CN114113597A - 一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒及其制备方法。一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒由卡壳、位于卡壳内的试纸条组成，试纸条由底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水滤纸(5)组成，样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水滤纸(5)依次从下往上粘贴在底板(1)上。所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述胶体金垫(3)侧设有测试线T线(41)，所述硝酸纤维素膜(4)上靠近所述吸水滤纸(5)侧设有质控线C线(42)。本发明可直接检测出样本中是否含有新型冠状病毒，可用于疾病早期的诊断；有效辅助核酸检测，为全球抗击疫情的战役提供有效的科学武器。
Description
技术领域
本发明涉及病毒检测技术领域，具体为一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
截止至目前，新型冠状病毒肺炎仍在全球肆虐蔓延，我国虽对疫情控制情况较好，但随着国外疫情的日益加重，我国所面临的防疫压力也日趋增大，而病毒检测作为新冠肺炎疫情防控中的重要一环，也愈加受到人们重视。
现行社会上新冠病毒的精准检测仍然重度依赖核酸检测，此类检测方法结果精准，但检测速度较慢，成本较高，且需要大量经过专业培训的人员来操作试验设备，因此无法实现大规模快速检测；而目前可以以较快速度获取检测结果的试剂盒，则绝大多数依靠抗体检测，虽然成本低，操作简便，但其结果准确性较差，有较大概率出现假阴性与假阳性的情况，且仅能在患病产生抗体后，即感染8-15天才能检出，无法满足大规模密切接触者和无症状感染者的快速筛检。
因此迫切需要开发研究出一种快速而精准的检测方法，以应对新形势下的新型冠状病毒传播。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒及其制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案：一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒，包括卡壳、位于卡壳内的试纸条；试纸条由底板、样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜、吸水滤纸组成，所述样品垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸依次从左往右搭接在底板上。
进一步的，所述胶体金垫上有含有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1的金标抗体复合物。
进一步的，所述硝酸纤维素膜上靠近胶体金垫一侧有测试线T线，靠近吸水滤纸一侧有质控线C线；其中测试线T线包被有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2，质控线C线包被有羊抗鼠IgG抗体。
进一步的，所述一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
S1.胶体金溶液的准备：制备符合使用要求的胶体金溶液备用；
S2.胶体金垫的制备：用S1中胶体金溶液标记鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，将其制备为金标抗体复合物，将金标抗体复合物铺在金标垫上，45℃干燥后进行免疫层析试纸条大板的组装；
S3.硝酸纤维素膜的制备：将鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2包被在硝酸纤维素膜上形成测试线T线，将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜上形成质控线C线；
S4.切条组装按照产品需求尺寸，对原料进行切条，并按照样本垫、胶体金垫、硝酸纤维素膜与吸水滤纸的顺序，依次搭接在底板上，得胶体金免疫层析试纸条；
S5.将组装好的胶体金免疫层析试纸条放在电子干燥柜内，保持湿度为25％-35％，温度为18℃-26℃，后熟5天，之后将其与塑料外壳组装，得到成品。
进一步的，所述步骤S1所述胶体金纳米颗粒水溶液的制备方法包括以下步骤：
S11.在锥形瓶中加入超纯水，再加入质量分数为2％的氯金酸溶液，搅拌下加热至沸腾，沸腾1分钟后一次性迅速加入柠檬酸三钠，当溶液变为通透的红色后，继续加热1分钟，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；其中按重量份数计，所述超纯水与氯金酸溶液的比例为100：(1-2.5)，所述柠檬酸三钠添加质量分数为1％；
S12.紫外检测符合要求后，4℃避光保存。
进一步的，步骤S1所述胶体金溶液紫外检测波长应在525nm-535nm之间。
进一步的，步骤S2所述金标抗体复合物的制备方法包括以下步骤：
S21.按体积份数计，取1000份上述胶体金溶液置于容器中，取8-10份的0.2M的碳酸钾溶液滴加入胶体金溶液内，调节溶液pH，在溶液内缓慢均匀的加入12-18份浓度为1g/L的鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，之后将溶液置于混匀仪内室温下混匀30-45分钟；
S22.混匀后，迅速在溶液内加入80-120份10％牛血清白蛋白溶液，置于混匀仪内继续混匀20-30分钟后，取出，室温下静置30分钟；
S23.静置完成后，将溶液移入离心机内，以13000rpm的转速离心30分钟；
S24.离心后分离沉淀，将沉淀溶于700份胶体金重悬缓冲液中，4℃保存备用。
进一步的，一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
a.使用前检测卡必须充分恢复至室温，检测应在室温条件下进行；
b.样本采集后将鼻咽试子放入样本稀释液的管中；
c.盖好样本稀释液管的盖子，倒置管子于加样孔上方，缓慢滴加稀释液到加样孔中，开始计时；
d.10分钟后观察检测卡，若检测卡上C线与T线均显色，则该样本为阳性，若检测卡上C线显色，T线不显色，则该样本为阴性，其余情况为无效。
进一步的，步骤b所述样本稀释液为含有pH7.4的0.01M PBS、0.05％SDS、0.5％曲拉通、0.3％EDTA和0.05％Proclin300的溶液。
本发明的新型冠状病毒抗原检测试剂盒采用双抗体夹心法进行检测，抗原会先与胶体金垫内金标抗体结合，之后再与测试线T线上的抗体结合，形成夹心结构，在测试线T线显色，若试样中无新冠病毒抗原，则试样内物质无法与金标抗体及测试线T线上的抗体形成夹心结构，无法显色。
在夹心法检测的实验中，本发明检测的是新冠抗原，需要把样本中的新冠抗原提取出来才能检测，提取样本中的新冠抗原需要样本稀释液，样品稀释液中含有解离成分，可使样本中的新冠抗原释放出来，从而进行准确检测。一般稀释液中，Proclin300作为防腐剂可以抑制细菌的生长，SDS能够起到裂解细胞的作用，曲拉通能够将膜蛋白从细胞膜上解离下来，达到提取膜蛋白的作用，EDTA能够抑制蛋白酶活性，防止蛋白酶解，三种组分综合作用，能够达到提取蛋白的作用，三种试剂缺一不可。
本发明胶体金垫上覆有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1通过静电作用与胶体金颗粒结合形成金标抗体复合物；胶体金在弱碱环境下带负电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合，由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物特性。在硝酸纤维素膜上有包被有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2的测试线T线与包被有羊抗鼠IgG抗体的质控线C线。待检测试样经稀释液稀释，滴加入样品孔后，样本在毛细作用下沿试纸条由样品垫向吸水滤纸方向移动。如果滴加样本中含有新冠病毒抗原，其与胶体金垫里含有的鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1的金标抗体复合物结合，之后继续向吸水滤纸方向移动，在测试线T线处与鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2结合形成夹心复合物，同时由于鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1同样被吸附在测试线处，所以胶体金粒子会在测试线T线处发生聚集沉积而显示出红色；若样本中不含新冠病毒抗原，则不会出现鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1在测试线T线处被吸附的情况，胶体金粒子自然也不会出现沉积而显色的现象。在质控线处，金标抗体复合物与羊抗鼠IgG抗体结合，胶体金颗粒会在此发生聚集沉积而显色，无论试样中是否带有新冠病毒抗原，此处均可发生该反应。若在滴加试样后，规定时间内质控线C线处，无显色条带出现，则该次检测无效；若质控线C线处有显色条带出现，之后观察测试线T线，若无显色条带出现，则为阴性，试样中不存在新冠病毒抗原，有显色条带出现，则为阳性，试样中存在新冠病毒抗原。此外检测结果应在规定时间内读出，与试样接触后，试剂盒内抗体由于环境变化，会随时间推移而发生变化，若未在规定时间内观察检测结果，由于抗体发生变化，会最终导致显色条带消带或显色增强，而造成检测结果不准确，影响结果的判断。
与现有技术相比，本发明所达到的有益效果是：本发明可直接检测出样本中是否含有新型冠状病毒，可用于疾病早期(1-5天出现症状后，甚至在潜伏期内)的诊断；有效辅助核酸检测，克服其检测周期长、检测条件要求高及结果难以判读的痛点；也可有效解决血清学抗体检测发现时间晚(发病后8-14天才能有效检出)，导致发现滞后等痛点。为更早、更快、更准检测新冠病毒提供更多工具，为全球抗击疫情的战役提供有效的科学武器。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为本发明一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的结构示意图；
图2为本发明一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测结果示意图；
图3为本发明一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测结果实物图；
图4为本发明一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒对不同重组新冠抗原浓度样本的检测结果；
图5为本发明一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒对0.25μg/mL的重组新冠抗原浓度的样本进行重复检测的精密度结果；
图1中：1-底板，2-样品垫，3-胶体金垫，4-硝酸纤维素，41-测试线T线，42-质控线C线，5-吸水滤纸。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：胶体金溶液的制备
1.玻璃器皿的清洁
玻璃器具的清洁程度直接关系到胶体金溶液的质量，如果器皿不干净，会导致制备的胶体金溶液粒径不均匀、漂有悬浮物或者浑浊。将制备胶体金所需的所有玻璃器具全部先浸入0.1mol/L的氢氧化钠溶液中，充分浸泡2小时，然后用纯化水冲洗玻璃器具至中性，玻璃器具再用超纯水淋洗三遍，将淋洗后的器具有序放入鼓风干燥箱中，65℃烘烤8.5小时,烘烤结束后放入干净的整理箱中备用。
2.胶体金溶液的制备
使用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶液；在锥形瓶中加入100mL超纯水，用移液器加入1.3mL质量浓度为2％的氯金酸溶液，混匀后放置在电炉上加热，沸腾1分钟后加入2.5g柠檬酸三钠，当溶液变为通透的红色后，继续加热1分钟，待溶液冷却后即得到胶体金溶液。
3.胶体金溶液的质量鉴定
将适量胶体金溶液放入比色皿中，肉眼观察应为酒红色液体，质地均匀，无杂质，在紫外分光光度计下检测在525-535nm波长处有最大吸收峰，则判定达到标准。
实施例2：胶体金试剂盒的材料准备及组装
1.抗体标记
取1mL上述胶体金溶液置于2mL EP管中，取9μL的0.2M的碳酸钾溶液滴加入胶体金溶液内，调节溶液pH，之后在溶液内缓慢均匀的加入15μg的鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，置于混匀仪内室温下混匀30分钟；混匀后，迅速在溶液内加入100μL 10％牛血清白蛋白溶液，置于混匀仪内继续混匀20分钟后，取出，室温下静置30分钟；静置完成后，将溶液移入离心机内，以13000rpm的转速离心30分钟；离心后分离沉淀，将沉淀溶于700μL胶体金重悬缓冲液中，即可得胶体金重悬抗体，4℃保存备用。
2.铺金
将胶体金重悬抗体铺到金标垫上，45℃鼓风干燥箱中干燥13h，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装。
3.测试线T线41和质控线C线42的包被
胶体金免疫层析试纸条质控线C线42包被的是羊抗鼠IgG，用含有稳定剂的磷酸缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释至1.5mg/mL，同样方法获得包被在测试线T线42上的1.0mg/mL鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体的溶液。之后按照“喷金划膜仪使用与管理标准操作规程”清洗管道，设定划线量为1μL/cm、划线长度30cm，划线速度：40mm/s，T-C线之间距离为6mm，C线距离金标垫端距离为16mm。将包被液加到喷金划膜仪对应管道的进样瓶里，1号管道为检测带通道，装“T”标记包被液，2号管道为质控带通道，装“C”标记包被液；将硝酸纤维素膜4按固定位置平放在仪器平台，按“GO”键开始划线，划线结束后，取下划好线的硝酸纤维素膜4在划线不均匀处做好标记；划好的C、T线的硝酸纤维素膜4在鼓风干燥箱中干燥45℃干燥14h，干燥结束后进行免疫层析试纸条大板的组装。
4.胶体金免疫层析试纸条大板的组装
环境温度保持在18-26℃，湿度保持在25％-40％。
按照产品需求尺寸，对原料进行切条，并按照样本垫2、胶体金垫3、硝酸纤维素膜4与吸水滤纸5的顺序，依次搭接在底板1上。
5.胶体金免疫层析试纸条大板的后熟及试纸条的组装
组装好的胶体金免疫层析试纸条大板放在湿度25％-35％的电子干燥柜中后熟5d，后熟结束后将胶体金免疫层析试纸条大板切成3mm宽，放入卡壳底座的凹槽里，盖上上盖，成品置于铝箔袋中，加入干燥剂，封口机封口，干燥环境保存备用。
实施例3：检测样本稀释液的优化
1)配制不同的样本稀释液
样本稀释液a：配置含有0.05％Proclin300和0.9％氯化钠的溶液；
样本稀释液b：配置含有0.9％氯化钠、1％吐温20和0.05％Proclin300的溶液；
样本稀释液c：配置含有0.05％Proclin300和pH7.4的0.01M PB的溶液；
样本稀释液d：配置含有1％吐温20、0.05％Proclin300和pH7.4的0.01M PBS的溶液；
样本稀释液e：配置含有0.5％曲拉通、0.05％Proclin300和pH7.4的0.01M PBS的溶液；
样本稀释液f：配置含有0.5％曲拉通、0.3％的EDTA和pH7.4的0.01M PBS的溶液；
样本稀释液g：配置含有0.5％曲拉通、0.05％SDS、0.3％EDTA、0.05％Proclin300和pH7.4的0.01M PBS的溶液。
2)利用样本稀释液进行检测卡的检测及选择
a.首先利用实验室制备的样本稀释液a-g，检测阴性样本，其准确率结果如表1所示，以0.9％氯化钠和pH7.4的0.01M PB为基础缓冲液的样本稀释液有假阳性，所以优选含有pH 7.4的0.01M PBS的基础缓冲液为样本稀释液，而Proclin300作为防腐剂可以抑制细菌的生长。
b.在以含有0.01M PBS且pH为7.4的基础缓冲液的样本稀释液中加入了不同浓度的SDS、曲拉通和EDTA，其中SDS能够起到裂解细胞的作用，曲拉通能够将膜蛋白从细胞膜上解离下来，达到提取膜蛋白的作用，EDTA能够抑制蛋白酶活性，防止蛋白酶解，三种组分综合作用，能够达到提取蛋白的作用，三种试剂缺一不可。
3)样本稀释液提取病毒效果的检测
利用上述含有0.01M PBS且pH为7.4的基础缓冲液中添加SDS、曲拉通和EDTA的样本稀释液来提取病毒样本，利用PCR扩增检测是否有条带或条带的深浅。最终确定样本稀释液配方浓度为含有pH 7.4的0.01M PBS、0.05％SDS、0.5％曲拉通、0.3％EDTA和0.05％Proclin300的溶液。
表1.不同稀释液检测不同浓度样本准确率
实施例4：新型冠状病毒试剂盒性能测试
1)使用前检测卡必须充分恢复至室温，检测在室温条件下进行；
2)从铝箔袋中取出检测卡，将其置于水平干燥的桌面上；
3)样本采集后将鼻咽拭子放入含有0.5mL样本稀释液的管中；
4)盖好样本稀释液管的盖子，倒置管子于加样孔上方，缓慢滴加4滴稀释液到加样孔中，开始计时；
5)10分钟后观察检测卡，判断结果。20分钟后结果无效。如图2和3所示。
实施例5：新型冠状病毒抗原试剂盒检测重组新冠抗原
外购伊佰新(货号：XG01)新型冠状病毒重组新冠抗原，利用样本稀释液把重组新冠抗原稀释不同的浓度进行检测。检测结果如图4，重组新冠抗原浓度在0.013μg/mL也能被检测出来并且没有假阳性现象。
利用0.25μg/mL的重组新冠抗原浓度进行重复性检测，显色一致，说明此试剂盒特异性强，灵敏度高，稳定性好。
需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒，包括卡壳、位于卡壳内的试纸条；所述试纸条由底板(1)、样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(4)、吸水滤纸(5)组成；所述样品垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(4)和吸水滤纸(5)依次从左往右搭接在底板(1)上。
2.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：所述胶体金垫(3)上有含有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1的金标抗体复合物。
3.根据权利要求1所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒，其特征在于：所述硝酸纤维素膜(4)上靠近胶体金垫(3)一侧有测试线T线(41)，靠近吸水滤纸(5)一侧有质控线C线(42)；其中测试线T线(41)包被有鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2，质控线C线(42)包被有羊抗鼠IgG抗体。
4.一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1.胶体金溶液的准备：制备符合使用要求的胶体金溶液备用；
S2.胶体金垫(3)的制备：用S1中胶体金溶液标记鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，将其制备为金标抗体复合物，将金标抗体复合物铺在金标垫上，45℃干燥后进行免疫层析试纸条大板的组装；
S3.硝酸纤维素膜(4)的制备：将鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体2包被在硝酸纤维素膜(4)上形成测试线T线(41)，将羊抗鼠IgG包被在硝酸纤维素膜(4)上形成质控线C线(42)；
S4.切条组装：按照产品需求尺寸，对原料进行切条，并按照样本垫(2)、胶体金垫(3)、硝酸纤维素膜(4)与吸水滤纸(5)的顺序，依次搭接在底板(1)上，得胶体金免疫层析试纸条；
S5.将组装好的胶体金免疫层析试纸条放在电子干燥柜内，之后将其与塑料外壳组装，得到成品。
5.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1所述胶体金溶液的制备方法包括以下步骤：
S11.在锥形瓶中加入超纯水，再加入质量分数为2％的氯金酸溶液，搅拌下加热至沸腾，沸腾1分钟后一次性迅速加入柠檬酸三钠，当溶液变为通透的红色后，继续加热1分钟，待溶液冷却后即得到胶体金溶液；其中按重量份数计，所述超纯水与氯金酸溶液的比例为100：(1-2.5)，所述柠檬酸三钠添加质量分数为1％；
S12.紫外检测符合要求后，避光保存。
6.根据权利要求4所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S2所述金标抗体复合物的制备方法包括以下步骤：
S21.取上述胶体金溶液置于容器中，之后使用移液枪取0.2M浓度的碳酸钾溶液加入胶体金溶液内，调节溶液pH，之后在溶液内缓慢均匀的加入鼠抗SARS-Cov-2 NP单克隆抗体1，置于混匀仪内室温下混匀30-45分钟；
S22.混匀后，迅速在溶液内加入质量浓度为10％牛血清白蛋白溶液，置于混匀仪内继续混匀20-30分钟后，取出，室温下静置30分钟；
S23.静置完成后，将溶液移入离心机内，以13000rpm的转速离心30分钟；
S24.离心后分离沉淀，将沉淀溶于胶体金重悬缓冲液中，保存备用。
7.根据权利要求5所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的制备方法，其特征在于：步骤S1所述胶体金溶液紫外检测波长应在525nm-535nm之间。
8.根据权利要求1所述一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒，其特征在于，一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测方法，包括以下步骤：
a.使用前检测卡必须充分恢复至室温，检测应在室温条件下进行；
b.样本采集后将鼻咽试子放入含有样本稀释液的管中；
c.盖好样本稀释液管的盖子，倒置管子于加样孔上方，缓慢滴加稀释液到加样孔中，开始计时；
d.10分钟后观察检测卡，若检测卡上C线与T线均显色，则该样本为阳性，若检测卡上C线显色，T线不显色，则该样本为阴性，其余情况为无效。
9.根据权利要求8所述的一种新型冠状病毒抗原检测试剂盒的检测方法，其特征在于，步骤b所述样本稀释液为含有pH7.4的0.01M PBS、0.05％SDS、0.5％曲拉通、0.3％EDTA和0.05％Proclin300的溶液。
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