CN115096963B - 一种用于检测cd44的电致发光传感器的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法。以Zr作中心金属，以4,4’,4”‑三羧基三苯胺为有机配体首次合成了Zr‑MOF材料，基于其优良的配位诱导及自增强电致发光特性构建了检测CD44的电致发光传感器，该传感器以Zr‑MOF作发光体，以配体中的叔氮作为共反应剂，以铜掺杂氧化钼作为猝灭剂并用来标记第二抗体，得到了具有高灵敏度的猝灭型电致发光传感器，实现了将不同浓度的CD44转化为可视化的电致发光信号，实现了对CD44的检测，其检测范围为0.50 pg/mL~0.50µg/mL，检测限为0.13 pg/mL。
Description
技术领域
本发明涉及无机纳米材料合成与电致发光生物传感领域，具体涉及一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法。
背景技术
CD44是一类广泛存在于人胚胎干细胞、分化细胞和癌细胞中的复杂的跨膜糖蛋白，也是公认的肿瘤标志物。肿瘤疾病的精确治疗已经取得了巨大的进展，但是对于肿瘤细胞的监测仍然面临许多亟待解决的问题。因此如果能够实现人体中CD44的快速灵敏检测，则对于肿瘤的早期诊断和预防有积极作用。
电致发光是集成化学发光与电化学优势而发展的一种分析方法，具有灵敏度高、可控性强、背景干扰小等优点，已经被广泛用于人体血液成分和疾病标志物、食品中病原体与农药成分残留、环境中污染物与重金属离子的快速灵敏检测。电致发光传感新体系的建立，对于肿瘤早期诊断新原理、新方法与新技术的建立与推广应用，具有重要的科学意义和研究价值。高发光效率电致发光体的设计合成与应用是实现电致发光生物传感器中待测物浓度与电致发光信号有效转化的重要基础。
聚集诱导电致发光是一种奇特的发光现象，发光分子在聚集态或固态下往往会激发出比分散态更高的发光效率。聚集诱导电致发光体通常在水中分散性差，易通过分子间相互作用堆积形貌不一的聚集体，分子间相互作用可以抑制发光分子的内运动，限制激发态能量通过非辐射途径消耗，实现信号增强；但形貌结构的无序性会增加电致发光分子个体间的差异性，导致传感器批内重现性差。
金属有机框架（MOF）自组装纳米材料是由金属离子与有机配体配位构筑组合而成的纳米材料，兼具了有机材料和无机材料两种性能，具有高比表面积，高度规则有序的框架结构和可调节的孔径，以官能团修饰的电致发光分子作为有机桥连配体，以金属离子为节点，可制备比表面积大、形貌均一、高发光效率的聚集诱导电致发光活性MOF材料，刚性框架结构和特殊的拓扑构型可限制发光分子的内运动，使其脱离聚集态也可实现高效发光。
对此我们提出了一种以Zr作中心金属，以4, 4’, 4”-三羧基三苯胺为有机配体合成的电致发光自增强Zr-MOF新材料，其优良的配位诱导效应及自增强电致发光特性使其传感基底表现出良好的信号输出稳定性，结合共振能量转移策略，以铜掺杂氧化钼作为猝灭剂并用来标记第二抗体，得到了具有高灵敏度的猝灭型电致发光传感器，实现了人体中CD44的灵敏检测。
发明内容
1. 一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法，该方法具有以下工艺步骤：
（1）制备锆基MOF：
将0.05 ~ 0.2 g 氯化锆、0.01 ~ 0.05 g 4,4',4''-三甲酸三苯胺溶于8 ~ 20mL N,N-二甲基甲酰胺中，并逐滴加入0.5 ~ 2 mL冰乙酸，将上述混合溶转移至50 mL水热反应釜中，在120 ~ 160 oC下保温24 ~ 60 h，反应结束后冷却至室温，对产物离心、洗涤、真空干燥得到新型自增强电致发光体Zr-MOF；
（2）制备铜掺杂氧化钼：
取10 ~ 15 g钼酸铵和0.1 ~ 0.5 g硫酸铜置于研钵中充分研磨后加入5 ~ 10 mL聚乙二醇-400中，继续研磨15 min后加入5 ~ 8 g草酸，研磨30 min后将上述物质在50 ~80 °C水浴锅中保温20 ~ 40 h，获得的产物于400 ~ 600 °C下高温煅烧1 ~ 4 h得到铜掺杂氧化钼粉末；
（3）制备铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗：
取0.5 ~ 3 mg所制备的铜掺杂氧化钼溶于2 ~ 5 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液后，加入50 ~ 80 μL浓度为10 ~ 15 μg/mL的CD44二抗，于4 °C下震荡8 ~ 12 h后，离心留取底部沉淀，产物溶于2 ~ 5 mL的PBS缓冲溶液中并在4 °C下储存备用；
（4）制备电致发光传感器：
1）将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨至如镜面般光滑，氮气吹干；
2）取5 µL、1 ~ 5 mg/mL的Zr-MOF水溶液滴加至玻碳电极表面，红外灯下烤干；
3）在修饰电极表面，滴加氯化钠和巯基乙酸混合溶液，其中氯化钠浓度为0.1 ~0.5 mol/L、巯基乙酸浓度为1 % ~ 5 %，并在红外灯下烤干；
4）继续滴加4 μL、浓度为0.05 ~ 0.1 mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐溶液，室温晾干；
5）滴加5 µL、10 ~ 15 μg/mL的CD44第一抗体，5 ~ 8 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面并在室温下自然晾干；
6）滴加5 µL、浓度为1 ~ 5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，5 ~ 8 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，并在室温下自然晾干；
7）滴加5 µL、不同浓度的标准CD44，4 ℃冰箱中自然晾干后用超纯水冲洗电极表面；
8）滴加5 µL、1 ~ 8 μg/mL带有铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗，用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，4 ℃环境下晾干完成传感器构建。
2.所述的一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法，传感器检测步骤如下：
（1）将电化学工作站、超微弱光检测仪串联，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，制备的传感器为工作电极的标准三电极体系进行检测，电解液pH为7.5 ~ 8.4的0.5 mol/L的PBS缓冲溶液；
（2）电化学方法为循环伏安法，设置循环电压为0 ~ 1 V，运行段数为80，超微弱光检测仪光电倍增管高压设置为500 ~ 950 V，用PBS缓冲溶液依次稀释配制的CD44标准溶液进行检测；
（3）以不同CD44浓度为横坐标和对应的电致发光强度为纵坐标绘制工作曲线；
（4）将待测的血清样品代替CD44标准溶液进行检测。
本发名的有益成果
（1）本发明制备了一种用于检测CD44的电致发光传感器，首次以Zr作中心金属，以4, 4’, 4”-三羧基三苯胺为有机配体合成的电致发光自增强Zr-MOF新材料作为传感基底和电致发光体，协同共振能量转移策略，实现了人体中CD44的灵敏检测，该传感器具有工作稳定、灵敏度高、可控性强等优点；
（2）本发明制备的用于检测CD44的电致发光传感器对CD44表现出很高的特异性，电致发光强度与CD44浓度对数呈良好的线性关系，相关系数R2=0.996，其检测范围为0.50pg/mL ~ 0.50 µg/mL，检测限为0.13 pg/mL；
（3）本发明用于检测CD44的电致发光传感器制备流程简洁、所用试剂与设备绿色环保、安全无毒，自增强电致发光体Zr-MOF的合成方案适用于其它MOF材料的制备。
具体实施例方式
为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。
实施例1
（1）Zr-MOF的制备：
将0.05 g 氯化锆、0.01 g 4,4',4''-三甲酸三苯胺溶于8 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并逐滴加入0.5 mL冰乙酸，将上述混合溶转移至50 mL水热反应釜中，在120 oC下保温24 h，反应结束后冷却至室温，对产物离心、洗涤、真空干燥得到新型自增强电致发光体Zr-MOF；
（2）铜掺杂氧化钼的制备：
取10 g钼酸铵和0.1 g硫酸铜置于研钵中充分研磨后加入5 mL聚乙二醇-400中，继续研磨15 min后加入5 g草酸，研磨30 min后将上述物质在50 °C水浴锅中保温20 h，获得的产物于400 °C下高温煅烧1 h得到铜掺杂氧化钼粉末；
（3）铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗的制备：
取0.5 mg所制备的铜掺杂氧化钼溶于2 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液后，加入50 μL浓度为10 μg/mL的CD44二抗，于4 °C下震荡8 h后，离心留取底部沉淀，产物溶于2 mL的PBS缓冲溶液中并在4 °C下储存备用；
（4）电致发光传感器的制备：
1）将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨至如镜面般光滑，氮气吹干；
2）取5 µL、1 mg/mL的Zr-MOF水溶液滴加至玻碳电极表面，红外灯下烤干；
3）在修饰电极表面，滴加氯化钠和巯基乙酸混合溶液，其中氯化钠浓度为0.1mol/L、巯基乙酸浓度为1 %，并在红外灯下烤干；
4）继续滴加4 μL、浓度为0.05 mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐溶液，室温晾干；
5）滴加5 µL、10 μg/mL的CD44第一抗体，5 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面并在室温下自然晾干；
6）滴加5 µL、浓度为1 mg/mL的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，5 h后用pH7.4的PBS冲洗电极表面，并在室温下自然晾干；
7）滴加5 µL、不同浓度的标准CD44，4 ℃冰箱中自然晾干后用超纯水冲洗电极表面；
8）滴加5 µL、1 μg/mL带有铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗，用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，4 ℃环境下晾干完成传感器构建。
实施例2
（1）Zr-MOF的制备：
将0.1 g 氯化锆、0.02 g 4,4',4''-三甲酸三苯胺溶于10 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并逐滴加入0.8 mL冰乙酸，将上述混合溶转移至50 mL水热反应釜中，在140 oC下保温40 h，反应结束后冷却至室温，对产物离心、洗涤、真空干燥得到新型自增强电致发光体Zr-MOF；
（2）铜掺杂氧化钼的制备：
取14 g钼酸铵和0.3 g硫酸铜置于研钵中充分研磨后加入7 mL聚乙二醇-400中，继续研磨15 min后加入6 g草酸，研磨30 min后将上述物质在65 °C水浴锅中保温30 h，获得的产物于500 °C下高温煅烧3 h得到铜掺杂氧化钼粉末；
（3）铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗的制备：
取2 mg所制备的铜掺杂氧化钼溶于3 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液后，加入60 μL浓度为11 μg/mL的CD44二抗，于4 °C下震荡11 h后，离心留取底部沉淀，产物溶于4 mL的PBS缓冲溶液中并在4 °C下储存备用；
（4）电致发光传感器的制备：
1）将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨至如镜面般光滑，氮气吹干；
2）取5 µL、4 mg/mL的Zr-MOF水溶液滴加至玻碳电极表面，红外灯下烤干；
3）在修饰电极表面，滴加氯化钠和巯基乙酸混合溶液，其中氯化钠浓度为0.3mol/L、巯基乙酸浓度为3 %，并在红外灯下烤干；
4）继续滴加4 μL、浓度为0.08 mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐溶液，室温晾干；
5）滴加5 µL、12 μg/mL的CD44第一抗体，7 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面并在室温下自然晾干；
6）滴加5 µL、浓度为3 mg/mL的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，7 h后用pH7.4的PBS冲洗电极表面，并在室温下自然晾干；
7）滴加5 µL、不同浓度的标准CD44，4 ℃冰箱中自然晾干后用超纯水冲洗电极表面；
8）滴加5 µL、6 μg/mL带有铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗，用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，4 ℃环境下晾干完成传感器构建。
实施例3
（1）Zr-MOF的制备：
将0.2 g 氯化锆、0.05 g 4,4',4''-三甲酸三苯胺溶于20 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并逐滴加入2 mL冰乙酸，将上述混合溶转移至50 mL水热反应釜中，在160 oC下保温60h，反应结束后冷却至室温，对产物离心、洗涤、真空干燥得到新型自增强电致发光体Zr-MOF；
（2）铜掺杂氧化钼的制备：
取15 g钼酸铵和0.5 g硫酸铜置于研钵中充分研磨后加入10 mL聚乙二醇-400中，继续研磨15 min后加入8 g草酸，研磨30 min后将上述物质在80 °C水浴锅中保温40 h，获得的产物于600 °C下高温煅烧4 h得到铜掺杂氧化钼粉末；
（3）铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗的制备：
取3 mg所制备的铜掺杂氧化钼溶于5 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液后，加入80 μL浓度为15 μg/mL的CD44二抗，于4 °C下震荡12 h后，离心留取底部沉淀，产物溶于5 mL的PBS缓冲溶液中并在4 °C下储存备用；
（4）电致发光传感器的制备：
1）将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨至如镜面般光滑，氮气吹干；
2）取5 µL、5 mg/mL的Zr-MOF水溶液滴加至玻碳电极表面，红外灯下烤干；
3）在修饰电极表面，滴加氯化钠和巯基乙酸混合溶液，其中氯化钠浓度为0.5mol/L、巯基乙酸浓度为1 % ~ 5 %，并在红外灯下烤干；
4）继续滴加4 μL、浓度为0.1 mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐溶液，室温晾干；
5）滴加5 µL、15 μg/mL的CD44第一抗体，8 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面并在室温下自然晾干；
6）滴加5 µL、浓度为5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面， 8 h后用pH7.4的PBS冲洗电极表面，并在室温下自然晾干；
7）滴加5 µL、不同浓度的标准CD44，4 ℃冰箱中自然晾干后用超纯水冲洗电极表面；
8）滴加5 µL、8 μg/mL带有铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗，用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，4 ℃环境下晾干完成传感器构建。
实施例4
将上述实施例1 ~ 3所制备的电致发光传感器，用于检测CD44，步骤如下：
（1）将电化学工作站、超微弱光检测仪串联，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，制备的传感器为工作电极的标准三电极体系进行检测，电解液pH 8.4的0.5 mol/L的PBS缓冲溶液；
（2）电化学方法为循环伏安法，设置循环电压为0 ~ 1 V，运行段数为80，超微弱光检测仪光电倍增管高压设置为600 V，用PBS缓冲溶液依次稀释配制的CD44标准溶液进行检测；
（3）以不同CD44浓度为横坐标和对应的电致发光强度为纵坐标绘制工作曲线；
（4）将待测的血清样品代替CD44标准溶液进行检测。
本发明制备的检测CD44的电致发光传感器成功用于人体血清中CD44的检测，检测范围为0.50 pg/mL ~ 0.50 µg/mL，检测限为0.13 pg/mL，加标回收实验回收率在92.0% ~101%。
Claims (2)
1.一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）Zr-MOF的制备：
将0.05 ~ 0.2 g 氯化锆、0.01 ~ 0.05 g 4,4',4''-三甲酸三苯胺溶于8 ~ 20 mL N,N-二甲基甲酰胺中，并逐滴加入0.5 ~ 2 mL冰乙酸，将混合溶液转移至50 mL水热反应釜中，在120 ~ 160 oC下保温24 ~ 60 h，反应结束后冷却至室温，对产物离心、洗涤、真空干燥得到新型自增强电致发光体Zr-MOF；
（2）铜掺杂氧化钼的制备：
取10 ~ 15 g钼酸铵和0.1 ~ 0.5 g硫酸铜置于研钵中充分研磨后加入5 ~ 10 mL聚乙二醇-400中，继续研磨15 min后加入5 ~ 8 g草酸，研磨30 min后将上述研磨混合后的物质在50 ~ 80 °C水浴锅中保温20 ~ 40 h，获得的产物于400 ~ 600 °C下高温煅烧1 ~ 4 h得到铜掺杂氧化钼粉末；
（3）铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗的制备：
取0.5 ~ 3 mg所制备的铜掺杂氧化钼溶于2 ~ 5 mL、pH 7.4的PBS缓冲溶液后，加入50~ 80 μL浓度为10 ~ 15 μg/mL的CD44二抗，于4 °C下震荡8 ~ 12 h后，离心留取底部沉淀，产物溶于2 ~ 5 mL的PBS缓冲溶液中并在4 °C下储存备用；
（4）电致发光传感器的制备：
1）将玻碳电极用氧化铝抛光粉打磨至如镜面般光滑，氮气吹干；
2）取5 µL、1 ~ 5 mg/mL的Zr-MOF水溶液滴加至玻碳电极表面，红外灯下烤干；
3）在修饰电极表面，滴加氯化钠和巯基乙酸混合溶液，其中氯化钠浓度为0.1 ~ 0.5mol/L、巯基乙酸浓度为1 % ~ 5 %，并在红外灯下烤干；
4）继续滴加4 μL、浓度为0.05 ~ 0.1 mol/L的1-乙基-(3-二甲基氨基丙级)碳二亚胺盐酸盐溶液，室温晾干；
5）滴加5 µL、10 ~ 15 μg/mL的CD44第一抗体，5 ~ 8 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面并在室温下自然晾干；
6）滴加5 µL、浓度为1 ~ 5 mg/mL的牛血清白蛋白溶液于修饰电极表面，5 ~ 8 h后用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，并在室温下自然晾干；
7）滴加5 µL、不同浓度的标准CD44，4 ℃冰箱中自然晾干后用超纯水冲洗电极表面；
8）滴加5 µL、1 ~ 8 μg/mL带有铜掺杂氧化钼标记的CD44二抗，用pH 7.4的PBS冲洗电极表面，4 ℃环境下晾干完成传感器构建。
2.如权利要求1所述的一种用于检测CD44的电致发光传感器的制备方法，其特征在于，检测步骤如下：
（1）将电化学工作站、超微弱光检测仪串联，以Ag/AgCl电极为参比电极，铂电极为对电极，制备的传感器为工作电极的标准三电极体系进行检测，电解液pH为7.5 ~ 8.4的0.5mol/L的PBS缓冲溶液；
（2）电化学方法为循环伏安法，设置循环电压为0 ~ 1 V，运行段数为80，超微弱光检测仪光电倍增管高压设置为500 ~ 950 V，用PBS缓冲溶液依次稀释配制的CD44标准溶液进行检测；
（3）以不同CD44浓度为横坐标和对应的电致发光强度为纵坐标绘制工作曲线；
（4）将待测的血清样品代替CD44标准溶液进行检测。
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| CN105628764A (zh) * | 2016-02-25 | 2016-06-01 | 衡阳师范学院 | 一种检测尿酸的电化学传感器及其制备和应用 |
| CN109060905A (zh) * | 2018-07-02 | 2018-12-21 | 济南大学 | 锰掺杂硒化镉增强钨酸铋-硫化镉β淀粉样蛋白的竞争型光电化学传感器的制备方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 铜掺杂介孔TiO_2复合材料的制备及表征;姜欢;龚仲富;李明田;程娟;;安徽大学学报(自然科学版)(第06期);第70-77页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN115096963A (zh) | 2022-09-23 |
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