 pg/mL的标准液，用胶头滴管吸取标准液，滴3滴在样品垫上，滴加后静置15分钟后进行结果判读，判读标准：
阳性(+)：出现两条带，检测线和质控线，表示样本中存在SARS-CoV-2；
阴性(-)：仅质控线出现一条带，检测线无条带出现，表示样本中没有SARS-CoV-2；
无效：质控线未出现红色条带，可能是由于不正确的操作或试剂已失效，应重新测试。
通过上述方法测定实施例2中制得的所有试纸，为避免冗余，此处仅展示15号试纸的检测结果照片（见图3），其他检测结果由表2所示；由图3和表2中数据可见本发明所得试纸条能有效鉴别SARS-Cov-2-核衣壳蛋白，并且检测限不低于10 pg/mL。
此外，将15号试纸与部分商业化试纸进行对比，测定结果如图4所示。由图4可见本发明试纸条检测结果较优。
表2 试纸对N蛋白的检测结果
试纸序号 N蛋白（10 ng/mL） N蛋白（1 ng/mL） N蛋白（100 pg/mL） N蛋白（10 pg/mL） N蛋白（0）
1 + + + + -
2 + + + + -
3 + + + + -
4 + + + + -
5 + + + + -
6 + + + + -
7 + + + + -
8 + + + + -
9 + + + + -
10 + + + + -
11 + + + + -
12 + + + + -
13 + + + + -
14 + + + + -
15 + + + + -
16 + + + + -
17 + + + + -
18 + + + + -
19 + + + + -
20 + + + + -
21 + + + + -
22 + + + + -
23 + + + + -
24 + + + + -
25 + + + + -
26 + + + + -
本发明的操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院基础医学与肿瘤研究所（筹）
<120> 基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacgtcgggg gggtcacaca tgaaccgtgc ggatacggag acgag 45
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cgcctccttc ctctcggggt gtgtagggtc agggagtgtg agaggaggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 3
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgcctccttc cacgggatcg gattccccac tcggctctat cggattggag acgagatcgg 60
cg 62
<210> 4
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
cacgcatagc cgtgcggata cggaaccgta ccatgggcgg tgggtggcct atgcgtg 57

Claims (9)

1.一种非疾病的诊断和治疗目的、基于核酸适体乳胶颗粒的病原微生物检测试纸条，其特征在于，所述试纸条包括：硝酸纤维素膜、结合垫、样品垫和吸水纸；其中，硝酸纤维素膜上含有检测线和质控线，检测线所使用的抗体包括SARS-CoV-2-核衣壳蛋白抗体，质控线所使用的抗体包括抗链霉亲和素抗体；结合垫上含有核酸适体-乳胶颗粒偶联物；
其中，所述试纸条包括如下核酸适体：
N35，序列如SEQ ID NO.1所示：
CACGTCGGGGGGGTCACACATGAACCGTGCGGATACGGAGACGAG。
2.如权利要求1所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条还包括如下组合：
N35/N2；或
N35/N2-62；或
N35/N10；或
N35/N2/N2-62；或
N35/N2/N10；或
N35/N2-62/N10；或
N35/N10/N2-62/N2；
其中，N10序列如SEQ ID NO.2所示：
CGCCTCCTTCCTCTCGGGGTGTGTAGGGTCAGGGAGTGTGAGAGGAGGAGACGAGATCGGCG；
N2-62序列如SEQ ID NO.3所示：
CGCCTCCTTCCACGGGATCGGATTCCCCACTCGGCTCTATCGGATTGGAGACGAGATCGGCG；
N2序列如SEQ ID NO.4所示：
CACGCATAGCCGTGCGGATACGGAACCGTACCATGGGCGGTGGGTGGCCTATGCGTG。
3.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述核酸适体具有修饰，所述修饰包括：磷酸化、甲基化、氨基化、巯基化、生物素修饰、荧光标记物修饰或放射性同位素修饰。
4.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条检测线抗体浓度为0.5-2mg/mL。
5.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条质控线抗体浓度为0.5-1.5mg/mL。
6.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述核酸适体-乳胶颗粒偶联物的浓度为0.1-1%，喷涂量为1-10μL/cm。
7.如权利要求1或2所述的试纸条，其特征在于，所述核酸适体-乳胶颗粒偶联物中，乳胶颗粒含有链霉亲和素修饰。
8.一种非疾病的诊断和治疗目的、鉴别SARS-CoV-2的试剂盒，包括权利要求1或2所述试纸条。
9.如权利要求8所述试剂盒，其特征在于，所述试剂盒最低检出限为10 pg/mL。
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