CN112946252A - 鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于食品质量安全检测技术领域，涉及牛羊肉中掺杂鸭肉的鉴别，具体涉及一种鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条及其制备方法和应用。所述荧光试纸条包括底板，互相连接并顺次固定在底板上的样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜和吸水垫；所述结合物释放垫a上喷涂有兔抗鸭抗抗体‑生物素偶联物；所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素‑荧光微球标记物；所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有鸭IgY，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。本发明所得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。
Description
技术领域
本发明属于食品质量安全检测技术领域，涉及牛羊肉中掺杂鸭肉的鉴别，具体涉及一种鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，随着社会的发展和经济水平的提高，人们的饮食结构发生了重大的改变，肉及肉制品逐渐成为人们日常饮食中的重要组成部分。但与此同时，也出现了许多肉制品掺假现象，许多不法商贩以价格低廉的鸡肉、鸭肉以及其它动物肉类冒充价格较高的牛肉、羊肉，赚取高额利润。这种欺诈行为不仅损害消费者的权益，扰乱了市场秩序，而且牵涉到了宗教信仰问题，可能引发民族矛盾，对民族团结造成严重危害。因此，建立准确、灵敏、快速的肉类掺假鉴别方法，对保障肉及肉制品安全、维护消费者权益都具有重要的现实意义。
目前针对肉及肉制品掺假问题，采用的检测技术主要为基于蛋白质的酶联免疫吸附技术(ELISA)与蛋白质谱技术，基于代谢物的红外光谱、电子鼻与电子舌技术，以及基于核酸的PCR技术等。其中，ELISA方法虽然简单，但容易受到加热及蛋白变性等因素的影响，应用并不广泛；蛋白质谱技术因为操作复杂，目前主要被用于某些如牛奶、蜂胶等含DNA较少的产品的鉴别；电子鼻、电子舌及近红外广谱等技术用于肉类品种的鉴别准确度较低，目前主要用于肉的品质分析；基于核酸的PCR技术是目前肉类鉴别的主流技术，但需要昂贵的仪器、专业的操作人员，检测过程繁琐且费时多，而且DNA技术的高灵敏度导致其容易被污染，这一方面对样品的采集有更高的要求，另一方面对检测的环境也有更高的要求，这些缺点导致其并不适合大规模推广及应用。
因此，针对现有肉及肉制品掺假检测技术上的不足，需要设计一种方法特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低、适合于批量样品的筛选检测的快速筛选手段，以更好地满足我国食品监管部门等开展检测工作。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是：提供一种特异性好、灵敏度高、操作简便、检测成本低的鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条及其制备方法和应用。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条，所述荧光试纸条包括底板，互相连接并顺次固定在底板上的样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述结合物释放垫a上喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物；
所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；
所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有鸭IgY，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。
进一步的，上述的荧光试纸条中，所述结合物释放垫a上采用的兔抗鸭抗抗体为兔抗鸭IgY的IgG，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗兔二抗为羊抗兔IgG的IgG。
进一步的，上述的荧光试纸条中，所述样品吸收垫的材质为玻璃纤维素膜，所述结合物释放垫a和结合物释放垫b的材质为聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸。
本发明提供的另一技术方案为：提供一种上述荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a；
制备喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；
制备具有包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜；
2)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上，得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条。
进一步的，上述的荧光试纸条的制备方法中，所述步骤制备喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a具体为：
将结合物释放垫浸泡于磷酸盐缓冲液中，用Bio dot划膜仪将兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物均匀喷涂在结合物释放垫a上，置于温度为37℃湿度小于20％的环境中2h后，得喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a。
进一步的，上述的荧光试纸条的制备方法中，所述步骤制备喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b具体为：
将链霉亲和素添加到已活化的荧光微球溶液中，得链霉亲和素-荧光微球标记物；
用Bio dot划膜仪将所述链霉亲和素-荧光微球标记物喷涂在结合物释放垫b上，置于温度为37℃湿度小于20％的环境中2h后，得喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b。
进一步的，上述的荧光试纸条的制备方法中，所述步骤制备具有包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜，具体为：
用磷酸缓冲液将鸭IgY稀释后，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线；
用磷酸盐缓冲液将羊抗兔二抗稀释后，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线；
将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃条件下干燥16h得包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜。
进一步的，上述的荧光试纸条的制备方法中，所述步骤2)前还包括步骤：
将样品吸收垫用含1％质量百分数的BSA、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h。
本发明提供的又一技术方案为：提供一种上述荧光试纸条在鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明所得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，将荧光微球标记在链霉亲和素上，有效减少了标记荧光微球时可能产生的空间位阻，提高了抗原-抗体的结合效率，对提高检测灵敏度有较大帮助；并且通过生物素-链霉亲和素系统的多层次放大作用，在提高灵敏度的同时，并不增加非特异性干扰，还可降低操作误差，提高测定的精确度。本发明试纸条可实现牛羊肉中掺杂鸭肉的现场快速检测，具有较高的实用价值和推广价值。
附图说明
图1为本发明具体实施方式中的鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条的结构示意图；
标号说明：
1、样品吸收垫；2、结合物释放垫a；3、结合物释放垫b；4、硝酸纤维素膜；5、吸水垫；6、检测线；7、质控线；8、底板。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。
本发明最关键的构思在于：本发明的荧光试纸条采用高度特异性的抗体抗原反应及免疫层析分析技术，将兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物和链霉亲和素-荧光微球标记物分别固定于两张结合物释放垫上，样品中的鸭IgY在流动过程中，先与结合物释放垫a上的兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物结合，再通过生物素-链霉亲和素系统与结合物释放垫b上的链霉亲和素-荧光微球标记物结合，形成鸭IgY-兔抗鸭抗抗体-荧光微球复合物。样本中的鸭IgY与硝酸纤维素膜检测线上的鸭IgY竞争结合兔抗鸭抗抗体-荧光微球复合物，通过荧光层析分析仪检测荧光信号强弱来判断样本中是否掺杂鸭肉。而无论样品中是否含有鸭IgY，结合物释放垫上通过生物素-链霉亲和素系统结合的兔抗鸭抗抗体-荧光微球复合物，均会在毛细渗移作用下与硝酸纤维素膜质控线上的羊抗兔二抗结合，产生荧光信号，以示检测有效。
实施例1
请参照图1，一种鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条，所述荧光试纸条包括底板(8)，互相连接并顺次固定在底板上的样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水垫(5)；
所述结合物释放垫a上喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物；
所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；
所述硝酸纤维素膜(4)上有检测线(6)和质控线(7)，所述检测线上包被有鸭IgY，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。
具体的，上述荧光试纸条中，所述样品吸收垫(1)为玻璃纤维素膜，所述结合物释放垫a和结合物释放垫b为聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜，所述吸水垫为吸水滤纸。
所述样品吸收垫(1)、结合物释放垫a(2)、结合物释放垫b(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水垫(5)依次按顺序粘贴在PS底板(8)上；结合物释放垫a(2)从起始端有1/4区域被样品吸收垫(1)覆盖，结合物释放垫b(3)从起始端有1/4区域被结合物释放垫a(2)覆盖，结合物释放垫b(3)的末端与硝酸纤维素膜(4)的始端连接，硝酸纤维素膜(4)的末端与吸水垫(5)的始端相连，样品吸收垫(1)的始端与PS底板(8)的始端对齐，吸水垫(5)的末端与PS底板(8)的末端对齐；
所述硝酸纤维素膜(4)上有检测线(6)和质控线(7)，检测线(T)和质控线(C)均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线(6)位于靠近结合物释放垫b(3)的末端的一侧；质控线(7)位于远离结合物释放垫b(3)的末端的一侧。将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
上述的荧光试纸条中，所述结合物释放垫a上采用的兔抗鸭抗抗体为兔抗鸭IgY的IgG，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗兔二抗为羊抗兔IgG的IgG。
实施例2
一种实施例1所述鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条的制备方法，包括如下步骤：
1)制备喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a；
制备喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；
制备具有包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜；
2)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上，得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条。
下面分步详细叙述：
(一)各部件的制备
1.链霉亲和素-荧光微球标记物的制备
(1)荧光微球的活化
取4℃放置的1％荧光微球，恢复室温，摇匀后以移液器取50μL置PE管内，加入450μL超纯水进行10倍稀释(0.1％，体积分数)，此为工作液；称取活化剂EDC、NHS，以选定比例分别加入工作液内，避光振荡，反应15min；15000r/min离心10min；弃去上清，取500μL MES溶液，摇匀。
MES溶液配制：称取1.82g MES溶于90mL超纯水中，以2mol/L NaOH调节至所需pH，定容至100mL，分装冻存，使用前回复至室温。
活化剂EDC配制：称取10mg EDC，吸取上述配制的MES溶液1mL溶解，使终浓度为10mg/mL，避光，现配现用。
活化剂NHS配制：称取10mg NHS，吸取上述配制的MES溶液1mL溶解，使终浓度为10mg/mL，避光，现配现用。
(2)链霉亲和素-荧光微球标记物的制备
将链霉亲和素以MES溶液稀释至1mg/mL，添加20μL到已活化的荧光微球(500μL)内，混匀，室温避光振荡，标记4h；15000r/min离心10min，弃去上清。
(3)链霉亲和素-荧光微球标记物的封闭
取500μL封闭液将已标记好的荧光微球复溶，避光振荡，封闭3h；15000r/min离心10min，弃去上清。
封闭液：含5％BSA(质量分数)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
(4)链霉亲和素-荧光微球标记物的复溶
取500μL复溶液将已封闭好的链霉亲和素-荧光微球标记物复溶，混匀后置4℃冰箱备用。
复溶液：含0.5％BSA(质量分数)、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
2.结合物释放垫的制备
将结合物释放垫浸泡于含0.5％BSA(质量分数)、5％蔗糖、pH 7.4的0.02mol/L磷酸盐缓冲液中，均匀浸湿2h，37℃烘干备用。用Bio dot划膜仪将市售的兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物均匀喷涂在结合物释放垫上(结合物释放垫a)，每1cm结合物释放垫喷涂0.7μL兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物，然后置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
用Bio dot划膜仪将制备好的链霉亲和素-荧光微球标记物均匀喷涂在结合物释放垫上(结合物释放垫b)，每1cm结合物释放垫喷涂0.5μL链霉亲和素-荧光微球标记物，然后置于37℃环境(湿度＜20％)中2h后取出，置于干燥环境(湿度＜20％)中保存备用。
3.硝酸纤维素膜的制备
将鸭IgY包被在硝酸纤维素膜上构成检测线，将羊抗兔二抗包被在硝酸纤维素膜上构成质控线。
包被过程：用0.01mol/L、pH 7.2的磷酸缓冲液将鸭IgY稀释到500μg/mL，用Biodot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T)，包被量为0.9μL/cm；用0.01mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液将羊抗兔二抗稀释到300μg/mL，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C)，包被量为0.9μL/cm。将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃条件下干燥16h，备用。
4.样品吸收垫的制备
将样品吸收垫用含1％BSA、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h备用。其中，BSA浸泡的作用是封闭玻璃纤维膜的孔隙，减少非特异性吸附。
(二)各部件的组装
将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫依次按顺序粘贴在PS底板上；结合物释放垫a从起始端有1/4区域被样品吸收垫覆盖，结合物释放垫b从起始端有1/4区域被结合物释放垫a覆盖，结合物释放垫b的末端与硝酸纤维素膜的始端连接，硝酸纤维素膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与PS底板的始端对齐，吸水垫的末端与PS底板的末端对齐；硝酸纤维素膜上有检测线(T)和质控线(C)，检测线和质控线均呈与所述试纸条的长相垂直的条状带；检测线位于靠近结合物释放垫b的末端的一侧；质控线位于远离结合物释放垫b的末端的一侧。将试纸条用机器切成3.95mm宽的小条，装在特制的塑料制卡壳中，以铝箔袋密封，2～30℃条件下可保存12个月。
实施例3
实施例1和2中所得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条的使用
1、样本的制备
用匀浆机匀浆牛羊肉样本；称取(3.0±0.05)g匀浆好的样本，加入6mL 0.02mol/L磷酸盐缓冲液，充分混匀；室温下4000r/min离心5min，将上清液用0.02mol/L磷酸盐缓冲液进行1:2稀释后即为待测样本液。
2、试纸条检测
用移液器取待测液100μL垂直滴于加样孔中，液体流动开始计时，反应10min，加样孔端在外，将试纸条插入荧光检测仪的检测孔中，按下检测键，将自动对试纸条进行判读。若未出现C线，表明不正确的操作过程或试纸条已失效，应用新的试纸条重新测试。
3、检测结果分析
测试完成后，仪器将根据检测得到的荧光信号的强弱，自动计算出牛羊肉样本中掺杂鸭肉的浓度值，并根据预设的阈值给出阴阳性判断。
阴性(－)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阴性，表示样本中不含有鸭肉或其掺杂浓度低于检测限。
阳性(+)：若荧光检测仪的显示屏幕上结果显示为阳性，表示样本中鸭肉掺杂浓度等于或高于检测限。
无效：若质控区未检出荧光信号强度，表明不正确的操作过程或试纸条已失效。
实施例4
实施例1和2中所得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条的使用结果分析
1、检测限试验
取100g纯牛肉、羊肉样本各9份，在其中分别加入0g、0.39g、0.78g、1.56g、3.13g、6.25g、12.5g、25g、50g鸭肉，匀浆混匀，则鸭肉掺杂浓度分别为0％、0.39％、0.78％、1.56％、3.13％、6.25％、12.5％、25％、50％，用荧光试纸条进行检测。
结果为：鸭肉掺杂浓度为0％、0.39％、0.78％时，荧光检测仪检测为阴性；鸭肉掺杂浓度为1.56％、3.13％、6.25％、12.5％、25％、50％时，荧光检测仪检测为阳性，表明本试纸条鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的检测限为1.56％。但考虑到不同批次试纸条、不同样本可能会出现误差，因此为了避免假阴性结果出现引起误判，将检测限提升一个梯度浓度，同时为了方便判定，最终确定检测限为3％。
2、假阳性率、假阴性率试验
取已知不掺杂鸭肉的阴性牛肉、羊肉样本各20份，及掺杂鸭肉至浓度为3％的阳性牛肉、羊肉样本各20份，用3个批次生产的荧光试纸条分别进行检测，计算其阴阳性率。结果见表1。
表1检测阳性、阴性样本结果
结果表明：用3个批次生产的试纸条检测阳性样本时，结果全为阳性，可知阳性符合率为100％，假阴性率为0；检测阴性样本时，结果全为阴性，可知阴性符合率为100％，假阳性率为0。说明本发明的鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条可以对牛羊肉中掺杂鸭肉进行快速鉴别。
3、特异性试验
随机抽取鸭肉、羊肉、牛肉、鸡肉、猪肉和鱼肉样本，用试纸条进行检测，考察其他动物组织对试纸条的影响。结果发现，鸭肉样本均为阳性，羊肉、牛肉、鸡肉、猪肉和鱼肉样本均为阴性，说明试纸条的特异性较好，其他动物组织对其无干扰。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (9)
1.一种鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条，其特征在在于，所述荧光试纸条包括底板，互相连接并顺次固定在底板上的样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜和吸水垫；
所述结合物释放垫a上喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物；
所述结合物释放垫b上喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物；
所述硝酸纤维素膜上有检测线和质控线，所述检测线上包被有鸭IgY，所述质控线上包被有羊抗兔二抗。
2.根据权利要求1所述的荧光试纸条，其特征在于，所述结合物释放垫a上采用的兔抗鸭抗抗体为兔抗鸭IgY的IgG，所述硝酸纤维素膜上质控线采用的羊抗兔二抗为羊抗兔IgG的IgG。
3.根据权利要求1所述的荧光试纸条，其特征在于，所述样品吸收垫的材质为玻璃纤维素膜，所述结合物释放垫a和结合物释放垫b的材质为聚酯纤维素膜或玻璃纤维素膜，所述吸水垫的材质为吸水滤纸。
4.一种权利要求1-3任一所述的荧光试纸条的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)制备喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a；
制备喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b；
制备具有包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜；
2)将样品吸收垫、结合物释放垫a、结合物释放垫b、硝酸纤维素膜、吸水垫顺次固定在底板上，得鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉的荧光试纸条。
5.根据权利要求4所述的荧光试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤制备喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a具体为：
将结合物释放垫浸泡于磷酸盐缓冲液中，用Bio dot划膜仪将兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物均匀喷涂在结合物释放垫a上，置于温度为37℃湿度小于20％的环境中2h后，得喷涂有兔抗鸭抗抗体-生物素偶联物的结合物释放垫a。
6.根据权利要求4所述的荧光试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤制备喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b具体为：
将链霉亲和素添加到已活化的荧光微球溶液中，得链霉亲和素-荧光微球标记物；
用Bio dot划膜仪将所述链霉亲和素-荧光微球标记物喷涂在结合物释放垫b上，置于温度为37℃湿度小于20％的环境中2h后，得喷涂有链霉亲和素-荧光微球标记物的结合物释放垫b。
7.根据权利要求4所述的荧光试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤制备具有包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜，具体为：
用磷酸缓冲液将鸭IgY稀释后，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线；
用磷酸盐缓冲液将羊抗兔二抗稀释后，用Bio dot划膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线；
将包被好的硝酸纤维素膜置于37℃条件下干燥16h得包被有鸭IgY的检测线和包被有羊抗兔二抗的质控线的硝酸纤维素膜。
8.根据权利要求4所述的荧光试纸条的制备方法，其特征在于，所述步骤2)前还包括步骤：
将样品吸收垫用含1％质量百分数的BSA、pH 7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘干2h。
9.权利要求1-3任一所述的荧光试纸条在鉴别牛羊肉中掺杂鸭肉中的应用。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication | ||
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Application publication date: 20210611 |