CN106596970B - 一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，将古代牛毛微痕迹土样及表土层土样，生土层土样提取分离，通过采用二维电泳技术将蛋白质进行有效的分离同时比较三种样品的电泳结果，排除土壤中可能含有蛋白质的影响以及外界因素的干扰,将电泳结果中的条带割下来完成胶内酶切，然后进行质谱分析，根据质谱分析结果与蛋白质数据库中的氨基酸序列进行比较，即可实现蛋白质的鉴定。本发明采用蛋白质组学方法测定古代牛毛微痕迹，解决了普通分析测试在分析微痕迹残留物时束手无策的问题，通过蛋白质组学测定，准确的得到样品中的蛋白种类，判断微痕迹样品是否为牛毛微痕迹，一方面灵敏度高，操作简便，另一方面准确度高，样品使用量少。
Description
技术领域
本发明涉及一种测定古代牛毛微痕迹的方法，更具体的说是涉及一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法。
背景技术
牛毛是一种天然动物毛纤维，具有角质组织，坚韧并有弹性，可用于生产各种毛织品，是主要的毛纺工业原料。
中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的牛毛制品，这些牛毛及牛毛制品的主要成分是蛋白质，长期埋藏在地下环境中，受到湿、热和微生物等因素的影响，纤维会发生不同程度的降解；出土后因环境条件的剧烈变化，进一步加速了纤维的老化，因此，在漫长的历史进程中，当年埋入墓葬或遗址中的一些牛毛及其制品早已失去了实体面貌，降解成肽段和氨基酸，或者成为痕迹，或者化入泥土，在肉眼下已经无法辨识，且年代越早的证据越难寻觅，给牛毛类文物的鉴定和保护研究带来了很大的困难。
目前，普通的分析检测技术，如傅里叶红外光谱，拉曼光谱，X-衍射分析等，在遇到这种微痕迹类残留物分析时，往往束手无策，国内外对于牛毛微痕迹的鉴定，大多数还停留在对纤维形态的分析上，所得出的鉴定结果也没有十足的准确性；因此，寻找一种更为科学的手段来鉴定牛毛微痕迹是非常必要的。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足，而提供一种操作简单，结果准确的一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法。
为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，该方法采用如下步骤：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各25～30g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为5～7％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液3000～5400ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为4～6，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:40～60的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在30～50℃下搅拌40～50min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4000～5000r/min,温度为10～30℃，时间为25～30min；
(E)将质量分数为4～6％的亚硫酸氢钠、质量分数为2～5％的尿素以及质量分数为0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品50～100倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在90～110℃下反应3～5h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始后的前10～12h，每隔1.5～2.5h换一次水，10～12h后每隔6～8h换一次水，70～72h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩15～20min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为3.0-5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液0.5～3.5ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液0.5～5.5ml平衡缓冲液平衡15～20min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入300～400ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40～70ul，2～4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1～2ug，完全盖住胶粒冰浴40～50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1～2ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10～30uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤15～25min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10～30uL，振荡洗涤5～15min,并超声4～6min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液于～10～～30℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以500～700nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为50000～70000，每次扫描取强度最高的4～6个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，其特征在于采用步骤如下：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各27g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为6％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液4200ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为5，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:50的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在40℃下搅拌45min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4500r/min,温度为20℃，时间为27min；
(E)将质量分数为5％的亚硫酸氢钠、质量分数为3.5％的尿素以及质量分数为1％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品75倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在100℃下反应4h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始后的前11h，每隔2h换一次水，11h后每隔7h换一次水，71h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩17min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为4.2的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2ml和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液3ml平衡缓冲液平衡17min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入350ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液55ul，3min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1.5ug，完全盖住胶粒冰浴45min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于30℃烘箱中孵育11h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1.5ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成20uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤20min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液20uL，振荡洗涤10min,并超声5min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液于～20℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以600nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为60000，每次扫描取强度最高的5个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
本发明的有益效果是：本发明采用生物质谱技术对样品中的氨基酸进行定性和定量的分析，通过获取样品中多肽的序列信息来确定样品的蛋白质种类，本发明采用蛋白质组学方法测定古代牛毛微痕迹，解决了普通分析测试在分析微痕迹残留物时束手无策的问题，通过蛋白质组学测定，可根据蛋白质氨基酸序列，准确的得到样品中的蛋白种类，判断微痕迹样品是否为牛毛微痕迹，一方面，灵敏度高，操作简便，另一方面，准确度高，样品使用量少。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作详细介绍：
一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，该方法采用如下步骤：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各25～30g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为5～7％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液3000～5400ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为4～6，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:40～60的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在30～50℃下搅拌40～50min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4000～5000r/min,温度为10～30℃，时间为25～30min；
(E)将质量分数为4～6％的亚硫酸氢钠、质量分数为2～5％的尿素以及质量分数为0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品50～100倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在90～110℃下反应3～5h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始后的前10～12h，每隔1.5～2.5h换一次水，10～12h后每隔6～8h换一次水，70～72h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩15～20min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为3.0-5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液0.5～3.5ml和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液0.5～5.5ml平衡缓冲液平衡15～20min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入300～400ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40～70ul，2～4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1～2ug，完全盖住胶粒冰浴40～50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1～2ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10～30uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤15～25min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10～30uL，振荡洗涤5～15min,并超声4～6min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液于～10～～30℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以500～700nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为50000～70000，每次扫描取强度最高的4～6个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
实施例1：一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，该方法采用如下步骤：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各25g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为5％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液3000ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为4，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:40的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在30℃下搅拌40min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4000r/min,温度为10℃，时间为25min；
(E)将质量分数为4％的亚硫酸氢钠、质量分数为2％的尿素以及质量分数为0.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品50倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在90℃下反应3h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为8000的透析袋透析，透析开始后的前10h，每隔1.5h换一次水，10h后每隔6h换一次水，70h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩15min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为3.0的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5％的二硫苏糖醇溶液0.5ml和质量分数为2.2％的碘乙酰胺溶液0.5ml平衡缓冲液平衡15min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入300ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40ul，2min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1ug，完全盖住胶粒冰浴40min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25℃烘箱中孵育10h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为4％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤15min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为4％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10uL，振荡洗涤5min,并超声4min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.05％的三氟乙酸水溶液于～30℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以500nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为50000，每次扫描取强度最高的4个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
实施例2:一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，该方法采用如下步骤：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各27g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为6％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液4200ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为5，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:50的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在40℃下搅拌45min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4500r/min,温度为20℃，时间为27min；
(E)将质量分数为5％的亚硫酸氢钠、质量分数为3.5％的尿素以及质量分数为1％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品75倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在100℃下反应4h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始后的前11h，每隔2h换一次水，11h后每隔7h换一次水，71h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩17min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为4.2的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2ml和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液3ml平衡缓冲液平衡17min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入350ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液55ul，3min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1.5ug，完全盖住胶粒冰浴45min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于30℃烘箱中孵育11h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1.5ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成20uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤20min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液20uL，振荡洗涤10min,并超声5min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液于～20℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以600nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为60000，每次扫描取强度最高的5个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
实施例3:一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，该方法采用如下步骤：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各30g,用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为7％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液5400ml，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为6，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:60的浴比分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在50℃下搅拌50min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在5000r/min,温度为30℃，时间为30min；
(E)将质量分数为6％的亚硫酸氢钠、质量分数为5％的尿素以及质量分数为1.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品100倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在110℃下反应5h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为14000的透析袋透析，透析开始后的前12h，每隔2.5h换一次水，12h后每隔8h换一次水，72h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩20min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)的三组样品分别用pH范围为5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为2％的二硫苏糖醇溶液3.5ml和质量分数为2.8％的碘乙酰胺溶液5.5ml平衡缓冲液平衡20min，进行SDS～PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹。
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5ml离心管中，每管加入400ul水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液70ul，4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶2ug，完全盖住胶粒冰浴50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于35℃烘箱中孵育12h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的2ml离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成30uL的混合液，将所述混合液分别加入到步骤(J)中的离心管中，振荡洗涤25min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液30uL，振荡洗涤15min,并超声6min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)中的液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，加入质量分数为0.15％的三氟乙酸水溶液于～10℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以700nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)脱洗的三组样品放入LTQ～Qrbitrap XL质谱仪,使用正离子模式,离子间分辨率为70000，每次扫描取强度最高的6个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，其特征在于采用步骤如下：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各25～30g，用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为5～7％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液3000～5400mL，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为4～6，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:40～60的比例分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在30～50℃下搅拌40～50min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4000～5000r/min，温度为10～30℃，时间为25～30min；
(E)将质量分数为4～6％的亚硫酸氢钠、质量分数为2～5％的尿素以及质量分数为0.5～1.5％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品50～100倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在90～110℃下反应3～5h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为8000～14000的透析袋透析，透析开始后的前10～12h，每隔1.5～2.5h换一次水，10～12h后每隔6～8h换一次水，70～72h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩15～20min，备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)浓缩后的三组样品分别用pH范围为3.0～5.3的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.5～2％的二硫苏糖醇溶液0.5～3.5mL和质量分数为2.2～2.8％的碘乙酰胺溶液0.5～5.5mL，平衡缓冲液平衡15～20min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹；
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5mL离心管中，每管加入300～400μL水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液40～70μL，2～4min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1～2μg，完全盖住胶粒冰浴40～50min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于25～35℃烘箱中孵育10～12h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1～2mL离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成10～30μL的混合液，将所述混合液分别加入到经步骤(J)处理后的离心管中，振荡洗涤15～25min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为4～6％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液10～30μL，振荡洗涤5～15min，并超声4～6min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)获得的三组样品的最终液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，分别加入质量分数为0.05～0.15％的三氟乙酸水溶液于-10～-30℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以500～700nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)洗脱的三组样品放入LTQ～Orbitrap XL质谱仪，使用正离子模式，离子间分辨率为50000～70000，每次扫描取强度最高的4～6个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
2.一种基于蛋白质组学测定古代牛毛微痕迹的方法，其特征在于采用步骤如下：
(A)称取古代牛毛微痕迹土样，表土层土样和土层土样各27g，用研钵分别研磨三组样品，标记为A、B、C三组；
(B)配制质量分数为6％的过一硫酸氢钾复合盐水溶液4200mL，用饱和氢氧化钠对该溶液进行调节，以使溶液的pH为5，等量分为三组备用；
(C)将步骤(A)中的三组样品均按照1:50的比例分别放入步骤(B)配好的溶液中，然后在40℃下搅拌45min，三组实验在相同条件下独立操作；
(D)对经步骤(C)最终得到的三组样品使用高速冷冻离心机进行离心除去悬浮颗粒，转速控制在4500r/min，温度为20℃，时间为27min；
(E)将质量分数为5％的亚硫酸氢钠、质量分数为3.5％的尿素以及质量分数为1％的十二烷基苯磺酸钠进行混合以形成每组样品75倍质量的混合溶液；
(F)将步骤(E)中形成的混合溶液分别加入步骤(D)中离心完成后的三组样品中，并在100℃下反应4h后完成过滤；
(G)对经步骤(F)后的三组样品使用截留分子量为11000的透析袋透析，透析开始后的前11h，每隔2h换一次水，11h后每隔7h换一次水，71h后将得到的液体装入浓缩管中真空浓缩17min备用；
(H)通过重泡涨上样法将步骤(G)浓缩后的三组样品分别用pH范围为4.2的IPG胶条覆盖，使用液体石蜡密封之后等电聚焦，加入质量分数为1.7％的二硫苏糖醇溶液2mL和质量分数为2.5％的碘乙酰胺溶液3mL，平衡缓冲液平衡17min，进行SDS-PAGE凝胶电泳，使用质量分数为0.25％的卡马斯亮蓝，质量分数为50％的乙醇，质量分数为10％的乙酸对胶条染色，观察三组样品的电泳图像，如果A组电泳结果可以检测到明显的蛋白质条带而B，C组没有检测到，则说明土样中不含有蛋白质，蛋白质来源于古代牛毛微痕迹；
(I)将经步骤(H)染色三组样品的电泳条带割下来分别装入三个1.5mL离心管中，每管加入350μL水震荡洗涤，重复一次后向每管中加入乙腈与碳酸氢铵溶液1:1混合的脱色液55μL，3min之后用去离子水终止反应并重复洗涤一次，吸出多余的液体，然后将装有胶粒的离心管开盖置于真空浓缩仪中干燥；
(J)分别向步骤(I)所得的三组样品离心管中加入胰凝乳蛋白酶1.5μg，完全盖住胶粒冰浴45min使胶粒充分吸收酶解液溶胀然后置于30℃烘箱中孵育11h；
(K)将步骤(J)中的酶解液吸出，分别放到另外三个新的1.5mL离心管中，得到三组样品的原液；
(L)将质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成20μL的混合液，将所述混合液分别加入到经步骤(J)处理后的离心管中，振荡洗涤20min形成三组样品的第一新液，分别吸取同一组样品中的第一新液与同一组样品中的原液合并以获得三组样品的第二新液；
(M)向步骤(L)中的第二新液中再次加入质量分数为5％甲酸溶液和乙腈按照1：1的比例配成的混合液20μL，振荡洗涤10min，并超声5min以获得三组样品的第三新液，分别吸取同一组样品中的第三新液与同一组样品中的第二新液合并以形成三组样品的最终液体；
(N)将步骤(M)获得的三组样品的最终液体离心提纯，离心管置于真空浓缩仪浓缩抽干，分别加入质量分数为0.1％的三氟乙酸水溶液于-20℃冻存；
(O)将步骤(N)中形成的多肽混合溶液分别注入二氧化硅C18反向层析毛细管柱中，并以600nL/min的速度进行洗脱；
(P)将经步骤(O)洗脱的三组样品放入LTQ～Orbitrap XL质谱仪，使用正离子模式，离子间分辨率为60000，每次扫描取强度最高的5个母离子进行二级质谱检测；
(Q)对生物质谱检测的蛋白质氨基酸序列进行分析，如果A组含有牛毛角蛋白的特征肽段则可判定A为古代牛毛微痕迹。
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