CN111500780A

CN111500780A - 一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法

Info

Publication number: CN111500780A
Application number: CN202010384315.6A
Authority: CN
Inventors: 刘国东; 董超; 沈兵; 钱立生; 邱万伟; 黄守程; 李坤; 张静; 于庆才; 张学记
Original assignee: Anhui University of Science and Technology
Current assignee: Anhui University of Science and Technology
Priority date: 2020-05-07
Filing date: 2020-05-07
Publication date: 2020-08-07

Abstract

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法，属于病毒检测技术领域，所述试剂盒，包括重组酶聚合酶扩增检测体系和试纸条；所述重组酶聚合酶扩增检测体系包括扩增新型冠状病毒特异性基因的引物组；所述引物组中的上游引物包括第一延伸序列，所述引物组的下游引物包括第二延伸序列；所述试纸条的结合区吸附金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针；所述检测探针与所述第一延伸序列互补配对；所述试纸条的检测区包括检测线和质控线；所述检测线上喷涂捕获探针，所述质控线上喷涂质控探针；所述捕获探针与第二延伸序列互补配对；所述质控探针与检测探针互补配对。所述试剂盒操作简单，扩增结果可直接肉眼判读。

Description

一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法。

背景技术

呼吸道病毒感染是临床最为常见、影响面最大的一类病毒性感染疾病，例如冠状病毒、流感病毒、腺病毒等，它们对全球公共卫生安全构成了巨大威胁。准确快速的诊断呼吸道病毒感染的病原体对于合理治疗、挽救生命、控制疫情以及避免不必要的抗生素使用等方面具有重要意义。

传统的呼吸道病毒感染检测方法有病毒培养法和免疫荧光测定法，但这两种检测手段费时费力，并且灵敏度有限。除此之外，血清学方法常用来检测呼吸道病毒特异性抗体反应，包括血凝抑制试验(HAI)、病毒中和试验 (VN)、单扩溶血试验(SRH)、补体结合试验和酶联免疫吸附测定(ELISA)，但是这些方法通常灵敏度较低，而且免疫学方法通过检测抗体，无法分型具体病毒类型，不利于临床治疗。

因此，目前唯一能够在症状发作后的最初几个小时内检测感染的方法是基于分子生物学的核酸扩增技术。具体来说，人体在感染病毒后第3～5天开始病毒数量呈对数增加，可达到10⁴至10⁶拷贝/μL。核酸扩增技术的检测阈值为1到10拷贝/μL，因此在此期间可以发现病毒存在，从而能更早地在临床样本中发现病毒。核酸扩增技术检测方法通常包括多聚酶链反应(PCR)、逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)、DNA微阵列检测、二代测序等，这些技术通常具有较高的灵敏度和特异性，但是缺点是检测时间长、仪器昂贵、需要专业人员操作，因此，难以实现现场即时检测。

RNA病毒，业内统一采用的标准方法为RT-PCR，该方法包括 RNA提取，逆转录(RT)和PCR(实时聚合酶链式反应)，通过扩增病毒特异性基因从而对可疑病例进行确诊。但是，该方法需要设置具有检测资质的专门机构并配备实时荧光定量PCR设备，还需要专业技术人员进行样本核酸提取、试剂配置、上机操作和结果判读，最终才能出具可靠的结论性报告。因此，简单化、个体化的非依赖专业设备的即时医疗(POC)检测方案就显得非常重要。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法；所述试剂盒将重组酶聚合酶扩增技术和试纸条检测相结合，操作简单，无需专业设备和人员，扩增结果通过试纸可直接肉眼判读，根据说明书可进行检测；能够实现新型冠状病毒的快速检测。

为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括重组酶聚合酶扩增检测体系和试纸条；

所述重组酶聚合酶扩增检测体系包括扩增新型冠状病毒特异性基因的引物组；所述引物组中的上游引物包括第一延伸序列，所述引物组的下游引物包括第二延伸序列；

所述试纸条的结合区吸附金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针；所述检测探针与所述第一延伸序列互补配对；

所述试纸条的检测区包括检测线和质控线；所述检测线上喷涂捕获探针，所述质控线上喷涂质控探针；所述捕获探针与第二延伸序列互补配对；所述质控探针与检测探针互补配对。

优选的，所述新型冠状病毒特异性基因包括编码ORF1ab的基因和/或编码核壳蛋白N的基因。

优选的，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因时，所述引物组包括上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R；所述上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.3所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

优选的，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码核壳蛋白N的基因时，所述引物组包括上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R；所述上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

优选的，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因和编码核壳蛋白N的基因时，所述检测探针包括第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示；

所述检测线包括第一检测线和第二检测线；所述第一检测线和第二检测线上分别喷涂第一捕获探针和第二捕获探针；所述第一捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述第二捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述质控线上喷涂第一质控探针和第二质控探针；所述第一质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述第二质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

优选的，所述重组酶聚合酶扩增检测体系还包括RPA反应Mix和 MgOAc。

本发明提供了所述的试剂盒的制备方法，包括试纸条的制备：将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针吸附于结合垫，将捕获探针喷涂于检测区的检测线上、质控探针喷涂于检测区的质控线上；然后将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在底板上获得试纸条。

优选的，金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针的制备方法包括以下步骤：将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液依次与dATP、SDS、NaCl和检测探针混合后偶合获得。

优选的，所述偶合的温度为58～62℃，所述偶合的时间为2～4h。

优选的，所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针保存于纳米粒子存储液中。

本发明的有益效果：本发明提供的检测新型冠状病毒的试剂盒将重组酶聚合酶扩增技术和试纸条检测相结合，通过在重组酶聚合酶扩增引物上连接延伸序列，使得扩增获得的扩增两端有延伸序列；金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针以及捕获探针分别与扩增产物两端的延伸序列互补配对，当样本中含有新型冠状病毒2019-nCoV时，试纸条检测线上形成 SiO₂@Au-检测探针-DNA-捕获探针夹心式结构，从而显示出SiO₂@Au的颜色褐色，过量金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针在质控线上被捕获。因此，在样本中含有新型冠状病毒2019-nCoV时，检测线与质控线均显色；而当样本中没有新型冠状病毒时，试纸条检测线上无法形成夹心式结构，仅在质控线上显色。本发明提供的试剂盒从RPA扩增到试纸条检测，整个过程只需30min左右，从而实现了在等温条件下对于新型冠状病毒 2019-nCoV的快速检测。本发明提供的试剂盒操作简单，无需专业设备和人员，根据说明书可进行检测，扩增结果通过试纸可直接肉眼判读；能够实现新型冠状病毒的快速检测。

附图说明

图1为本发明中重组酶聚合酶扩增原理示意图；

图2为试纸条检测原理示意图；

图3为新型冠状病毒特异性基因扩增结果；

图4为试纸条检测结果。

具体实施方式

本发明提供了一种检测新型冠状病毒的试剂盒，包括重组酶聚合酶扩增检测体系和试纸条；所述重组酶聚合酶扩增检测体系包括扩增新型冠状病毒特异性基因的引物组；所述引物组中的上游引物包括第一延伸序列，所述引物组的下游引物包括第二延伸序列；所述试纸条的结合区吸附金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针；所述检测探针与所述第一延伸序列互补配对；所述试纸条的检测区包括检测线和质控线；所述检测线上喷涂捕获探针，所述质控线上喷涂质控探针；所述捕获探针与第二延伸序列互补配对；所述质控探针与检测探针互补配对。

在本发明中，所述试剂盒包括重组酶聚合酶扩增检测体系，所述重组酶聚合酶扩增检测体系包括扩增新型冠状病毒特异性基因的引物组；所述新型冠状病毒特异性基因优选的包括编码ORF1ab的基因和/或编码核壳蛋白N 的基因。在本发明中，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因时，所述引物组包括上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R；所述上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，具体如下：

Orf1ab F：5-cccccccccc-C3(第一延伸序列)-ccctgtgggttttacacttaaaaac-3

Orf1ab R：5-tttttttttt-C3(第二延伸序列)-acgattgtgcatcagctgactgaag-3

其中C3不是碱基，第一延伸序列如SEQ ID No.11所示，所述第二延伸序列如SEQID No.12所示。

在本发明中，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码核壳蛋白N的基因时，所述引物组包括上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R；所述上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R的核苷酸序列如SEQ ID No.6和 SEQ ID No.7所示，具体如下：

核壳蛋白F：

5-aaaacccttctcctg-C3(第三延伸序列)-ggggaacttctcctgctagaat-3

核壳蛋白R：

5-cgtgaacccgctctc-C3(第四延伸序列)-cagacattttgctctcaagctg-3。

其中C3不是碱基，第三延伸序列如SEQ ID No.13所示，所述第四延伸序列如SEQID No.14所示。

在本发明中，所述重组酶聚合酶扩增检测体系还包括RPA反应Mix和 MgOAc。在本发明中，对所述RPA反应Mix的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售RPA反应Mix即可，在本发明中，所述MgOAc浓度为优选为 250～300mM，更优选为280mM。

在本发明中，所述试剂盒包括试纸条，所述试纸条包括顺次搭接的样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫。

在本发明中，所述试纸条的结合区吸附金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针；所述检测探针与所述第一延伸序列互补配对；所述试纸条的检测区包括检测线和质控线；所述检测线上喷涂捕获探针，所述质控线上喷涂质控探针；所述捕获探针与第二延伸序列互补配对；所述质控探针与检测探针互补配对。

在本发明中，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因时，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，具体如下：Orf1abDP:5- aaaaaaaaaaaaaaa-3-SH，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，具体如下：5-ggggggggggggggg-3-Biotin；所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.5所示，具体如下：5-tttttttttt-3-Biotin。

在本发明中，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码核壳蛋白N的基因时，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，具体如下：5- gagagcgggttcacg ttt-3-SH；所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，具体如下：5-caggagaagggttttttt-3-Biotin；所述质控探针的核苷酸序列如SEQ IDNo.10所示，具体如下：5-cgtgaacccg-3-Biotin。

在本发明中，优选的，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab 的基因和编码核壳蛋白N的基因时，所述检测探针包括第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3 和SEQ ID No.8所示；所述检测线包括第一检测线和第二检测线；所述第一检测线和第二检测线上分别喷涂第一捕获探针和第二捕获探针；所述第一捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述第二捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示；所述质控线上喷涂第一质控探针和第二质控探针；所述第一质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示，所述第二质控探针的核苷酸序列如SEQIDNo.10所示。

在本发明中，金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针的制备方法包括以下步骤：将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液依次与dATP、SDS、NaCl 和检测探针混合后偶合获得。在本发明中，所述偶合的温度优选为58～62℃，更优选为60℃，所述偶合的时间优选为2～4h，更优选为3h。本发明在所述偶合后，优选的通过离心实现固液分离，收集固相组分清洗后保存。在本发明中，所述离心的转速优选为10000～14000rpm，更优选为12000rpm，所述离心的时间优选为8～12min，更优选为10min，所述清洗优选的采用PBS缓冲液进行，所述清洗地次数优选为2～4次，更优选为3次。在本发明中，所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针优选的保存于纳米粒子存储液中；所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针的保存温度优选为 4℃；在本发明中，所述纳米粒子存储液以水为溶剂，优选的包括以下组分： 20mmol/LNa₃PO₄·12H₂O、5％BSA、0.25％Tween 20和10％蔗糖。

在本发明具体实施过程中，所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液与 dATP混合后优选的进行震荡；所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液与dATP 混合的体积比优选为(90～110):1，更优选为100:1；所述dATP的浓度优选为0.8～1.2mM，更优选为1mM；所述震荡的时间优选为15～25min，更优选为20min。本发明在所述震荡后，将震荡后的液体与SDS混合，进行第二震荡；所述SDS的质量浓度优选为0.8％～1.2％，更优选为1％；所述SDS与所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液的体积比优选为(180～220):3，更优选为200:3；所述第二震荡的时间优选为8～12min，更优选为10min。本发明在所述第二震荡后，向体系中加入NaCl，所述NaCl的浓度优选为0.1～0.3M，更优选为0.2M；所述NaCl与所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液的体积比优选为(18～22):1，更优选为20:1；在本发明中，所述NaCl的加入速度优选的为每2～3min加入2μL。本发明在加入NaCl后，优选的向体系中加入1 OD的检测探针。

在本发明中，所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液优选的通过将金簇液与硅球液混合、吸附获得；在本发明中，所述金簇液和硅球液的体积比优选为(3～5):1，更优选为4:1；所述硅球液的浓度优选为2～3mg/L，更优选为 2.5mg/L。在本发明中，所述吸附优选的在磁力搅拌器上进行，本发明对所述吸附的温度没有特殊限定，室温即可，所述吸附的时间优选为1h。

在本发明中，所述硅球液的制备方法优选的如下：将无水乙醇、去离子水和氨水混合搅拌后，与正硅酸乙酯混合反应、固液分离、收集固相组分，将所述固相组分重悬于去离子水或乙醇中获得硅球液。在本发明中，所述无水乙醇、去离子水、氨水和正硅酸乙酯的体积比优选为128:18:3:3；所述混合搅拌的温度优选为28～32℃，更优选为30℃；所述混合搅拌的时间优选为8～12min，更优选为10min。在本发明中，所述混合反应的时间优选为1.5～2.5h，更优选为2h。在本发明中，所述固液分离优选为离心，所述的转速优选为14000～16000rpm，更优选为15000rpm，所述离心的时间优选为 15～25min，更优选为20min。在本发明中，所述固相组分优选的清洗后重悬，所述清洗优选的依次采用乙醇和水进行，乙醇清洗的次数优选为1～3次，更优选为2次，水清洗的次数优选为1～3次，更优选为2次。在本发明中，所述固相组分与重悬用水(或乙醇)的比例优选为5g:(45～55)mL，更优选为5g:50mL。

在本发明中，所述金簇液优选的通过以下方法制备获得：将HAuCl₄、双蒸水和柠檬酸钠混合后与硼氢化钠混合获得。在本发明中，所述HAuCl₄、双蒸水的体积比优选为1:50；所述HAuCl₄的质量浓度优选为1％；在本发明中，所述HAuCl₄和柠檬酸钠的比例优选为1mL:0.03M；在本发明，所述硼氢化钠与HAuCl₄的体积比优选为1:1，所述硼氢化钠的浓度优选为0.1M。在本发明中，所述HAuCl₄、双蒸水和柠檬酸钠混合的时间优选为20s。

本发明在制备获得所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针后，将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针喷涂(4μL/试纸条)于结合垫。

在本发明中，将捕获探针喷涂于检测区的检测线上、质控探针喷涂于检测区的质控线上；然后将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在底板上获得试纸条。

在本发明中，所述捕获探针优选的为生物素、链霉亲和素标记的捕获探针。在本发明中，所述捕获探针的制备方法优选的包括以下步骤：将生物素标记的捕获探针与链霉亲和素混合、透析获得。在本发明中，所述混合的时间优选的为50～70min，更优选为1h；所述透析的截留分子量优选为30000；在本发明中，所述透析优选在透析管中进行；本发明在所述透析后进行离心，收集离心后透析管内的溶液获得捕获探针。在本发明中，所述离心的转速优选为5000～7000rpm，更优选为6000rpm，所述离心的时间优选为15～25min，更优选为20min，所述离心的温度优选为3～5℃，更优选为4℃；所述离心的作用是去除未结合的适配体探针。在本发明中，所述生物素标记的捕获探针与链霉亲和素的比例优选为50nM:0.5mg。

在本发明中，所述捕获探针、质控探针的喷涂浓度优选为1.2～1.8μL/cm，更优选为1.5μL/cm。本发明对所述喷涂的具体方法没有特殊限定，采用本领域常规的喷涂方法即可。

在本发明中，将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在底板上获得试纸条。在本发明中，所述样品垫的材质优选的采用玻璃纤维膜。所述样品垫的作用是减缓待测样品迁移的速度，有利于待测液在样品垫均匀分布，为后面更好地流到结合垫创造前提条件。在本发明中，所述结合垫的材质优选为玻璃纤维膜；所述结合垫用于吸附金包硅球纳米粒子(Si0₂@Au) 修饰的检测探针，在毛细吸附力作用下将样品待测液以一定速度均匀地输送到NC膜上；保持后续标记物颗粒的稳定性及完整性，有助于降低背景信号，提高检测的稳定性及重现性。在本发明中，所述吸收垫优选的使用吸收效率高、容量大及稳定性好的吸收纸。所述吸收垫的目的是为了促进液体在横流试纸条上的迁移能够顺利并完整抵达吸收垫，确保待测物(液)能够通过最后一步的虹吸作用而跨过NC膜，提高检测信号输出值，降低信噪比。

在本发明具体实施过程中，优选的首先将硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC底板上，然后将结合垫固定在其位置上并保证与NC膜有重叠，接着将样品垫粘贴在其位置上并保证与结合垫有重叠，最后粘贴吸收垫并保证与NC膜有重叠以确保液体顺利流动。在本发明中，上述重叠的长度优选为均为2mm。

在本发明中，所述试剂盒的使用方法优选的包括以下步骤：S1)提取待检样品的总RNA后逆转录获得cDNA；S2)以所述cDNA为模板，用试剂盒中的重组酶聚合酶扩增检测体系进行RPA扩增获得扩增产物；S3)将所述扩增产物滴加至试纸条的样品垫上，观察检测结果；当试纸条的检测线和质控线均显色，则说明待检样品中有新型冠状病毒，当试纸条的检测线不显色，质控线显色，则说明待检样品中无新型冠状病毒；当试纸条的质控线不显色时，说明试纸条失效。本发明对所述总RNA的提取、逆转录以及RPA 扩增的具体方法和参数没有特殊限定，采用本领域常规的方法和参数即可。在本发明中，优选的将所述扩增产物与1/4SSC缓冲液以1:9的比例混合后滴加于试纸条样品垫上，观察检测结果优选的在加样后10min进行。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

SiO₂@Au纳米材料的制备：

首先制备直径在150nm的SiO₂硅球液：128mL无水乙醇+18mL去离子水+3mL氨水混合，30℃搅拌10min。再加入3mL正硅酸乙酯TEOS，搅拌反应2h。15000rpm离心20min，收集沉淀，用乙醇洗涤两次，水洗涤两次，离心后将沉淀重悬于50mL去离子水或乙醇中，制得SiO₂硅球液。

金簇液制备：1mL 1％HAuCl₄+50mL双蒸水+0.03M柠檬酸钠混匀20s 后+1mL 0.1M硼氢化钠。

金簇液与硅球液比例：8mL金簇中缓慢滴加2mL(5mg)硅球液。

吸附具体条件：在室温下于磁力搅拌器上，搅拌1h即可。

试纸条的制备：

(1)样品垫：材质采用玻璃纤维膜。它的作用是减缓待测样品迁移的速度，有利于待测液在样品垫均匀分布，为后面更好地流到结合垫创造前提条件。

(2)结合垫：玻璃纤维膜。结合垫用于吸附金包硅球纳米粒子 (Si0₂@Au)修饰的检测探针，并在毛细吸附力作用下将样品待测液以一定速度均匀地输送到NC膜上；保持后续标记物颗粒的稳定性及完整性，有助于降低背景信号，提高检测的稳定性及重现性。

DNA探针标记Si0₂@Au步骤：取1mL 3倍浓缩的Si0₂@Au溶液，加入10μL 1mM的dATP，在室温下，用振荡器振荡20min，接着加入15μL 1％ SDS，震荡培养10min后，加入50μL 0.2M的NaCl(速度控制在每2～3min 加入2μL)，然后加入1OD检测探针，在60℃下反应3h，用离心机(转速12,000rpm，10min)离心，去除上清液，用PBS缓冲液(pH值7.2～7.4) 清洗3次，最后将沉淀溶于1mL纳米粒子存储液(20mmol/LNa₃PO₄·12H₂O， 5％BSA，0.25％Tween 20，10％蔗糖)中，偶合物溶液放在4℃冰箱保存待用。

(3)NC膜(Nitrocellulose Membrance，硝酸纤维素膜)：包含检测线 1、检测线2、质控线。侧流试纸条的检测中心区域主要集中在硝酸纤维素膜上。一般检测结果以检测线和质控线来衡量，检测线上颜色可进行半定量或定量、定性分析。

质控线是为了验证试纸条检测的有效性。如果质控线没有颜色，说明试纸条检测结果不可信。

检测线1喷涂捕获探针1：Orf1abCP:5-GGGGGGGGGGGGGGG- 3-Biotin

检测线2喷涂捕获探针2核壳CP:5-CAGGAGAAGGGTTTT ttt- 3-Biotin

质控线喷涂：5-TTTTTTTTTT-3-Biotin和5-CGTGAACCCG- 3-Biotin

喷涂浓度均为：1.5μL/cm。

捕获探针处理步骤：将50nM生物素标记的捕获探针与200μL2.5mg/ml 的链霉亲和素(上海生工)在0.01MPBS中混合培养1h后，将混合液转移至透析管(截留分子量30000)中，在冷冻离心机中离心(6000rpm，20min， 4℃)去除未结合的适配体探针。加入PBS重复以上步骤两次，最后收集离心后被截留的溶液定容至600μL。最后将生物素标记的DNA和链霉亲和素结合的混合物溶液喷涂在试纸条上。

(4)吸收垫：使用吸收效率高、容量大及稳定性好的吸收纸。吸收垫的目的是为了促进液体在横流试纸条上的迁移能够顺利并完整抵达吸收垫，确保待测物(液)能够通过最后一步的虹吸作用而跨过NC膜，提高检测信号输出值，降低信噪比。

位置关系：首先将硝酸纤维素膜(NC膜)粘贴在PVC底板上，然后将结合垫固定在其位置上并保证与NC膜有2mm的重叠，接着将样品垫粘贴在其位置上并保证与结合垫有2mm的重叠，最后粘贴吸收垫并保证与NC 膜有2mm的重叠以确保液体顺利流动。

试剂盒检测过程：

第一步：RPA反应

于反应管中加入A液41.5μL，上下游引物各2μL，模板：待检测样品材料2μL，B液2.5μL，37℃，反应30min。

A液是RPA反应的Mix。B液是MgOAc，浓度为280mM。

模板为人工制备的包括病毒特异性基因的PUC57质粒；

引物1Orf1ab F：

5-cccccccccc-C3-CCCTGTGGGTTTTACACTTAAAAAC-3

引物2Orf1ab R：

5-tttttttttt-C3-ACGATTGTGCATCAGCTGACTGAAG-3

引物3核壳蛋白F：

5-AAAACCCTTCTCCTG-C3-GGGGAACTTCTCCTGCTAGAAT-3

引物4核壳蛋白R：

5-CGTGAACCCGCTCTC-C3-CAGACATTTTGCTCTCAAGCTG-3

(引物1、引物2)和(引物3、引物4)分别进行扩增。

将产物进行聚丙烯稀酰胺凝胶电泳，结果如图3所示，扩增结果良好，扩增处单一条带。

第二步：试纸条检测

取10μL的RPA扩增产物，与90μL的1/4SSC缓冲液混匀，滴加于试纸条样品垫上，10min后观察结果。

试纸条可以特异性检测等温扩增出的新冠病毒核衣壳蛋白和Orf1ab保守序列，结果如图4所示，以人工制备的带有新冠病毒核衣壳蛋白和Orf1ab 保守序列质粒分别为模板，进行RPA扩增后，采用本发明的试纸条检测，可见扩增产物出现阳性条带。

以本实施例中的试剂盒在安徽省疾控中心通过阳性样本验证4例，检出率达100％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 安徽科技学院

<120> 一种检测新型冠状病毒的试剂盒及其制备方法

<160> 14

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

cccccccccc ccctgtgggt tttacactta aaaac 35

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

tttttttttt acgattgtgc atcagctgac tgaag 35

<210> 3

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

aaaaaaaaaa aaaaa 15

<210> 4

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

gggggggggg ggggg 15

<210> 5

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

tttttttttt 10

<210> 6

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

aaaacccttc tcctggggga acttctcctg ctagaat 37

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

cgtgaacccg ctctccagac attttgctct caagctg 37

<210> 8

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

gagagcgggt tcacgttt 18

<210> 9

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

caggagaagg gttttttt 18

<210> 10

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

cgtgaacccg 10

<210> 11

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

cccccccccc 10

<210> 12

<211> 10

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

tttttttttt 10

<210> 13

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

aaaacccttc tcctg 15

<210> 14

<211> 15

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

cgtgaacccg ctctc 15

Claims

1.一种检测新型冠状病毒的试剂盒，其特征在于，包括重组酶聚合酶扩增检测体系和试纸条；

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述新型冠状病毒特异性基因包括编码ORF1ab的基因和/或编码核壳蛋白N的基因。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因时，所述引物组包括上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R；所述上游引物Orf1ab F和下游引物Orf1ab R的核苷酸序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示。

4.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码核壳蛋白N的基因时，所述引物组包括上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R；所述上游引物核壳蛋白F和下游引物核壳蛋白R的核苷酸序列如SEQ ID No.6和SEQ ID No.7所示，所述检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示，所述捕获探针的核苷酸序列如SEQ ID No.9所示，所述质控探针的核苷酸序列如SEQ ID No.10所示。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，当所述新型冠状病毒特异性基因为编码ORF1ab的基因和编码核壳蛋白N的基因时，所述检测探针包括第一检测探针和第二检测探针；所述第一检测探针和第二检测探针的核苷酸序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.8所示；

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述重组酶聚合酶扩增检测体系还包括RPA反应Mix和MgOAc。

7.权利要求1～6任意一项所述的试剂盒的制备方法，包括试纸条的制备：将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针吸附于结合垫，将捕获探针喷涂于检测区的检测线上、质控探针喷涂于检测区的质控线上；然后将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次搭接在底板上获得试纸条。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针的制备方法包括以下步骤：将金包硅球纳米粒子Si0₂@Au溶液依次与dATP、SDS、NaCl和检测探针混合后偶合获得。

9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述偶合的温度为58～62℃，所述偶合的时间为2～4h。

10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述金包硅球纳米粒子Si0₂@Au修饰的检测探针保存于纳米粒子存储液中。