CN106769297A - 一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法 - Google Patents

一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法 Download PDF

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彭志勤
古锦翠
王秉
万军民
胡智文
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Abstract

本发明公开了一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，将样品经漂洗，溶解，透析除去小分子物质，浓缩之后得到样品溶液，然后利用溶液内酶切的方法将样品酶解，采用LC‑ESI‑MS/MS进行质谱分析，把所得到的氨基酸序列与数据库中的氨基酸序列进行比对，找到相匹配的多肽链从而确定样品的蛋白质种类；有益效果：1)采用蛋白质组学方法测定古代丝织品，克服了传统检测方法灵敏度低的问题，准确的得到丝织品的蛋白质种类；2)采用蛋白质组学方法测定古代丝织品，即便被测定丝织品受到环境影响材料结构发生了变化也可以被测出丝织品的材料来源；3)采用蛋白质组学测定古代丝织品，操作简便，准确度高，样品使用量少。

Description

一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法
技术领域
本发明涉及一种测定古代丝织品方法，更具体的说是涉及一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法。
背景技术
丝绸是中国古老文化的象征，丝绸文物是中华民族数千年文明史、科技发展史的珍贵实物见证，解决我国丝绸起源的问题不仅仅是探索华夏文明起源的需要，而且也是为“我国是世界上公认的丝绸起源地”这一说法提供更加信服的证据，目前对丝织品检测常用的方法如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，X-射线衍射等检测灵敏度低，受杂质干扰较大，主要适用于保存较好的丝织品分析。如果丝织品受到氧气，水，微生物等因素影响而发生降解，常用的检测方法即便能为丝织品残留物鉴定提供一些有用的信息但也很难对其做出准确的判断。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种快速，直观，简便的古代丝织品检测方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各2～8g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在50～60℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.4～0.6％的Na2CO3水溶液中沸煮20～40min进行脱胶，反复4～6次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在50～80ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放50～70min，用温水洗至溶液呈中性，在60～80℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在50～70℃温度下，放入90～110ml的质量分数为60～80％甲醇溶液中浸100～120min,再在50～70℃温度下，放入90～110ml无水乙醇中浸60～80min，接着在30～50℃温度下，放入90～110ml的丙酮溶液中浸60～80min,最后绞干浸入90～110ml的乙醚中50～70min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在96～98℃下煮50～70min，反复4～6次，在60～80℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，50～60℃下超声波振荡溶解2～3h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的11～13h内每隔1～3h左右换一次水，11～13h后每隔3～5h换一次水，23～25h后每隔7～9h换一次水，46～50h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/3～2/3；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各5g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在55℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液中沸煮30min进行脱胶，反复5次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在65ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放60min，用温水洗至溶液呈中性，在70℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在60℃温度下，放入100ml的质量分数为70％甲醇溶液中浸110min,再在60℃温度下，放入100ml无水乙醇中浸70min，接着在40℃温度下，放入100ml的丙酮溶液中浸70min,最后绞干浸入100ml的乙醚中60min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在97℃下煮60min，反复5次，在70℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，55℃下超声波振荡溶解2.5h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，48h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/2；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5ml和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入65ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
本发明的有益效果是：1)采用蛋白质组学方法测定古代丝织品，克服了传统检测方法灵敏度低的问题，根据从丝织品中提取出的蛋白质氨基酸序列与数据库的氨基酸序列比对，可以准确的得到丝织品的蛋白质种类；2)采用蛋白质组学方法测定古代丝织品，即便被测定丝织品受到环境影响材料结构发生了变化也可以被测出丝织品的材料来源；3)采用蛋白质组学测定古代丝织品，操作简便，准确度高，样品使用量少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细介绍：
一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各2～8g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在50～60℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.4～0.6％的Na2CO3水溶液中沸煮20～40min进行脱胶，反复4～6次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在50～80ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放50～70min，用温水洗至溶液呈中性，在60～80℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在50～70℃温度下，放入90～110ml的质量分数为60～80％甲醇溶液中浸100～120min,再在50～70℃温度下，放入90～110ml无水乙醇中浸60～80min，接着在30～50℃温度下，放入90～110ml的丙酮溶液中浸60～80min,最后绞干浸入90～110ml的乙醚中50～70min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在96～98℃下煮50～70min，反复4～6次，在60～80℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，50～60℃下超声波振荡溶解2～3h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的11～13h内每隔1～3h左右换一次水，11～13h后每隔3～5h换一次水，23～25h后每隔7～9h换一次水，46～50h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/3～2/3；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库(见附件1)对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
实施例1：一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各2g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在50℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.4％的Na2CO3水溶液中沸煮20min进行脱胶，反复4次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在50ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放50min，用温水洗至溶液呈中性，在60℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在50℃温度下，放入90ml的质量分数为60％甲醇溶液中浸100min,再在50℃温度下，放入90ml无水乙醇中浸60min，接着在30℃温度下，放入90ml的丙酮溶液中浸60min,最后绞干浸入90ml的乙醚中50min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在96℃下煮50min，反复4次，在60℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，50℃下超声波振荡溶解2h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000的透析袋透析，透析开始的11h内每隔1h左右换一次水，11h后每隔3h换一次水，23h后每隔7h换一次水，46h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/3；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.5％的二硫苏糖醇溶液2ml和质量分数为2.2％的碘乙酰胺溶液4ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入50ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
实施例2:一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各5g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在55℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液中沸煮30min进行脱胶，反复5次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在65ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放60min，用温水洗至溶液呈中性，在70℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在60℃温度下，放入100ml的质量分数为70％甲醇溶液中浸110min,再在60℃温度下，放入100ml无水乙醇中浸70min，接着在40℃温度下，放入100ml的丙酮溶液中浸70min,最后绞干浸入100ml的乙醚中60min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在97℃下煮60min，反复5次，在70℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，55℃下超声波振荡溶解2.5h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，48h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/2；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5ml和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入65ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
实施例3:一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，该方法采用如下步骤：
a)取古代文物样品A，B，C三组各8g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在60℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.6％的Na2CO3水溶液中沸煮40min进行脱胶，反复6次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在80ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放70min，用温水洗至溶液呈中性，在80℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在70℃温度下，放入110ml的质量分数为80％甲醇溶液中浸120min,再在70℃温度下，放入110ml无水乙醇中浸80min，接着在50℃温度下，放入110ml的丙酮溶液中浸80min,最后绞干浸入110ml的乙醚中70min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在98℃下煮70min，反复6次，在80℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，60℃下超声波振荡溶解3h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为14000的透析袋透析，透析开始的13h内每隔3h左右换一次水，13h后每隔5h换一次水，25h后每隔9h换一次水，50h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的2/3；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为2％的二硫苏糖醇溶液3ml和质量分数为2.8％的碘乙酰胺溶液5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入80ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸序列数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
附件一
柞蚕： Antheraea pernyi (2639aa)
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2581 gfvldggyds egsaaaaaaa aaaaasssgr steghpllsi ccrpcshshs yeasrisv

Claims (2)

1.一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，其特征在于采用的步骤如下：
a)取古代文物样品A，B，C三组各2～8g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在50～60℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.4～0.6％的Na2CO3水溶液中沸煮20～40min进行脱胶，反复4～6次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在50～80ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放50～70min，用温水洗至溶液呈中性，在60～80℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在50～70℃温度下，放入90～110ml的质量分数为60～80％甲醇溶液中浸100～120min，再在50～70℃温度下，放入90～110ml无水乙醇中浸60～80min，接着在30～50℃温度下，放入90～110ml的丙酮溶液中浸60～80min,最后绞干浸入90～110ml的乙醚中50～70min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在96～98℃下煮50～70min，反复4～6次，在60～80℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，50～60℃下超声波振荡溶解2～3h，获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始的11～13h内每隔1～3h左右换一次水，11～13h后每隔3～5h换一次水，23～25h后每隔7～9h换一次水，46～50h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/3～2/3；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液2～3ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液4～5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入50～80ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A，B，C三组样品的氨基酸序列与氨基酸数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
2.一种基于蛋白质组学测定古代丝织品的方法，其特征在于采用的步骤如下：
a)取古代文物样品A，B，C三组各5g，分析前将其用去离子水漂洗，去除表面残留的杂质后，在55℃的烘箱中烘干；
b)分别将古代文物样品以1:100的浴比在质量分数为0.5％的Na2CO3水溶液中沸煮30min进行脱胶，反复5次，然后将三组样品溶液分别和丝素分离，待丝素用去离子水冲洗绞干后，再在65ml质量分数为1％的盐酸溶液，于室温下浸放60min，用温水洗至溶液呈中性，在70℃的烘箱中烘干；
c)将由步骤b)脱盐烘干的丝素继续脱色和脱油蜡质，先在60℃温度下，放入100ml的质量分数为70％甲醇溶液中浸110min,再在60℃温度下，放入100ml无水乙醇中浸70min，接着在40℃温度下，放入100ml的丙酮溶液中浸70min,最后绞干浸入100ml的乙醚中60min，使用吹风机吹干；
d)将由步骤c)得到的丝素在97℃下煮60min，反复5次，在70℃的烘箱中烘干；
e)将由步骤d)处理之后的三组丝素样品分别放入质量分数为68％的硫氰酸锂溶液中，浴比为1：35，55℃下超声波振荡溶解2.5h,获得蚕丝溶液，冷却过滤之后用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始的12h内每隔2h左右换一次水，12h后每隔4h换一次水，24h后每隔8h换一次水，48h后得到丝素蛋白溶液,使用聚乙二醇6000浓缩至原体积的1/2；
f)向步骤e)得到的三组溶液分别加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2.5ml和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液4.5ml平衡缓冲液平衡，然后分别向三组溶液中加入65ul的胰凝乳蛋白酶溶液酶解，采用LC-ESI-MS/MS对其进行质谱分析，将通过质谱分析得到的A,B,C三组样品的氨基酸序列与氨基酸数据库对比，具有柞蚕丝素蛋白的特征序列的古代文物样品C来源于柞蚕丝。
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