CN114675028A - 一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法和应用 - Google Patents

一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种杀螟硫磷纳米抗体‑胶体金标记物的制备方法和应用。本发明提供了杀螟硫磷纳米抗体‑胶体金标记物的制备方法，制备得到的杀螟硫磷纳米抗体‑胶体金标记物的灵敏度高、稳定性强。本发明提供的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体‑胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适用于市场的快速检测、易于储存、保质期长的优点。采用本发制备得到的纳米抗体‑胶体金试纸条在对杀螟硫磷农药的残留检测中，灵敏度达到0.013～0.309mg/kg，反应时间为5～8min，检测杀螟硫磷农药残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用，适合市场上大量样本的筛查和现场监控。

Description

一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法和应用
技术领域
本发明属于农药残留免疫分析检测技术领域。更具体地，涉及一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法和应用。
背景技术
杀螟硫磷(Fenitrothion)又名杀螟松，是一种有机磷广谱杀虫剂，其作用的对象十分广泛，一般可以针对水稻、小麦、油料作物、果蔬以及树木的害虫防治。杀螟硫磷属于中等毒性农药，不合理施用杀螟硫磷会导致杀螟硫磷在作物上残留积累，过量摄入对人畜具有一定毒害作用：导致神经系统中的单键积累，引发恶心、呕吐、腹痛、腹泻、昏迷等症状，急性中毒还可危及生命。近年来我国对于食品样品的筛查中杀螟硫磷的超标最为严重，检测率也超出同类有机磷农药。因此发展更为经济、高效、灵敏的杀螟硫磷快速检测技术以实现对杀螟硫磷的监控具有重大意义。
目前杀螟硫磷的标准检测方法主要是仪器分析法和疫分析方法。仪器分析法检测结果准确，灵敏，可以实现多种待测物的同时检测，但需要复杂繁琐的样品前处理来减少样品基质对于分析结果的干扰、同时需要用到昂贵的试剂和设备以及专业熟练的技术人员，这些因素都导致仪器分析法不适用于市场的大规模即时检测。免疫层析法是将特异的抗体先固定于硝酸纤维素膜的某一区带，当该干燥的硝酸纤维素一端浸入样品(液体)后，由于毛细管作用，样品将沿着该膜向前移动，当移动至固定有抗体的区域时，样品中相应的抗原即与该抗体发生特异性结合，若用免疫胶体金或免疫酶染色可使该区域显示一定的颜色，从而实现特异性的免疫诊断。免疫分析方法具有特异性强、灵敏度高、检测成本低、检测时间短以及对人员要求不高等优点，如现有技术中CN106290830A公开了一种基于上转换荧光纳米粒子快速检测杀螟硫磷的免疫层析试纸及其制备方法，采用上转换荧光纳米粒子标记抗体试样对杀螟硫磷农药进行检测；也有采用单抗或多抗结合胶体金进行免疫层析检测，但该方法是针对于多种有机磷类农药的残留进行检测。但是目前使用胶体金免疫层析技术所使用的抗体几乎全是单抗与多抗，但由于单抗与多抗的制作成本较高且两种抗体的批间差异较大得到的胶体金试纸条效果有差异，而纳米抗体本身稳定生产成本低且可以快速的获得，将纳米抗体用作标记物，与免疫层析技术相结合进行小分子农药残留的分析还未见报道，且并也未见将纳米抗体结合胶体金用于杀螟硫磷农药残留检测中。因此，研究和开发出更多的、更高效、灵敏的能有效检测杀螟硫磷农药残留的产品或方法，对发展快检农药多残留检测技术具有重要的理论研究和实际应用意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服上述问题的缺陷和不足，提供一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法和应用。
本发明的第一个目的是提供一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
本发明的第三个目的是提供所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的应用。
本发明的第四个目的是提供一种检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条。
本发明的第五个目的是提供所述试纸条的应用。
本发明上述目的通过以下技术方案实现：
本发明经过研究筛选出能与杀螟硫磷纳米抗体稳定结合的胶体金溶液，并通过优化筛选将杀螟硫磷纳米抗体与胶体金进行结合，制备得到杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物灵敏度高、稳定性强。
本发明提供一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法，向胶体金溶液中加入杀螟硫磷纳米抗体，混匀静置，进行封闭，再静置离心，弃上清液，沉淀用胶体金复溶液重悬，即得杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物；所述胶体金溶液由1％氯金酸和1％柠檬酸三钠体积比为1:2配制得到；所述杀螟硫磷纳米抗体的用量5～10μg/mL；所述封闭采用10％的牛血清蛋白25～35μL进行封闭反应25～40min；所述胶体金复溶液的配方为：0.02～0.5MBB、BSA:0.1％～2％、蔗糖:1％～15％、曲拉通-100:0.1％～2％以及PVP:0.1％～2％。
优选地，杀螟硫磷纳米抗体参考现有技术制备得到(王宇,张译丰,沈玉栋等.抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体的制备及其在免疫检测方法中的应用[J].现代食品科技,2021,第37卷(8):286-294，285.)。
优选地，所述胶体金溶液pH为6.5～7.5。
优选地，胶体金复溶液的配方为：0.2M BB、BSA:0.5％～2％、蔗糖:2％～10％、曲拉通-100:0.5％～2％、PVP:0.2％～1％。
优选地，沉淀用胶体金体积1/10的胶体金复溶液重悬。
优选地，离心条件为4℃、8000～10000rpm、离心时间10～20min。
本发明提供由上述制备得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
本发明提供所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物在检测杀螟硫磷农药中的应用。
本发明提供所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物在制备检测杀螟硫磷的纳米抗体-胶体金试纸条中的应用。
本发明提供一种检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条，含有所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
本发明提供的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条，包括样品吸收垫、结合释放垫、反应膜、吸水垫和底板，所述反应膜上有包被着杀螟硫磷农药半抗原-载体蛋白偶联物的检测线以及包被着兔抗驼抗抗体的质控线，所述结合释放垫上喷涂有杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
上述试纸条由以下步骤制备得到：
S1.采用上述方法制备杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物；
S2.将结合释放垫用胶体金复溶液浸泡后烘干，并采用步骤S1制备得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物喷涂在处理过的结合释放垫上，进行烘干后密封干燥保存；
S3.将杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将兔抗驼抗体包被在反应膜上构成质控线；
S4.将样品吸收垫置于缓冲液中浸泡，烘干后备用；
S5.将样品吸收垫、结合释放垫、反应膜、吸水垫在底板上顺次进行组装，即得检测杀螟硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条。
优选地，步骤S1中杀螟硫磷纳米抗体添加量为3～10μg/mL。
更优选地，杀螟硫磷纳米抗体添加量为5～10μg/mL。
优选地，步骤S1中封闭采用10％的牛血清蛋白20～40μL进行封闭反应25～40min。
更优选地，采用牛血清蛋白25～35μL，封闭反应30min。
优选地，步骤S2中采用的杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物浓度为0.1～0.5mg/mL，包被量为0.5～1.0μL/cm；兔抗驼抗体浓度为0.5～2mg/mL，包被量为0.5～1.0μL/cm。
更优选地，采用的杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物浓度为0.25mg/mL，包被量为0.8μL/cm；兔抗驼抗体浓度为1mg/mL，包被量为0.8μL/cm。
优选地，步骤S4中所述缓冲液为含0.2％氯化钠、0.5％蔗糖、0.3％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％吐温-20，pH为7.4的磷酸盐缓冲液。
优选地，所述杀螟硫磷农药半抗原-载体蛋白是由杀螟硫磷农药的半抗原和乳铁球蛋白偶联得到。
更优选地，所述杀螟硫磷农药半抗原溶液参考技术文献(Chen et al.Analyst,2021,146(3):864-873.)的描述方法制备而成，所述杀螟硫磷抗体溶液参考技术文献(王宇等，现代食品科学,2021,37(8):286-294)中的描述结合常规方法制备。
优选地，所述兔抗驼抗体是由纳米抗体免疫兔子得到。
优选地，所述底板采用不吸水的PVC板，塑料板一面涂有不干胶，底板起固定支持试纸其他组成部分的作用。
优选地，所述样品吸收垫可为吸滤纸或滤油纸。
优选地，所述吸水垫优选玻璃纤维纸、滤纸或吸水纸。
优选地，所述反应膜可为硝酸纤维素膜或醋酸纤维素膜。
本发明提供一种检测杀螟硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条，是利用杀螟硫磷纳米抗体与杀螟硫磷农药的高特异性反应以及竞争抑制的免疫层析技术，样品溶液从样品吸收垫加入到试纸条，通过毛细管作用力样品溶液流经整个试纸条，样品中的待检物质首先与结合释放垫上的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物结合形成药物-抗体-胶体金标记物；之后混合溶液流经反应膜，药物与检测线上的杀螟硫磷农药半抗原-载体蛋白竞争结合杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物，根据检测线条带是否显色或显色深浅来判断待检样品溶液中的杀螟硫磷农药残留情况。
本发明提供所述检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条在检测杀螟硫磷农药残留中的应用。
本发明具有以下有益效果：
本发明提供一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法，本发明制备得到杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物灵敏度高、稳定性强。本发明提供的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条，具有灵敏度高、特异性强、成本低、操作简单、检测时间短、适用于市场的快速检测、易于储存、保质期长的优点。采用本发制备得到的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条在对杀螟硫磷农药的残留检测中，灵敏度达到0.013～0.309mg/kg，反应时间为5～8min，检测杀螟硫磷农药残留的方法简便、快速、直观、准确、适用范围广、成本低、易推广使用，适合市场上大量样本的筛查和现场监控。
附图说明
图1为配制得到的五种不同体积比的胶体金溶液；
图2为采用五种不同体积比的胶体金溶液与杀螟硫磷纳米抗体的结合结果；
图3为五种不同的胶体金溶液制备胶体金-杀螟硫磷纳米抗体探针进行对杀螟硫磷药物溶液检测结果；
图4为杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备pH优化；
图5为杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备纳米抗体添加量优化；
图6为杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备BSA含量优化；
图7为杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备胶体金复溶缓冲液优化；
图8为试纸条的结构示意图；
图9为试纸条检测结果示意图；
图10为试纸条对不同的有机磷类农药进行测定结果；
图11为不同浓度下的杀螟硫磷农药标准曲线；
图12为不同浓度的杀螟硫磷标准品农药的检测结果；
图13为试纸条稳定性测试结果；
图14为试纸条对不同的样本进行检测。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。
实施例1杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备与优化
1、溶液的配制
胶体金复溶液：0.02～0.5M BB、BSA:0.1％～2％、蔗糖:1％～15％、曲拉通-100:0.1％～2％以及PVP:0.1％～2％。
本发明采用的杀螟硫磷纳米抗体参考现有技术制备得到(王宇,张译丰,沈玉栋等.抗杀螟硫磷生物素化纳米抗体的制备及其在免疫检测方法中的应用[J].现代食品科技,2021,第37卷(8):286-294，285.)。
2、胶体金的制备与优化
在现有技术中，单抗常采用体积比为1：1、1：1.25以及1：1.5的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠制备胶体金溶液进行检测。由于本发明采用的是杀螟硫磷纳米抗体，为了制备适合杀螟硫磷纳米抗体的胶体金溶液，采用不同体积比的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠进行制备胶体金溶液。在胶体金溶液的制备过程中最后得到的胶体金溶液粒径会随加入柠檬酸三钠的含量不同而发生变化。同时设置1％氯金酸和1％柠檬酸三钠的体积比为1：1、1：1.25、1：1.5以及1：2和1：6配制得到五种不同粒径的胶体金溶液，分别与杀螟硫磷纳米抗体标记结合，依据结果判断胶体金溶液与杀螟硫磷纳米抗体的结合情况。
具体为，采用质量分数为1％的氯金和1％柠檬酸三钠加入超纯水中制备胶体金溶液，通过改变氯金酸和柠檬酸三钠的比例可以得到粒径不同的胶体金溶液，采用1：1、1：1.25、1：1.5、1：2、1：6五种不同体积比制备不同粒径的胶体金溶液。首先将质量分数为1mL1％的氯金酸加入100mL超纯水中，并采用磁力搅拌器加热搅拌至沸腾，之后分别加入1、1.25、1.5、2、6mL 1％柠檬酸三钠，继续匀速搅拌，溶液颜色由浅黄色变为无色，随后变为黑色之后逐渐变成酒红色之后反应10min停止加热，冷却至室温后用超纯水恢复到100mL，并置于4℃保存。配制得到的五种不同体积比的胶体金溶液如图1所示，制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
采用五种不同体积比的胶体金溶液与杀螟硫磷纳米抗体的结合结果如图2所示，在采用常规的胶体金体积比(1：1、1：1.25以及1：1.5)溶液中加入杀螟硫磷纳米抗体后，胶体金溶液颜色由红色变为紫色、黑色时，说明胶体金与纳米抗体的混合溶液不够稳定，在采用1：2和1：6体积比的胶体金溶液加入纳米抗体后才能稳定，五种不同体积比的胶体金溶液制备胶体金-杀螟硫磷纳米抗体探针进行对杀螟硫磷药物溶液检测结果如图3所示，由此以下实施例均选择1：2体积比的1％氯金酸和1％柠檬酸三钠的胶体金溶液进行后续步骤的制备与使用。
3、杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备与优化
采用上述制备好的胶体金溶液，用碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH值，之后在调好pH的胶体金溶液中加入杀螟硫磷纳米抗体静置反应30min；之后加入10％BSA进行封闭反应30min，封闭结束后离心弃上清液，沉淀用胶体金体积1/10的胶体金复溶液重悬，并置于4℃保存。
本发明对杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备条件进行优化，优化结果根据最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定。具体优化条件如下所示：
(1)pH优化：利用0.2M碳酸钾溶液调节胶体金溶液的pH，通过加入5、10、15、20、25μL碳酸钾溶液，得到不同pH的胶体金溶液。之后按照上述反应过程得到不同的胶体金复合物，根据最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的pH。
pH优化结果如图4所示，在采用5～15μL碳酸钾时，pH为6.5～7.5，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的效果可以达到检测要求。
(2)纳米抗体添加量优化：根据优化好的pH，再加入3、5、7、10μL 1mg/mL的杀螟硫磷纳米抗体溶液，得到不同的胶体金复合物，根据最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的杀螟硫磷纳米抗体添加量。
纳米抗体添加量优化结果如图5所示，在采用5～10μL时，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的效果可以达到检测要求。
(3)BSA含量优化：根据上述优化的条件，在封闭过程利用20、25、30、35、40μL 10％BSA进行封闭，同样根据最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的BSA添加量。
BSA含量优化结果如图6所示，在采用25～35μL 10％BSA时，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的效果可以满足检测要求。
(4)离心条件优化：根据上述优化的条件优化离心条件包括离心温度、离心转速以及离心时间。温度包括0、4、16、25、37℃；转速包括8000、9000、10000、12000rpm；离心时间包括10、15、20min。同样根据最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适的离心条件。
在离心条件为4℃、8000～10000rpm、离心时间10～20min时，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的检测效果符合要求。
(5)胶体金复溶液配方优化：根据上述最适条件优化胶体金复溶液，优化包括体系的选择、BB的浓度、BSA含量、蔗糖含量、曲拉通-100含量以及PVP含量。体系选择包括BB、PB、Tris以及EDTA溶液，体系的浓度包括0.02、0.05、0.1、0.2、0.5M；蔗糖添加量包括1％、2％、5％、10％、15％；剩余添加物的含量包括0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％。同样利用杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的灵敏度和稳定性确定合适复溶液配方。
胶体金复溶液配方优化结果如图7所示，在采用0.2M BB溶液，蔗糖添加量为2～10％、BSA添加量0.5～2％、PVP添加量0.2～1％以及曲拉通-100添加量为0.5～2％时，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的效果可以达到检测要求。
在优化过程中，胶体金溶液在不适合的条件下溶液会发生聚集，颜色由酒红色变为黑色并有沉淀。最后根据以上优化结果，确定本发明制备的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的最优制备条件为：pH为6.5～7.5，杀螟硫磷纳米抗体添加量为5～10μg/mL，10％BSA25～35μL，离心条件为4℃、8000～10000rpm、离心时间10～20min。胶体金复溶液配方采用0.2M BB、BSA:0.5％～2％、蔗糖:2％～10％、曲拉通-100:0.5％～2％、PVP:0.2％～1％时，最终得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的效果可以达到检测要求。
实施例2检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条的制备
1、结合释放垫的制备
将结合释放垫用胶体金复溶液浸泡30min，置于45℃烘箱中烘干，将上述制备得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物溶液采用AUTOKUN划膜喷金标机(杭州峰航科技有限公司，HGS510)以每孔5μL/cm的量喷涂在采用胶体金复溶液处理过的结合释放垫上，并将喷涂后的结合释放垫置于烘箱中，37℃，12h烘干，烘干后把喷涂好的结合释放垫进行密封，并加入干燥剂进行保存。
2、反应膜的制备
本发明采用的杀螟硫磷农药半抗原的制备方法参考现有技术制备得到(Chen etal.Analyst,2021,146(3):864-873.)。
杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白采用化学试剂DMF和NHS化学偶联获得，兔抗驼抗体则由杀螟硫磷纳米抗体免疫兔子获得。
(1)检测线的包被：将上述制备得到的杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物进行包被到反应膜上构成检测线，用磷酸缓冲液将杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物稀释到0.25mg/mL，用AUTOKUN划膜喷金标机将其包被于硝酸纤维素膜上的检测线(T线)，包被量为0.8μL/cm；将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥4h，干燥备用。
(2)质控线的包被：将兔抗驼抗体包被在反应膜上构成质控线，用磷酸盐缓冲液将兔抗驼抗体稀释到1mg/mL，用AUTOKUN划膜喷金标机将其包被于硝酸纤维素膜上的质控线(C线)，包被量为0.8μL/cm。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥4h，干燥备用。
3、样品吸收垫的制备
将样品吸收垫置于含有体积分数为0.2％氯化钠、0.5％蔗糖、0.3％聚乙烯吡咯烷酮和0.5％吐温-20的pH7.4为0.2mol/L磷酸盐缓冲液中，浸泡1h，37℃烘4h备用。
4、试纸条的组装
将上述制备得到的反应膜、结合释放垫、样品吸收垫和吸水垫依次按顺序粘贴在PVC底板上；样品吸收垫的始端与PVC底板的始端对齐，样品吸收垫的末端与结合释放垫的始端相连，结合释放垫的末端与反应膜的始端相连，样品吸收垫与结合释放垫有2mm的重叠；反应膜的末端与吸水垫的始端相连，吸水垫的末端与PVC底板的末端对齐；且结合释放垫和吸水垫均与反应膜都有2mm的重叠，组装好的试纸条如图8所示。所述反应膜上有检测线(T线)和质控线(C线)，检测线和质控线均为与所述试纸条的长相垂直的条状带，检测线位于靠近样品吸收垫的末端的一侧，质控线位于靠近吸水垫的首端的一侧。试纸条按上述步骤组装好后，各部分组装好按压紧实后用机器切成4mm宽的小条，装在特制的密封袋中，4～30℃条件下可保存12个月。
实施例3检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条的限度试验
1、特异性测试
为了检测本发明制备得到的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条的特异性，分别采用不同的农药进行测定。分别采用6.5mg/kg喹硫磷、三唑磷、水胺硫磷、丙溴磷、灭虫威和克百威等药物进行检测，药物利用PBS溶液稀释到6.5mg/kg。
将样品溶液从试纸条的样品垫垂直加入，液体流动时开始计时，反应5～8min，通过胶体金分析仪读取结果，当样品中待测物质浓度低于检测限结果为阴性，在样品中待测物质浓度等于或高于检测限结果为阳性；如果结果为无效则表示需要重新测试。
试纸条的流动反应原理如图9所示，当检测结果为阴性时，检测线(T线)和质控线(C线)的颜色均发生变化，变红加深；当检测结果为阳性时，检测线(T线)会出现无变化或者变浅色，而质控线(C线)的颜色会发生变化，变红加深；当检测线(T线)和质控线(C线)的颜色均不发生变化，或仅检测线(T线)出现变红加深的情况，则为无效结果，则表示需要重新测试。
采用本发明制备的试纸条不同的农药进行测定结果如图10所示，试纸条在检测杀螟硫磷农药时仅有质控线颜色加深，表明结果为阳性；而在检测其他有机磷类农药时，质控线和检测线均显色，呈阴性。说明本试纸条对6.5mg/kg喹硫磷、三唑磷、水胺硫磷、丙溴磷、灭虫威和克百威等药物检测无交叉反应，仅能特异性地检测出杀螟硫磷农药。
2、检测限测试
为了检测本发明制备得到的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条的检测限和灵敏度，在PBS缓冲液中分别添加杀螟硫磷标准品农药至最终浓度为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.0625、0.03125、0.0156、0.0078、0.0039mg/kg，再取实施例1中制备好的试纸条进行检测，每个样本重复测试三次。将样品溶液垂直滴加到样品吸收垫上，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果。
检测结果通过胶体金分析仪读数可以得到准确数据。根据其数据可以通过Origin软件得到一条标准曲线如图11所示。而对不同浓度的杀螟硫磷标准品农药的检测结果如图12所示，标准曲线对应的结果表明此方法检测杀螟硫磷农药残留检测范围是0.013～0.309mg/kg，检测限是0.00598mg/kg满足国标检测要求。
3、稳定性测试
为了检测本发明制备得到的检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条的稳定性，将试纸条经过长时间的放置后检测其准确度和稳定性。
将用本发明方法制作好的试纸条装入密封袋内，内置干燥剂，于45℃烘箱内保存，分别于3天、7天、14天、21天、30天取出，检测试纸条的稳定性。
结果如图13所示，在温度为45℃保存3天、7天、14天、21天、30天，检测结果均无明显变化，45℃保存30天，相当于常温保存12个月。
实施例4实际样品检测
从市场和超市购买不同的白菜、黄瓜及橘子样本，样品洗净晾干，之后称取10g(±0.1g)均质样品至50mL塑料离心管中，将样品分为阴性样品和阳性样品，阴性样品不做额外处理，阳性样品则加入杀螟硫磷标准品至药物浓度达到0.02mg/kg。之后在阴性样品和阳性样品都加入10mL的乙腈，涡旋混匀；之后加入萃取包，继续涡旋震荡2min，5000rpm/min下离心3min，室温静置。取上清溶液加入到净化管中，涡旋震荡2min，5000rpm/min下离心3min后取上清液，37度氮吹，之后利用EDTA溶液原倍复溶。
再取实施例2中制备好的试纸条进行检测，将处理好的样品溶液垂直滴加到样品吸收垫上，液体流动时开始计时，反应5～8min，判定结果。
通过胶体金分析仪读取检测结果：
阴性(-)：表示样品中待测物质浓度低于检测限；
阳性(+)：表示样品中待测物质浓度等于或高于检测限；
无效：表示需要重新测试。
采用本发明制备的试纸条对不同的样本进行检测，检测结果如图14所示，在检测白菜、黄瓜及橘子样本时，我们可以看到阴性样品中T线与C线都发生显色，而阳性样品C线显色明显强于T线的显色结果，表明检测结果也是可以满足要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物的制备方法，其特征在于，向胶体金溶液中加入杀螟硫磷纳米抗体，混匀静置，进行封闭，再静置离心，弃上清液，沉淀用胶体金复溶液重悬，即得杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物；所述胶体金溶液由1％氯金酸和1％柠檬酸三钠体积比为1:2配制得到；所述杀螟硫磷纳米抗体的添加量5～10μg/mL；所述封闭采用10％的牛血清蛋白25～35μL进行封闭反应25～40min；所述胶体金复溶液的配方为：0.02～0.5MBB、BSA:0.1％～2％、蔗糖:1％～15％、曲拉通-100:0.1％～2％、PVP:0.1％～2％。
2.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述胶体金溶液pH为6.5～7.5。
3.根据权利要求1所述制备方法，其特征在于，所述胶体金复溶液的配方为：0.2M BB、BSA:0.5％～2％、蔗糖:2％～10％、曲拉通-100:0.5％～2％、PVP:0.2％～1％。
4.权利要求1～3任一所述方法制备得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
5.权利要求4所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物在检测杀螟硫磷农药中的应用。
6.权利要求4所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物在制备检测杀螟硫磷的纳米抗体-胶体金试纸条中的应用。
7.一种检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条，其特征在于，含有权利要求4所述杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物。
8.根据权利要求7所述试纸条，其特征在于，试纸条由以下步骤制备得到：
S1.采用权利要求1所述方法制备杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物；
S2.将结合释放垫用胶体金复溶液浸泡后烘干，并采用步骤S1制备得到的杀螟硫磷纳米抗体-胶体金标记物喷涂在处理过的结合释放垫上，进行烘干后密封干燥保存；
S3.将杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物包被到反应膜上构成检测线，将兔抗驼抗体包被在反应膜上构成质控线；
S4.将样品吸收垫置于缓冲液中浸泡，烘干后备用；
S5.将样品吸收垫、结合释放垫、反应膜、吸水垫在底板上顺次进行组装，即得检测杀螟硫磷农药的纳米抗体胶体金试纸条。
9.根据权利要求8所述试纸条，其特征在于，步骤S2中采用的杀螟硫磷农药半抗原-乳铁球蛋白偶联物浓度为0.1～0.5mg/mL，包被量为0.5～1.0μL/cm；兔抗驼抗体浓度为0.5～2mg/mL，包被量为0.5～1.0μL/cm。
10.权利要求7所述检测杀螟硫磷农药的纳米抗体-胶体金试纸条在检测杀螟硫磷农药残留中的应用。
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