CN112322790A

CN112322790A - 同时检测9种呼吸道病毒的引物组合、质粒和检测试剂盒

Info

Publication number: CN112322790A
Application number: CN202011348437.6A
Authority: CN
Inventors: 龙飞; 黄庆珊; 周焕杰; 梁振宇; 王徐飞; 肖静; 彭涛; 陈荣昌
Original assignee: Guangzhou Medical University
Current assignee: Guangzhou Medical University
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-02-05

Abstract

本发明公开了一种同时检测9种呼吸道病毒的引物组合、质粒和检测试剂盒，属于是生物技术领域。引物组合中包括甲型流感病毒、乙型流感病毒、H7型流感病毒、NL63型冠状病毒、229E型冠状病毒、2型副流感病毒、博卡病毒、A型呼吸道合胞病毒、B型呼吸道合胞病毒和人内参GAPDH基因的检测引物对。检测试剂盒中包括：2×多重逆转录PCR反应液、逆转录PCR酶混合液、引物混合液、无RNA酶水、磁珠混合液、报告缓存液、阳性对照、藻红蛋白修饰链霉亲和素。本发明依靠液相芯片技术，制造出的检测试剂盒可同时对多种呼吸道病毒进行定性分析，且检测灵敏度和特异性达到了PCR水平；能快速、准确判断呼吸道病毒感染的类型，有利于临床上呼吸道感染的早期病原学诊断、治疗，有利于缩短治疗周期，节省医疗费用，产生良好的社会效益。

Description

同时检测9种呼吸道病毒的引物组合、质粒和检测试剂盒

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合、质粒和检测试剂盒。

背景技术

呼吸道病毒感染是全球范围内人类发病和死亡的主要原因之一。截止目前，大部分的的急性上呼吸道和下呼吸道疾病是由细菌以外的病原体引起的，其中以呼吸道病毒最为常见。呼吸道病毒感染可以引起多种严重的并发症，其中最大的危害是其具有潜在的引发一个地区、一个国家乃至世界范围内大流行的可能。因此，呼吸道病毒感染已成为当前严重的全球性公共卫生问题。

目前，国内外各医疗机构传统的呼吸道病毒感染实验室诊断方法主要有病毒分离、病毒抗原抗体分析及病毒基因检测等。其中，病毒分离鉴定是诊断病毒感染公认的“金标准”。但其要求标本中的病毒含量较高，而且对标本的采集、运输、保存的条件要求严格、试验步骤繁琐、加之确诊时间需要两周左右，难以用于临床快速诊断；另外，由于病毒合并感染的现象普遍存在，而在细胞中一种病毒的复制可能会抑制或掩盖另一种病毒的复制，因此细胞培养方法难以检出标本中可能存在的病毒合并感染的现象，对那些预后较差的合并感染的早期诊断尤为不利。

呼吸道病毒感染的血清学诊断中多是采用酶联免疫吸附试验，对样本中的特异性IgG或IgM抗体进行检测，需要急性期和恢复期双份血清，当恢复期抗体效价升高4倍以上才能明确诊断，整个诊断周期需要2-4周，仅能作回顾性诊断应用，而且检测结果的特异性和灵敏度受包被的抗原纯度的影响较大，常作为呼吸道病毒感染诊断的补充手段。

呼吸道病毒的抗原检测多采用免疫荧光法，其原理是将不影响抗原抗体活性的荧光素标记在抗体上，标记荧光素的抗体和相应的病毒抗原形成免疫复合物，呈现特异性的荧光，借此观察细胞内的病毒抗原。该技术敏感性和特异性较高，可应用于快速诊断，但检测需要使用荧光显微镜或相关的荧光检测仪，并且只能检测有相应抗体的呼吸道病毒。

液相芯片技术(又称流式荧光技术)是一种由luminex公司研发的一项高通量快速检测技术，可在液相体系中完成探针与目的基因的杂交过程，它有机地整合了编码微球、激光技术、应用流体学、数字信号处理器和计算机运用等技术，具有高通量、高速度、低成本、高灵敏、重复性好、线性范围广等优点。通过对颜色编码的微球表面进行化学结构修饰，在不同荧光编码的微珠表面预先连接含24个碱基的序列，每种编码微珠连接一种序列，该序列不含C碱基，仅含T、A、G三种碱基，故名TAG序列(习惯上称反TAG序列或反标签序列)，连接有反TAG序列且有磁性的微珠即为xTAG磁珠，能够与病毒特异检测探针中的TAG序列形成特异的共价结合，最后通过微流体系统检测，红色激光激发微球本身的荧光，用于鉴别微球的种类、识别病毒种类；绿色激光激发报告分子的荧光，通过检测荧光的强度对被测物质进行定性分析。直径5.6μm的微球具有极大的比表面积，可长时间悬浮于液体中进行高效均匀的拟液相动力学反应，且同一反应体系内不同编码微球各自反应、互不干扰，从而实现一次检测获得多种检测结果，实现多指标的高通量联合检测，特别适用于多种呼吸道病毒的同时检测分析。

发明内容

本发明的目的是提供一种可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合、质粒和检测试剂盒。

为实现本发明的目的，通过以下技术方案予以实现：一种可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合，包括序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2的人内参GAPDH基因上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.3-SEQ ID NO.4的甲型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQID NO.5-SEQ ID NO.6的乙型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.7-SEQ IDNO.8的H7型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10的NL63型冠状病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12的229E型冠状病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.17-SEQ ID NO.18的2型副流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.19-SEQ ID NO.20的博卡病毒上、下游引物；序列表中的 SEQ ID NO.21-SEQ IDNO.22的A型呼吸道合胞病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24的B型呼吸道合胞病毒上、下游引物。

本发明另一个目的是提供包含上述同时检测9种呼吸道病毒的引物组合的质粒。具体地，包括序列表中的SEQ ID NO.25内参基因阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.26甲型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.27乙型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.28H7型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.29NL63型冠状病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.30 229E 型冠状病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.33 2型副流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.34博卡病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.35A型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ IDNO.36B型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒。

本发明另一个目的是提供同时检测9种呼吸道病毒的引物组合的检测试剂盒。具体地，所述检测试剂盒包括组分：2×多重逆转录PCR反应液、逆转录PCR酶混合液、引物混合液、无RNA酶水、磁珠混合液、报告缓存液、阳性对照、藻红蛋白修饰链霉亲和素。

优选地，包括以下组分：2×多重逆转录PCR反应液(2×Multiplex RT-PCRReaction Mix)1ml、逆转录PCR酶混合液20μl、引物混合液(Primer Mix)80μl、无RNA酶水(Rnase-free water)2×1.5ml、磁珠混合液(Bead Mix)2ml、报告缓存液(ReporterBuffer)8ml、阳性对照(Positive control)200μl、藻红蛋白修饰链霉亲和素(SAPE/Streptavidin,R-Phycoerythrin Conjugate)100μl。

本发明依靠液相芯片技术，提供检测试剂盒可同时对GAPDH内参基因、甲型流感病毒、乙型流感病毒、H7型流感病毒、NL63型冠状病毒、229E型冠状病毒、2型副流感病毒、博卡病毒、A型呼吸道合胞病毒和B型呼吸道合胞病毒进行定性分析，且检测灵敏度和特异性达到了PCR水平；能快速、准确判断呼吸道病毒感染的类型，有利于临床上呼吸道感染的早期病原学诊断、治疗，有利于缩短治疗周期，节省医疗费用，产生良好的社会效益。

附图说明

图1-12分别为12种引物PCR扩增特异性评价；12种引物分别依次为GAPDH、InfA、InfB、H7、 NL63、229E、OC63、HPIV-1、HPIV-2、HBoV、RSV-A、RSV-B。

图13-22分为10种引物PCR扩增体系单独扩增的DNA检测灵敏度评价；10种引物分别依次为 GAPDH、InfA、InfB、H7、NL63、229E、HPIV-2、HBoV、RSV-A、RSV-B。

图23-32分为10种引物PCR扩增体系单独扩增的RNA检测灵敏度评价；10种引物分别依次为GAPDH、InfA、InfB、H7、NL63、229E、HPIV-2、HBoV、RSV-A、RSV-B。

图33为10重PCR扩增体系的检测灵敏度评价。

图中：GAPDH是指内参基因检测引物、InfA是指甲型流感病毒、InfB是指乙型流感病毒、H7是指H7型流感病毒、NL63是指NL63型冠状病毒、229E是指229E型冠状病毒、HPIV-2是指2型副流感病毒、HBoV是指博卡病毒、RSV-A是指A型呼吸道合胞病毒、RSV-B是指B型呼吸道合胞病毒。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。其中，附图仅用于示例性说明，表示的仅是示意图，而非实物图，不能理解为对本发明的限制。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明的保护范围。

本发明中，2×多重逆转录PCR反应液，购于Qiagen公司，成分为Tris缓冲液、dNTP、(NH₄)₂SO₄、氯化钾和氯化镁；逆转录PCR酶混合液(RT Enzyme Mix)，购于Qiagen公司，成分为逆转录酶、RNA 酶抑制剂和DNA聚合酶的混合物；引物混合液含有10对引物；磁珠混合液含有10种与多重引物TAG 序列对应的xTAG磁珠，购于Luminex公司；报告缓存液为含1％牛血清白蛋白的磷酸缓冲盐溶液； SAPE购于Bio-Rad公司；RT-PCR Product是指逆转录PCR反应产物；Reporter Solution是指报告液体系。本发明的检测方法主要依靠流式荧光技术所实现。

本发明的具体检测流程为：

(1)利用生物信息学的方法，选取各检测目标的目的基因：具体为选择人内参GAPDH基因、甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒HA基因、H7型流感病毒HA基因、NL63型冠状病毒N基因、229E 型冠状病毒N基因、副流感病毒HN基因、博卡病毒NP1基因、A型呼吸道合胞病毒F基因和B型呼吸道合胞病毒N基因进行生物信息学分析，设计特异性检测引物，用于扩增序列；

(2)采用分子生物学技术将对应引物扩增序列克隆到质粒载体中，构建含扩增序列的阳性对照质粒。对应引物扩增序列是人工合成的，用于PCR扩增的阳性对照。构建含扩增序列的阳性对照质粒，即为将各扩增引物对应的序列插入到质粒载体中，质粒可作为DNA扩增的阳性对照，或通过质粒转录相关的RNA，经纯化后作为RNA扩增的阳性对照。具体步骤为：采用转基因方法转移上述带有扩增序列的载体到大肠杆菌(E.coli)中，然后涂布于选择性平板(90mm培养皿，100mg/ml氨苄青霉素10 μl，20％的IPTG溶液7μl，2％的X-gal溶液40μl)上，37℃培养12h。用灭菌的牙签从选择性平板上挑取白色菌落，接菌到装有5mlLB培养液的PA瓶中，再在37℃下以150r/min培养8h，提取质粒的 DNA，经PCR扩增后，确定获得转化子。也可以选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。

(3)采用一步法或两步法进行多重PCR扩增(一步法：RNA逆转录与PCR扩增在同一体系中进行，两步法：RNA逆转录与PCR扩增在不同体系中进行)，扩增产物与对应的混合xTAG编码磁珠进行杂交，加入素藻红蛋白进行孵育。

(4)置于Luminex液相芯片系统读取荧光值，进行临床样品的定性分析。

实施例1多重引物的设计和阳性对照质粒的构建

1.多重引物的设计：分别对人内参GAPDH基因、甲型流感病毒M基因、乙型流感病毒HA基因、 H7型流感病毒HA基因、NL63型冠状病毒N基因、229E型冠状病毒N基因、OC43型冠状病毒N基因、1型副流感病毒HN基因、2型副流感病毒HN基因、博卡病毒NP1基因、A型呼吸道合胞病毒F 基因和B型呼吸道合胞病毒N基因进行生物信息学分析。通过Genbank中公用的BLAST软件，将这些基因的序列分别与其他微生物进行比对，选出特异性较高的序列区段。然后用软件Primer 5.0在这段特异序列中设计一对上下游引物，并分别在上游引物中加入TAG序列和C18连接序列，在下游引物中加入生物素标记序列。具体引物序列见表1。

表1：

表1中引物的类型均为核酸，链型均为双链，拓扑结构均为线性，分子类型均为DNA。

2.阳性对照质粒的构建：

构建阳性对照质粒：将各包含扩增引物对应的序列插入到质粒载体中，质粒可作为DNA扩增的阳性对照，或通过质粒转录相关的RNA，经纯化后作为RNA扩增的阳性对照。具体阳性对照质粒见表2。

表2：

名称	序列号	名称	序列号
				内参基因阳性对照质粒	SEQ ID NO.25	OC43型冠状病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.31
甲型流感病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.26	1型副流感病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.32
				乙型流感病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.27	2型副流感病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.33
H7型流感病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.28	博卡病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.34
				NL63型冠状病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.29	A型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.35
229E型冠状病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.30	B型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒	SEQ ID NO.36

表2中各阳性对照质粒的目标质粒均为：pBluescript II SK(-)，类型均为核酸；链型均为双链；原始来源均为人工合成。

实施例2多重扩增引物的选择——引物特异性评价

根据实施例1的引物和质粒，12种引物混合后用于检测，以缺少需验证的对应引物扩增模板的其他11种模板混合后作为PCR扩增的检测模板，以需验证的对应引物的扩增模板作为阳性对照，以水作为阴性对照，对对应引物的特异性进行评价。

具体步骤如下：

(1)PCR体系的准备(在冰上进行，0-4℃，一份样本的量)

2×PCR Reaction Mix 10μl，Primer 4.8μl，核酸样本2μl，总体积20μl。

(2)设置PCR程序

95℃保持30sec；95℃保持5sec，60℃保持30sec，读板，重复40个循环；溶解曲线分析；4℃ 保存。

3次重复检测结果如图1-12所示，除图1所示的OC43型冠状病毒引物和图2所示的1型副流感病毒引物在检测模板和阳性对照均有扩增外，其他10种引物仅能扩增出阳性对照样本，不含对应引物扩增模板的混合样本以及阴性对照均无扩增(如图3-图12所示)，说明除OC43冠状病毒引物和1型副流感病毒引物存在非特异扩增外，其他10对引物的特异性好，因此，选择这10对引物作为多重体系的扩增引物。

实施例3 10种引物扩增体系单独扩增的检测灵敏度评价

1.DNA检测灵敏度评价

具体步骤如下：

(1)PCR体系的准备(在冰上进行，0-4℃，一份样本的量)

2×PCR Reaction Mix 10μl，Primer 0.8μl，核酸样本2μl，总体积20μl。

(2)设置PCR程序

95℃保持3min；95℃保持30sec，58℃保持30sec，读板，72℃保持30sec，重复40个循环；溶解曲线分析；4℃保存。

(3)检测目标的准备

分别将10种扩增体系的阳性对照质粒进行10倍梯度稀释，加入到检测体系中，以水作为阴性对照，进行PCR扩增和荧光检测，绘制检测灵敏度曲线，结果如图13-22所示，3次重复试验结果表明，10 种体系的检测灵敏度都稳定能达到10copies/反应。

2.RNA检测灵敏度评价

具体步骤如下：

(1)RT-PCR体系的准备(在冰上进行，0-4℃，一份样本的量)

2×RT-PCR Reaction Mix 10μl，RT Enzyme Mix 0.8μl，Primer 0.8μl，核酸样本2μl，总体积20μl。

(2)设置PCR程序

42℃保持5min；95℃保持10sec；95℃保持5sec，56℃保持30sec，读板，72℃保持30sec，重复40个循环；溶解曲线分析；4℃保存。

(3)检测目标的准备

分别将10种扩增体系的阳性对照质粒进行T7 RNA酶逆转录，将扩增片段逆转录为RNA，得到的RNA经过试剂盒回收纯化后，进行10倍梯度稀释，加入到检测体系中，以无RNA酶水作为阴性对照，进行PCR扩增和荧光检测，绘制检测灵敏度曲线，结果如图 23-32所示，3次重复试验结果表明，10种体系的检测灵敏度都稳定能达到10copies/反应。

实施例4试剂盒各材料所含具体成分及检测流程

1.检测试剂盒：

2×Multiplex RT-PCR Reaction Mix 1ml、RT Enzyme Mix 20μl、Primer Mix 80μl、Rnase-free water 2×1.5ml、Bead Mix 2ml、Reporter Buffer 8ml、Positivecontrol 200μl、SAPE 100μl。

其中，引物混合液(Primer Mix)组成见表1所示的人内参GAPDH基因检测引物、甲型流感病毒检测引物、乙型流感病毒检测引物、H7型流感病毒检测引物、NL63型冠状病毒检测引物、229E型冠状病毒检测引物、2型副流感病毒检测引物、博卡病毒检测引物、A型呼吸道合胞病毒检测引物以及B型呼吸道合胞病毒检测引物。

阳性对照(Positive control)组成见表2所示的内参基因阳性对照质粒、甲型流感病毒阳性对照质粒、乙型流感病毒阳性对照质粒、H7型流感病毒阳性对照质粒、NL63型冠状病毒阳性对照质粒、229E型冠状病毒阳性对照质粒、2型副流感病毒阳性对照质粒、博卡病毒阳性对照质粒、A型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒以及B型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒。

2.多重PCR检测流程

(1)RT-PCR体系的准备(在冰上进行，0-4℃，一份样本的量)

2×Multiplex RT-PCR Reaction Mix 10μl，RT Enzyme Mix 0.2μl，Primer Mix0.8μl，核酸样本9μl，总体积20μl。

(2)设置多重PCR程序

50℃保持20min；95℃保持15min；95℃保持45sec，58℃保持45sec，72℃保持45sec，72℃ 保持5min，升降温速度2℃/sec，重复36个循环；溶解曲线分析；4℃保存。

(3)荧光蛋白溶液和微球杂交的准备

a.荧光蛋白溶液报告体系：SAPE 1μl，报告缓冲液(Report Buffer)84μl，总体积85μl，一份样本的量。

b.微球杂交体系：Bead Mix 10μl，RT-PCR Product 2μl，Reporter Solution 85μl，总体积97μl，一份样本的量。

(4)微球杂交程序：45℃保持20min，45℃保持。

(5)数据采集

将装有样品的96孔板快速的移到检测仪器中，进行荧光数据的采集和分析。

实施例5 10重PCR扩增体系的检测灵敏度评价

根据实施例4的方法，将10种扩增体系的阳性对照质粒混合后，进行10倍梯度稀释，加入到检测体系中，以无RNA酶水作为阴性对照，进行多重PCR扩增和荧光检测，绘制检测灵敏度曲线，结果如图33所示，3次重复试验结果表明，10种体系的检测灵敏度都稳定能达到10copies/反应，结果与单重 PCR扩增相当。

序列表

<110> 广州医科大学

<120> 一种可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合和检测试剂盒

<160> 36

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cacttaattc attctaaatc tatcggaagg tgaaggtcgg agt 43

<210> 2

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggaagatggt gatgggattt c 21

<210> 3

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

acaaatatct aactactatc acaacttcta accgaggtcg aaacgta 47

<210> 4

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggtgacagga ttggtcttgt cttta 25

<210> 5

<211> 44

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tctcatctat catactaatt ctttagggga ggtcaatgtg actg 44

<210> 6

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gggcatagtt tccctctggt 20

<210> 7

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

caaacaaaca ttcaaatatc aatcgaacga acaaacatcc cca 43

<210> 8

<211> 20

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

cttcattcac gaatttccca 20

<210> 9

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

tctctttaaa cacattcaac aatactttct caacccaggg ctg 43

<210> 10

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

ggaggaccaa agcactgaat aac 23

<210> 11

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tacttcttta ctacaattta caacgagtca ggcaacactg tggtc 45

<210> 12

<211> 24

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gttgttgcat ttctctagtg aatg 24

<210> 13

<211> 43

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

cataatcaat ttcaactttc tactgcaacc agcgtcaact gct 43

<210> 14

<211> 21

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggtgccgtac tggtctttag c 21

<210> 15

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ctaaacatac aaatacacat ttcacatcct ttttctgcaa tgtatcc 47

<210> 16

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

gcaaacactc tgattaacat tgg 23

<210> 17

<211> 47

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ctaaacatac aaatacacat ttcacatcct ttttctgcaa tgtatcc 47

<210> 18

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

gcaaacactc tgattaacat tgg 23

<210> 19

<211> 45

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

taacttacac ttaactatca tctttcaaca cagagcttcc aatcc 45

<210> 20

<211> 25

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

gaattagtac catctctagc aatgc 25

<210> 21

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

cataatcaat ttcaactttc tacttgtaag cagctccgtt atcaca 46

<210> 22

<211> 23

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ggatgctgta catttagttt tgc 23

<210> 23

<211> 46

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ctttcttaat acattacaac atactgcaaa tcataaattc acagga 46

<210> 24

<211> 27

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ccagcatctt taagtatctt tatagtg 27

<210> 25

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

tcgttgcaac aaattgataa gcaatgcttt tttataatgc caactttgta caaaaaagtt 60

ggcatgggga aggtgaaggt cggagtcaac ggatttggtc gtattgggcg cctggtcacc 120

agggctgctt ttaactctgg taaagtggat attgttgcca tcaatgaccc cttcattgac 180

ctcaactaca tggtttacat gttccaatat gattccaccc atggcaaatt ccatggcacc 240

gtcaaggctg agaacgggaa gcttgtcatc aatggaaatc ccatcaccat cttccaggag 300

<210> 26

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

atgagtcttc taaccgaggt cgaaacgtac gttctttcta tcatcccgtc aggccccctc 60

aaagccgaga tcgcacagag actggaaagt gtctttgcag gaaagaacac agatcttgag 120

gctctcatgg aatggctaaa gacaagacca atcctgtcac ctctgactaa gggaatttta 180

ggatttgtgt tcacgctcac cgtgcccagt gagcgaggac tgcagcgtag acgctttatc 240

caaaatgccc taaatggaaa tggggacccg aacaacatag atagagcagt taaactatac 300

<210> 27

<211> 290

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

atccacaaaa tgaaggcaat aattgtacta ctcatggtag taatgtccaa tgcagatcga 60

atctgcactg gtataacatc ttcaaactca cctcatgtgg tcaaaacagc tactcaaggg 120

gaggtcaatg tgactggcgt gataccactg acaacaacac caacaaaatc ttattttgca 180

aatctcaaag gaacaaggac cagagggaaa ctatgcccgg actgtctcaa ctgtacagat 240

ctggatgtgg ccttgggcag gccaatgtgt gtggggacca caccttctgc 290

<210> 28

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

taaacacatt aactgaaaga ggagtggaag tcgtcaatgc aactgaaaca gtggaacgaa 60

caaacatccc caggatctgc tcaaaaggga aaaggacagt tgacctcggt caatgtggac 120

tcctggggac aatcactgga ccacctcaat gtgaccaatt cctagaattt tcagccgatt 180

taattattga gaggcgagaa ggaagtgatg tctgttatcc tgggaaattc gtgaatgaag 240

aagctctgag gcaaattctc agagaatcag gcggaattga caaggaagca atgggattca 300

<210> 29

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

ctttggcttt aaagaactta ggttttgata accagtcgaa gtcacctagt tcttctggta 60

cttccactcc taagaaacct aataagcctc tttctcaacc cagggctgat aagccttctc 120

agttgaagaa acctcgttgg aagcgtgttc ctaccagaga ggaaaatgtt attcagtgct 180

ttggtcctcg tgattttaat cacaatatgg gggattcaga tcttgttcag aatggtgttg 240

atgccaaagg ttttccacag cttgctgaat tgattcctaa tcaggctgcg ttattctttg 300

<210> 30

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

cagctgctat gctgtttgat agtcacattg tttccaaaga gtcaggcaac actgtggtct 60

tgactttcac tactagagtg actgtgccca aagaccatcc acacttgggt aagtttcttg 120

aggagttaaa tgcattcact agagaaatgc aacaacatcc tcttcttaac cctagtgcac 180

tagaattcaa cccatctcaa acttcacctg caactgctga accagtgcgt gatgaagttt 240

ctattgaaac tgacataatt gatgaagtaa actaaacatg ccactgtgtt gtttgaaatt 300

<210> 31

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

gaattactca gtttcaaaag ggaaaggagt ttgagtttgt agaaggacaa ggtgtgccta 60

ttgcaccagg agtcccagct actgaagcta aggggtactg gtacagacac aacagacgtt 120

cttttaaaac agccgatggc aaccagcgtc aactgctgcc acgatggtat ttttactatc 180

tgggaacagg accgcatgct aaagaccagt acggcaccga tattgacgga gtctactggg 240

tcgctagcaa ccaggctgat gtcaataccc cggctgacat tgtcgatcgg gacccaagta 300

<210> 32

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

gaccaaatct catcgataca aaaatgaaga tataactttt gaccatcctt tttctgcaat 60

gtatccaagt gtaggaagtg ggataaagat tgaagataca ctcgttttcc taggatatgg 120

tggcttaaca actccgctcc aaggcaacac caagtgtgtg ataagcaaat gtcccaatgt 180

taatcagagt gtttgcaatg atgctcttaa gataacttgg ctaaagaaaa gacaagttgt 240

caatgtctta attcgtatca ataattattt atctgatagg ccaaagattg ttgtcgagac 300

<210> 33

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

gaccaaatct catcgataca aaaatgaaga tataactttt gaccatcctt tttctgcaat 60

gtatccaagt gtaggaagtg ggataaagat tgaagataca ctcgttttcc taggatatgg 120

tggcttaaca actccgctcc aaggcaacac caagtgtgtg ataagcaaat gtcccaatgt 180

taatcagagt gtttgcaatg atgctcttaa gataacttgg ctaaagaaaa gacaagttgt 240

caatgtctta attcgtatca ataattattt atctgatagg ccaaagattg ttgtcgagac 300

<210> 34

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

gagagtacat cggggaaaaa agacaataga acaaatccat acactgtatt cagtcaacac 60

agagcttcca atcctgaagc tccagggtgg tgtgggttct actggcactc tactcgcatt 120

gctagagatg gtactaattc aatctttaat gaaatgaaac aacagtttca acaactacaa 180

attgataata aaataggatg ggataacact agagaactat tgtttaatca aaagaaaaca 240

ctagatcaaa aatacagaaa tatgttctgg cactttagaa ataactctga ttgtgaaaga 300

<210> 35

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

caatcgaatc gagtattttg tgacacaatg aacagtttaa cattaccaag tgaagtaaat 60

ctctgcaaca ttgacatatt caaccctaaa tatgattgca aaattatgac ttcaaaaaca 120

gatgtaagca gctccgttat cacatctcta ggagccattg tgtcatgcta tggcaaaact 180

aaatgtacag catccaataa aaaccgtgga atcataaaga cattttctaa cgggtgtgat 240

tatgtatcaa ataagggggt ggacactgta tctgtaggta atacgttata ttatgtaaat 300

<210> 36

<211> 300

<212> DNA/RNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 36

aaagtcaagt tgaatgatac attaaataag gatcagctgc tgtcatccag caaatacact 60

attcaacgta gtacaggaga taatattgac actcccaatt atgatgtgca aaaacaccta 120

aacaaactat gtggtatgct attaatcact gaagatgcaa atcataaatt cacaggatta 180

ataggtatgc tatatgctat gtccaggtta ggaagggaag acactataaa gatacttaaa 240

gatgctggat atcatgttaa agctaatgga gtagatataa caacatatcg tcaagatata 300

Claims

1.一种可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合，其特征在于，包括序列表中的SEQ IDNO.3-SEQ ID NO.4的甲型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.5-SEQ ID NO.6的乙型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.7-SEQ ID NO.8的H7型流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.9-SEQ ID NO.10的NL63型冠状病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.11-SEQ ID NO.12的229E型冠状病毒上、下游引物；序列表中的SEQ IDNO.17-SEQ ID NO.18的2型副流感病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.19-SEQ IDNO.20的博卡病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.21-SEQ ID NO.22的A型呼吸道合胞病毒上、下游引物；序列表中的SEQ ID NO.23-SEQ ID NO.24的B型呼吸道合胞病毒上、下游引物。

2.根据权利要求1所示的可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合，其特征在于，还包括序列表中的SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.2的人内参GAPDH基因上、下游引物。

3.包含权利要求1其特征在于，包括序列表中的SEQ ID NO.26甲型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.27乙型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.28H7型流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.29NL63型冠状病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.30 229E型冠状病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.33 2型副流感病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.34博卡病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQID NO.35A型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒、序列表中的SEQ ID NO.36B型呼吸道合胞病毒阳性对照质粒。

4.根据权利要求3所述的可同时检测9种呼吸道病毒的引物组合的质粒，其特征在于，还包括序列表中的SEQ ID NO.25内参基因阳性对照质粒。

5.包含权利要求1或2所述的可同时检测9种呼吸道病毒的的引物组合的检测试剂盒，其特征在于，包括组分：2×多重逆转录PCR反应液、逆转录PCR酶混合液、引物混合液、无RNA酶水、磁珠混合液、报告缓存液、阳性对照、藻红蛋白修饰链霉亲和素。

6.根据权利要求5所述的同时检测9种呼吸道病毒的引物组合的检测试剂盒，其特征在于，包括以下组分：2×多重逆转录PCR反应液1ml、逆转录PCR酶混合液20μl、引物混合液80μl、无RNA酶水2×1.5ml、磁珠混合液2ml、报告缓存液(Reporter Buffer)8ml、阳性对照200μl、藻红蛋白修饰链霉亲和素100μl。