CN109856406B - 一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用。本发明所提供的试纸条包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板，所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体‑生物素偶联物，所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素‑荧光微球标记物，所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬细小病毒VP2‑2a表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、操作简单、经济实用等优点，可实现犬细小病毒抗体现场快速定量检测。

Description

一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及犬细小病毒抗体的检测，具体涉及一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条及其制备方法和应用。

技术背景

犬细小病毒病是由犬细小病毒引起的一种急性传染病，临床主要表现为出血型肠炎、非化脓性心肌炎和白细胞减少症，是危害养犬业发展的主要疫病之一。犬细小病毒(Canine Parvovirus，CPV)属于细小病毒科细小病毒属，病毒粒子无囊膜，核衣壳为等轴对称的20面体，电镜下呈圆形或六边形，直径为21～24nm。CPV基因主要编码4种蛋白(VPl、VP2、NSl、NS2)，其中VPl和VP2为结构蛋白，NSl和NS2为非结构蛋白。此外，成熟的病毒粒子还含有VP3蛋白。目前研究较多的主要是VP2结构蛋白，CPV的中和抗原位点位于VP2上，VP2蛋白是CPV的免疫原性蛋白，编码CPV的主要抗原决定簇，可诱导机体产生中和抗体。

犬细小病毒病主要是通过疫苗预防，而疫苗免疫动物与感染动物体内都会产生结构蛋白抗体，因此检测结构蛋白抗体的诊断方法能确定动物对病毒株的抵抗力。同时日常监测疫苗产生抗体是对群体的日常监测选择疫苗、评估免疫程序合理性、掌握健康状态的重要手段，同时也可从侧面反映管理是否合理，也是适时注射疫苗的主要依据。

目前已建立的用于检测CPV抗体的血清学方法主要有血凝抑制试验、中和试验、ELISA法及免疫胶体金法等。血凝抑制试验需要新鲜且敏感性高的红细胞，检测时间需要2～3h；中和试验操作繁琐，需要较高的试验条件和操作水平，整个试验需1～2周的时间才能出结果；ELISA方法操作要求高，需要酶标仪测定结果，且不适合做单个样本的检测；免疫胶体金法虽然检测方便，不需专业技术人员和工作环境，但其检测的灵敏度低，且只能定性，检测范围窄。这些都限制了它们在犬细小病毒抗体临床检测中的应用，因此，本发明专利的目的就是克服以上几种方法的缺点，建立一种操作简便、灵敏、特异、快速的犬细小病毒抗体定量检测方法，应用于犬细小病毒免疫效果的监测，从而限制犬细小病毒的流行。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条。

本发明所提供的犬细小病毒抗体荧光检测试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板；所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬细小病毒VP2-2a表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体。

所述结合物释放垫a上采用的鸡抗犬抗抗体为鸡抗犬IgG的IgY，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗抗体为羊抗鸡IgY的IgG。

所述样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在所述底板上。

本发明的另一个目的是提供一种上述犬细小病毒抗体荧光检测试纸条的制备方法，其包括步骤：

1)制备具有包被有犬细小病毒VP2-2a表达蛋白的检测线和包被有羊抗鸡抗抗体的质控线的硝酸纤维素膜；

2)制备喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a和喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；

3)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。

具体地说，步骤包括：

1)犬细小病毒VP2-2a蛋白的表达及纯化；

2)将1)表达的犬细小病毒VP2-2a蛋白包被在硝酸纤维素膜上构成检测线(T)，将市售的羊抗鸡抗抗体包被在硝酸纤维素膜上构成质控线(C)；

3)将市售的鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，即为结合物释放垫a，置于干燥环境中保存备用；

4)将链霉亲和素加入到已活化的荧光微球溶液中，制备链霉亲和素-荧光微球标记物；

5)将4)制备的链霉亲和素-荧光微球标记物喷涂在结合物释放垫上，37℃烘干2h后取出，即为结合物释放垫b，置于干燥环境中保存备用；

6)将样品吸收垫用含0.5％牛血清白蛋白(BSA)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用；

7)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在底板上，用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。

上述犬细小病毒抗体荧光检测试纸条在检测犬细小病毒抗体中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的犬细小病毒抗体荧光检测试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物和链霉亲和素-荧光微球标记物分别固定于两张结合物释放垫上，样品中的犬细小病毒抗体在流动过程中，先与结合物释放垫a上的鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物结合，再通过生物素-链霉亲和素系统与结合物释放垫b上的链霉亲和素-荧光微球标记物结合，形成抗体-抗抗体-荧光微球复合物。样本中的抗体被硝酸纤维素膜检测线上的犬细小病毒VP2-2a表达蛋白捕获，通过荧光层析分析仪定量检测样本中犬细小病毒抗体滴度。

本发明的试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，将荧光微球标记在链霉亲和素上，有效减少了标记荧光微球时可能产生的空间位阻，提高了抗原-抗体的结合效率，对提高检测灵敏度有较大帮助；并且通过生物素-链霉亲和素系统的多层次放大作用，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，还可降低操作误差，提高测定的精确度。本发明试纸条可实现犬细小病毒抗体现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。

附图说明

图1为试纸条剖面结构示意图。

图2为犬细小病毒抗体检测标准曲线图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不用来限制本发明的范围。另外，本领域的技术人员在所附权利要求书限定的范围内可能会对本发明进行各种改动或修饰，这些改动或修饰同样应落入本发明的保护范围。

实施例1：犬细小病毒抗体荧光检测试纸条的构成(图1)

所述试纸条是由底板(8)、样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)组成；

所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)依次按顺序粘贴在PS底板(8)上；结合物释放垫a(2)从起始端有1/4区域被样品吸收垫(1)覆盖，结合物释放垫b(3)从起始端有1/4区域被结合物释放垫a(2)覆盖，结合物释放垫b(3)的末端与硝酸纤维素膜(4)的始端连接，硝酸纤维素膜(4)的末端与吸水垫(5)的始端相连，样品吸收垫(1)的始端与PS底板(8)的始端对齐，吸水垫(5)的末端与PS底板(8)的末端对齐；

所述硝酸纤维素膜(4)上有检测线(6)和质控线(7)，检测线(T)和质控线(C)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线(6)位于靠近结合物释放垫b(3)的末端的一侧；质控线(7)位于远离结合物释放垫b(3)的末端的一侧。将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。

实施例2：实施例1中所述试纸条的制备

该试纸条的制备方法主要包括以下步骤：

1)制备具有包被有犬细小病毒VP2-2a表达蛋白的检测线和包被有羊抗鸡抗抗体的质控线的硝酸纤维素膜；

2)制备喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a和喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；

3)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。

下面分步详细叙述：

(一)各部件的制备

1.犬细小病毒VP2-2a蛋白的表达及纯化

(1)VP2部分基因序列选择

①DNA序列：ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACCAGACGGTGGTCAGCCTGCTGTCAGAAATGAAAGAGCTACAGGATCTGGGAACGGGTCTGGAGGCGGGGGTGGTGGTGGTTCTGGGGGTGTGGGGATTTCTACGGGTACTTTCAATAATCAGACGGAATTTAAATTTTTGGAAAACGGATGGGTGGAAATCACAGCAAACTCAAGCAGACTTGTACATTTAAATATGCCAGAAAGTGAAAATTATAGAAGAGTGGTTGTAAATAATTTGGATAAAACTGCAGTTAACGGAAACATGGCTTTAGATGATACCCAGCACAAATTGTAACACCTTGGTCATTGGTTGATGCAAATGCTTGGGGAGTTTGGTTTAATCCAGGAGATTGGCAACTAATTGTTAATACTATGAGTGAGTTGCATTTAGTTAGTTTTGAACAAGAAATTTTTAATGTTGTTTTAAAGACTGTTTCAGAATCTGCTACTCAGCCACCAACTAAAGTTTATAATAATGATTTAACTGCATCATTGATGGTTGCATTAGATAGTAATAATACTATGCCATTTACTCCAGCAGCTATGAGATCTGAGACATTGGGTTTTTATCCATGGAAACCAACCATACCAACTCCATGGAGATATTATTTTCAATGGGATAGAACATTAATACCATCTCATACTGGAACTAGTGGCACACCAACAAATATATACCATGGTACAGATCCAGATGATGTTCAATTTTATACTATTGAAAATTCTGTGCCAGTACACTTACTAAGAACAGGTGATGAATTTGCTACAGGAACATTTTTTTTTGATTGTAAACCATGTAGACTAACACATACATGGCAAACAAATAGAGCATTGGGCTTACCACCATTTCTAAATTCTTTGCCTCAAGCTGAAGGAGGTACTAACTTTGGTTATATAGGAGTTCAACAAGATAAAAGACGTGGTGTAACTCAAATGGGAAATACAAACATTATTACTGAAGCTACTATTATGAGACCAGCTGAGGTTGGTTATAGTGCACCATATTATTCTTTTGAGGCGTCTACACAAGGGCCATTTAAAACACCTATTGCAGCAGGACGGGGGGGAGCGCAAACAGATGAAAATCAAGCAGCAGATGGTGATCCAAGATATGCATTTGGTAGACAACATGGTCAAAAAACTACCACAACAGGAGAAACACCTGAGAGATTTACATATATAGCACATCAAGATACAGGAAGATATCCAGAAGGAGATTGGATTCAAAATATTAACTTTAACCTTCCTGTAACAAATGATAATGTATTGCTACCAACAGATCCAATTGGAGGTAAAACAGGAATTAACTATACTAATATATTTAATACTTATGGTCCTTTAACTGCATTAAATAATGTACCACCAGTTTATCCAAATGGTCAAATTTGGGATAAAGAATTTGATACTGACTTAAAACCAAGACTTCATGTAAATGCACCATTTGTTTGTCAAAATAATTGTCCTGGTCAATTATTTGTAAAAGTTGCGCCTAATTTAACAAATGAATATGATCCTGATGCATCTGCTAATATGTCAAGAATTGTAACTTACTCAGATTTTTGGTGGAAAGGTAAATTAGTATTTAAAGCTAAACTAAGAGCCTCTCATACTTGGAATCCAATTCAACAAATGAGTATTAATGTAGATAACCAATTTAACTATGTACCAAGTAATATTGGAGGTATGAAAATTGTATATGAAAAGTCTCAACTAGCACCTAGAAAATTATATTAA

②蛋白序列：MSDGAVQPDGGQPAVRNERATGSGNGSGGGGGGGSGGVGISTGTFNNQTEFKFLENGWVEITANSSRLVHLNMPESENYRRVVVNNLDKTAVNGNMALDDTHAQIVTPWSLVDANAWGVWFNPGDWQLIVNTMSELHLVSFEQEIFNVVLKTVSESATQPPTKVYNNDLTASLMVALDSNNTMPFTPAAMRSETLGFYPWKPTIPTPWRYYFQWDRTLIPSHTGTSGTPTNIYHGTDPDDVQFYTIENSVPVHLLRTGDEFATGTFFFDCKPCRLTHTWQTNRALGLPPFLNSLPQAEGGTNFGYIGVQQDKRRGVTQMGNTNIITEATIMRPAEVGYSAPYYSFEASTQGPFKTPIAAGRGGAQTDENQAADGDPRYAFGRQHGQKTTTTGETPERFTYIAHQDTGRYPEGDWIQNINFNLPVTNDNVLLPTDPIGGKTGINYTNIFNTYGPLTALNNVPPVYPNGQIWDKEFDTDLKPRLHVNAPFVCQNNCPGQLFVKVAPNLTNEYDPDASANMSRIVTYSDFWWKGKLVFKAKLRASHTWNPIQQMSINVDNQFNYVPSNIGGMKIVYEKSQLAPRKLY

(2)表达纯化

①直接基因合成，连接载体到PGEX-6P-1上，酶切位点为EcoR1、XhoI；

②诱导条件：37℃摇到OD600左右，加1mmol/L的IPTG诱导，37℃、200r/min诱导3h左右，收菌；

③纯化蛋白条件：100mL菌用200mL平衡液重悬，超声(功率25％，超声70min)，离心(10000r/min，离心20min)，收上清，过GST柱。

(3)纯化流程

①样品准备：样品在上样前建议由0.45μm滤膜过滤，减少杂质，提高蛋白纯化效率和防止堵塞柱子；

②样品纯化：将柱装入层析柱，用5倍柱体积的结合buffer进行平衡；将样品加入到平衡好的柱子中，反复两次；用5倍柱体积的洗杂buffer进行清洗；用5～10倍体积的洗脱buffer，收集洗脱液，即目的蛋白组分。

(4)SDS-PAGE检测

使用SDS-PAGE检测纯化效果，发现在50～70kDa中间有一道明显的条带，与目的蛋白大小相符，证明已成功表达目的蛋白。

2.链霉亲和素-荧光微球标记物的制备

(1)荧光微球的活化

取4℃放置的1％荧光微球，恢复室温，摇匀后以移液器取50μL置PE管内，加入450μL超纯水进行10倍稀释(0.1％，体积分数)，此为工作液；称取活化剂EDC、NHS，以选定比例分别加入工作液内，避光振荡，反应15min；15000r/min离心10min；弃去上清，取500μL PBS复溶，摇匀。

MES溶液配制：称取1.82g MES溶于90mL超纯水中，以2mol/L NaOH调节至所需pH，定容至100mL，分装冻存，使用前回复至室温。

活化剂EDC配制：称取10mg EDC，吸取上述配制的MES溶液1mL溶解，使终浓度为10mg/mL，避光，现配现用。

活化剂NHS配制：称取10mg NHS，吸取上述配制的MES溶液1mL溶解，使终浓度为10mg/mL，避光，现配现用。

(2)链霉亲和素-荧光微球标记物的制备

将链霉亲和素以PBS稀释至1mg/mL，添加20μL到已活化的荧光微球(500μL)内，混匀，避光振荡，标记4h；15000r/min离心10min，弃去上清。

(3)链霉亲和素-荧光微球标记物的封闭

取500μL封闭液将已标记好的荧光微球复溶，避光振荡，封闭1h；15000r/min离心10min，弃去上清。

封闭液：含5％BSA(质量分数)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

(4)链霉亲和素-荧光微球标记物的复溶

取500μL复溶液将已封闭好的链霉亲和素-荧光微球标记物复溶，混匀后置4℃冰箱备用。

复溶液：含0.5％BSA(质量分数)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。

3.结合物释放垫的制备

将结合物释放垫浸泡于含0.3％Cas(质量分数)、pH 7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿2h，37℃烘干备用。用Bio dot划膜仪将市售的鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物均匀喷涂在结合物释放垫上(结合物释放垫a)，每1cm结合物释放垫喷涂0.7μL鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物，然后置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

用Bio dot划膜仪将制备好的链霉亲和素-荧光微球标记物均匀喷涂在结合物释放垫上(结合物释放垫b)，每1cm结合物释放垫喷涂0.5μL链霉亲和素-荧光微球标记物，然后置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。

4.硝酸纤维素膜的制备

将表达的犬细小病毒VP2-2a蛋白包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将羊抗鸡抗抗体包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。

包被过程：用磷酸缓冲液将表达的犬细小病毒VP2-2a蛋白稀释到500μg/mL，用Biodot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为1.0μL/cm；用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗鸡抗抗体稀释到300μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为1.0μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃条件下干燥16h，备用。

5.样品吸收垫的制备

将样品吸收垫用含0.5％BSA、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。

(二)各部件的组装

将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PS底板上；结合物释放垫a从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫b从起始端有1/4区域被结合物释放垫a覆盖，结合物释放垫b的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PS底板的始端对齐，吸水垫的末端与PS底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线(T)和质控线(C)，检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫b的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫b的末端的一侧。将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。

实施例3：实施例1中所述试纸条的使用

1.样本的制备

(1)血浆样本：用抗凝管采血，或在采血管内先加入EDTA抗凝剂，将采集血液加入并缓慢摇匀，3000～5000r/min室温离心10～30min(依采血量适量调整)。吸取上层黄色清亮液体即为血浆样本。

(2)血清样本：将采集血液加入采血管内(不含抗凝剂)，室温倾斜放置，待上层有黄色清亮液体析出时3000～5000r/min室温离心10～30min(依采血量适量调整)。吸取上层黄色清亮液体即为血清样本。

(3)样本稀释：取已恢复至室温的上述样本，以移液器准确吸取5μL加入样本稀释管(含1000μL pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液)内，充分混匀，此为待测液，垂直放置，待测。

2.试纸条检测

用移液器取待测液70μL垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应10min，加样孔端在外，将试纸条插入荧光层析分析仪的检测孔中，按下检测键，将自动对试纸条进行判读。若未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，应用新的试纸条重新测试。

3.检测结果判读

将犬细小病毒抗体标准品用样本稀释液配制成系列浓度：0、1/1024、1/256、1/64、1/16、1/4，取70μL滴加到试纸条的加样孔中，10min后通过荧光层析分析仪读出检测线与质控线信号强度的比值，即T/C值(每个浓度点分别测定4次，取平均值)，绘制相应的标准曲线(图2)。

利用上述标准曲线检测临床样品，将绘制的标准曲线Y＝(a-d)/[1+(x/c)^b]+d中的a、b、c，d值输入荧光层析分析仪即可在测定实际样品时直接得出实际样品中犬细小病毒抗体的滴度。

结果解释：

检测结果	临床应用参考
		<1	抗体水平极低，如动物健康，建议立即接种疫苗
1～3	抗体水平较低，如动物健康，建议适时接种疫苗
		3～4	抗体水平适中，动物得到一定保护，建议定期监测抗体水平
4～5	抗体水平较高，动物得到一定保护，应避免接触野毒
		5～6	抗体水平高，动物得到保护，应避免接触野毒
>6	抗体水平很高，动物近期有接触野毒风险，需密切观察

实施例4：实施例1中所述试纸条的评价

1.精密度测定

将犬细小病毒抗体标准品用样本稀释液配制成系列浓度：1/1024、1/64、1/4，分别用试纸条进行检测(每个浓度每批次分别检测24次平行，共检测三批)。

各浓度的批内最大CVs为8.8％，平均CVs为6.2％；各浓度的批间最大CVs为9.3％，平均CVs为7.2％，表明本发明所提供的试纸条具有良好的重复性。

2.稳定性测定

将制备好的试纸条放置在4℃、25℃、37℃、45℃环境中进行加速试验。分别在7d、14d、21d及28d取出，并用其检测实际样品中犬细小病毒抗体的滴度。对实测浓度和实际样品浓度数值进行误差分析，得到CV值在10％以内的结果，表明本发明所提供的试纸条具有良好的稳定性。

3.相关性测定

使用本发明的试纸条和对照ICL公司的梳式酶免试剂盒，对52份犬血清样本同时进行测定，对测定值进行相关性分析，结果显示，两种方法的相关系数为R²＝0.916，表明本发明的试纸条与进口试剂测定结果的相关性良好，具有很好的特异性和准确性。

Claims (2)

1.一种犬细小病毒抗体荧光检测试纸条，包括样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫及底板，其特征在于：所述结合物释放垫a上喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有犬细小病毒VP2-2a表达蛋白，所述质控线上包被有羊抗鸡抗抗体；所述结合物释放垫a上采用的鸡抗犬抗抗体为鸡抗犬IgG的IgY，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗鸡抗抗体为羊抗鸡IgY的IgG；所述样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在所述底板上。

2.一种权利要求1所述的犬细小病毒抗体荧光检测试纸条的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）制备具有包被有犬细小病毒VP2-2a表达蛋白的检测线和包被有羊抗鸡抗抗体的质控线的硝酸纤维素膜；

2）制备喷涂有鸡抗犬抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a和喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；

3）将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上。

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