CN105717291A - 一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及文物检测技术领域，公开了一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，包括：向PBS缓冲液中加入荧光微球、1?(3?二甲氨基丙基)?3?乙基碳二亚胺溶液和兔抗角蛋白抗体溶液，搅拌均匀后用牛血清蛋白溶液封闭后离心处理，将沉淀加入到PBS缓冲液中复溶混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液。将羊毛角蛋白稀释液和山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，烘干备用；将荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释后包被在荧光结合垫上，烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装并切割成条，制得检测试纸。本发明操作简单，检测试纸成本低，反应时间短，灵敏度高，适合考古现场的检测。

Description

一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法
技术领域
本发明涉及文物检测技术领域，尤其涉及一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法。
背景技术
羊毛是一种天然动物毛纤维。具有角质组织，呈现光泽，坚韧并有弹性。因其产量高、种类多，可生产多种毛织品，是主要的毛纺工业原料。中国历史悠久，从中国早期的墓葬中出土有大量的羊毛制品文物，出土的大量羊毛制品文物对研究古代社会环境和人文活动具有重要参考价值。
羊毛的主要成分是角蛋白，在酸、碱、盐、氧化剂、还原剂、卤素等中羊毛都具有一定的不稳定性。此外羊毛还容易受到多种环境因素，如光照、射线和微生物等的影响，造成角蛋白发生变性和分子链的断裂，从而使其降解破坏，传统的检测方法对文物样品要求较高，而出土的羊毛制品文物一般都有不同程度的破损，对于破损文物尤其是腐朽文物的检测存在一定难度。常用的酶联免疫的方法，实验时间较长，需要在实验室进行，且检测结果不够直观，不适合于考古现场分析，而取而代之的间接竞争法检测用的胶体金试纸在定量分析上有缺陷，相对灵敏度低，也亟需完善。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法。本发明方法操作简单，制备的古代羊毛织品间接竞争法检测试纸成本低，用于检测时定量分析准确性高，反应时间短，灵敏度高，更加直观，适合于考古现场的检测。
本发明的具体技术方案为：一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下：
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备：向每2.5-3.5mL的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的荧光微球、2.6-2.8μL的现配的浓度为4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12μL的浓度为0.4-0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用0.5-1.5wt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000r/min、4℃条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液保存备用。
B)试纸条的组装：用喷膜机将5-20体积份的羊毛角蛋白稀释液和5-20体积份的山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，在36-38℃下烘干备用；将5-20体积份的荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释10-20倍后包被在荧光结合垫上，在36-38℃下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
本发明利用免疫荧光层析技术的原理来检测古代墓葬中羊毛织品的痕迹，即将兔抗羊毛角蛋白抗体进行荧光标记，然后将荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体溶解在荧光结合垫上，将羊毛角蛋白标准品和山羊抗兔IgG(H+L)抗体分别喷在硝酸纤维素薄膜上形成检测线和质控线。样品加入样品吸收垫，样品中的液体首先溶解结合垫中含有的荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体，同时，样品中待测抗原与荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体结合，形成抗原-兔抗羊毛角蛋白抗体荧光复合物，并靠毛细作用向检测线移动。样品经过检测线时，样品中的抗原与硝酸纤维素膜上的抗原进行竞争兔抗羊毛角蛋白抗体。若样品中含有抗原，聚集在硝酸纤维素膜上的荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体就会减少，检测线不显荧光。抗原–荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体或者荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体（样品中不含有抗原）经过质控线，与山羊抗兔IgG(H+L)抗体反应，荧光标记的兔抗羊毛角蛋白抗体聚集在质控线上，在紫外照射下显出明显的荧光，且荧光强度可通过荧光定量仪测定。即若T/C（阳性）<T/C（阴性）证明样品中含有羊毛角蛋白；若T/C（阳性）>T/C（阴性），证明样品中未含有羊毛角蛋白或者羊毛角蛋白的浓度低于试纸条的检出限。
作为优选，步骤A）中所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，粒径为100-110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
作为优选，所述PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为5.5。
作为优选，步骤A）中所述牛血清蛋白溶液的用量为A混合液体积的1-1.2倍。
作为优选，步骤B)中所述硝酸纤维素膜的规格为长2.5cm，宽4mm。
作为优选，所述检测试纸的宽度为4mm。
作为优选，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为：将羊毛角蛋白用Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.5-4mg/mL。
作为优选，所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为：将浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液用Tris-HCl溶液稀释至100-400倍。
作为优选，所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的Tris-HCl溶液。
作为优选，步骤B)中所述Tris-HCl溶液的pH为8.2。
与现有技术对比，本发明的有益效果是：本发明方法操作简单，制备的古代羊毛织品间接竞争法检测试纸成本低，用于检测时定量分析准确性高，反应时间短，灵敏度高，显示更加直观，适合于考古现场的检测。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例1
一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下：
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备：向3mL的浓度为0.02mol/L（pH为5.5）的PBS缓冲液中依次加入0.15mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为105nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.7μL的现配的浓度为5mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和10μL的浓度为0.5mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌2h，用体积为A混合液体积1.1倍的1wt%的牛血清蛋白溶液封闭30min后在9000r/min、4℃条件下离心处理10min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液在4℃下保存备用。
B)试纸条的组装：用喷膜机将12.5μL羊毛角蛋白稀释液和12.5μL山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜（长2.5cm，宽4mm）的检测线和质控线上，在37℃下烘干备用；将12.5μL荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释15倍后包被在荧光结合垫上，在37℃下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成4mm宽的条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
其中，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为：将羊毛角蛋白用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.2mg/mL。所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为：将浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至250倍。所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的pH为8.2的Tris-HCl溶液。
C)取1g纺织品痕迹样，溶解于75ml、pH为8.2的Tris-HCl溶液中，搅拌均匀，2h后取一滴上清液滴在组装好的试纸条的样品垫上，设为阳性对照；取PBS7.4缓冲溶液一滴滴在试纸条的样品垫上，设为阴性对照；20min后，在波长为365nm的三用紫外分析仪照射下，用紫外定量仪测得检测线（T）和质控线（C）的荧光强度，结果为阳性对照的T/C=0.63<阴性对照的T/C=0.80，说明样品中含有羊毛角蛋白，该纺织品痕迹为羊毛织品的痕迹。
实施例2
一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下：
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备：向2.5mL的浓度为0.02mol/L（pH为5.5）的PBS缓冲液中依次加入0.14mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为100nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.6μL的现配的浓度为4mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8μL的浓度为0.4mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌1.5h，用体积为A混合液体积1倍的0.5wt%的牛血清蛋白溶液封闭25min后在8000r/min、4℃条件下离心处理8min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液在4℃下保存备用。
B)试纸条的组装：用喷膜机将5μL羊毛角蛋白稀释液和5μL山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜（长2.5cm，宽4mm）的检测线和质控线上，在36℃下烘干备用；将5μL荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释20倍后包被在荧光结合垫上，在36℃下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成4mm宽的条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
其中，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为：将羊毛角蛋白用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.5mg/mL。所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为：将浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至400倍。所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的pH为8.2的Tris-HCl溶液。
实施例3
一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下：
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备：向3.5mL的浓度为0.02mol/L（pH为5.5）的PBS缓冲液中依次加入0.16mg的聚苯乙烯荧光微球（粒径为110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm）、2.8μL的现配的浓度为6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和12μL的浓度为0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌2.5h，用体积为A混合液体积1.2倍的1.5wt%的牛血清蛋白溶液封闭35min后在10000r/min、4℃条件下离心处理12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液在4℃下保存备用。
B)试纸条的组装：用喷膜机将20μL羊毛角蛋白稀释液和20μL山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜（长2.5cm，宽4mm）的检测线和质控线上，在38℃下烘干备用；将20μL荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释10倍后包被在荧光结合垫上，在38℃下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成4mm宽的条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
其中，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为：将羊毛角蛋白用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至浓度为4mg/mL。所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为：将浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液用pH为8.2的Tris-HCl溶液稀释至100倍。所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的pH为8.2的Tris-HCl溶液。
以上实施例中所述的羊毛角蛋白、山羊抗兔抗体溶液均为市售产品，所述的兔抗角蛋白抗体可以为市售产品，也可自制，方法如下：
A）配制6wt%的一硫酸氢钾水溶液，用饱和氢氧化钠溶液将一硫酸氢钾水溶液的pH调节为4.2。接着按1:50的浴比将羊毛添加到溶液中，在33℃下水浴震荡1h。然后取出羊毛并用蒸馏水水洗过滤直至水洗液pH值为7。将羊毛加入到其70倍质量的混合溶液B中，所述混合溶液B中亚硫酸氢钠的浓度为5wt%，尿素的浓度为6M，皂素的浓度为0.5wt%，十二烷基苯磺酸钠的浓度为0.8wt%。在100℃下反应4h后过滤，得到粗角蛋白溶液，将粗角蛋白溶液装入截留分子量为14000的透析袋中，将透析袋浸泡于50-100倍质量的去离子水中透析4.5天，每隔8h更换去离子水，得到纯净角蛋白溶液，冷冻干燥后制得羊角蛋白粉。
B）用生理盐水将上述制得的羊角蛋白粉配制成1mg/mL的角蛋白溶液，将角蛋白溶液与QuickAntibody-Rabbit5W佐剂按体积比1:1混合，得到免疫抗原液，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行初次免疫；在初次免疫后的第3、5周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行加强免疫；在进行初次免疫后的第7、9周时，使用免疫抗原液对兔子进行皮下多点注射，进行再加强免疫。在对兔子进行初次免疫、加强免疫以及再加强免疫过程中，每个注射点的注射量为100μL。当兔子血样中的抗体效价达到1:20000时，收集兔子血液。
C）将收集到的血液置于室温下凝固，然后将凝固血液置于37℃的温箱内放置30min，再置于4℃的冰箱中12h，使血块充分收缩并得到完全析出的粗抗血清；收集粗抗血清，在4℃环境中，在3000g条件下离心15min，取上清液即为抗血清，放置于-80℃储存备用。
D）将蛋白A填料与磷酸盐缓冲溶液按1.5g/6.5mL的配比混合，搅拌后抽真空23min，得到无气泡的蛋白A填料液；然后将6.5体积份的蛋白A填料液在无气泡条件下加入到玻璃柱中，得到蛋白柱；用20体积份的浓度为0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱进行清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液将15体积份的抗血清稀释至20体积份，稀释后加入到蛋白柱中进行上样，重复上样一次；用30体积份的浓度为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液对蛋白柱再次清洗，清洗流速为60mL/h；用浓度为0.2mol/L、pH为3.0的甘氨酸溶液对抗体进行洗脱；洗脱后用0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤蛋白柱，制得兔抗角蛋白抗体，将抗体装于离心管中并于4℃保存待用。上述所用的磷酸盐缓冲溶液的浓度为0.05mol/L，pH为7.4。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于步骤如下：
A)荧光标记兔抗角蛋白抗体的制备：向每2.5-3.5mL的PBS缓冲液中依次加入0.14-0.16mg的荧光微球、2.6-2.8μL的现配的浓度为4-6mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺溶液和8-12μL的浓度为0.4-0.6mg/mL的兔抗角蛋白抗体溶液，得到A混合液，将所述A混合液在室温下搅拌1.5-2.5h，用0.5-1.5wt%的牛血清蛋白溶液封闭25-35min后在8000-10000r/min、4℃条件下离心处理8-12min，移除上清液，将沉淀加入到体积为兔抗角蛋白抗体溶液30倍的PBS缓冲液中复溶、混匀，制得荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液，将所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液保存备用；
B)试纸条的组装：用喷膜机将5-20体积份的羊毛角蛋白稀释液和5-20体积份的山羊抗兔抗体稀释液分别喷在硝酸纤维素膜的检测线和质控线上，在36-38℃下烘干备用；将5-20体积份的荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释10-20倍后包被在荧光结合垫上，在36-38℃下烘干备用；将样品垫、荧光结合垫、硝酸纤维素膜和吸水垫依次组装在PVC底板上，并切割成条状，制得检测试纸，将所述检测试纸放入带干燥剂的铝箔袋中密封储存。
2.如权利要求1所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤A）中所述荧光微球为聚苯乙烯荧光微球，粒径为100-110nm，激发波长为365nm，发射波长为610nm。
3.如权利要求1所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，所述PBS缓冲液的浓度为0.02mol/L，pH为5.5。
4.如权利要求1或3所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤A）中所述牛血清蛋白溶液的用量为A混合液体积的1-1.2倍。
5.如权利要求1所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述硝酸纤维素膜的规格为长2.5cm，宽4mm。
6.如权利要求1或5所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，所述检测试纸的宽度为4mm。
7.如权利要求1所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，所述羊毛角蛋白稀释液的制备方法为：将羊毛角蛋白用Tris-HCl溶液稀释至浓度为0.5-4mg/mL。
8.如权利要求7所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，所述山羊抗兔抗体稀释液的制备方法为：将浓度为1mg/mL的山羊抗兔抗体溶液用Tris-HCl溶液稀释至100-400倍。
9.如权利要求8所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，所述荧光标记兔抗角蛋白抗体溶液稀释所用的稀释溶液包括0.15wt%的吐温-20，1%的牛血清蛋白、5%的蔗糖和余量的Tris-HCl溶液。
10.如权利要求7、8、9之一所述的一种古代羊毛织品间接竞争法检测试纸的制备方法，其特征在于，步骤B)中所述Tris-HCl溶液的pH为8.2。
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