CN111218444A - 一种痰液保存液 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种痰液保存液，包含胍盐、金属螯合剂、表面活性剂等。本发明保存液不含强碱成分，减少对核酸尤其是RNA的破坏。本发明保存液能够保持痰液样本稳定，并快速液化痰液，抑制RNA酶，获得纯度较高的RNA，提高检测的准确性。液化后的痰液样本直接进行RNA提取，得率纯度均优于对比方法。本发明保存液保存后的样本可用于磁珠法、柱提法、裂解法等多种方法，未见干扰。液化后的痰液样本可直接用于细胞学检测，未见对细胞密度或细胞染色的影响。

Description

一种痰液保存液

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种痰液保存液。

背景技术

新型冠状病毒2019-nCoV是一种新发现的冠状病毒，主要传播途径为经呼吸道飞沫和接触传播，在相对封闭的环境中长时间暴露于高浓度气溶胶情况下存在气溶胶传播的可能；人群普遍易感。

港大潘烈文等【Pan Y, Zhang D, Yang P, et al. Viral load of SARS-CoV-2in clinical samples[J]. The Lancet Infectious Diseases, 2020.】在对咽拭子、痰液、尿液、粪便样本的比较中发现，痰液样本的病毒载量普遍高于咽拭子样本。尿液或粪便样本中均未检测到新冠病毒RNA。武汉大学中南医院与武汉市金银潭医院在medRxiv预印本平台上发表的文章指出【Lin C, Xiang J, Yan M, et al. Comparison of throat swabsand sputum specimens for viral nucleic acid detection in 52 cases of novelcoronavirus (SARS-Cov-2) infected pneumonia (COVID-19)[J]. medRxiv, 2020.】，与咽拭子样本相比，通过痰液样本进行2019-nCoV检测更准确、便捷。痰标本和咽拭子中2019-nCoV的阳性率分别为76.9％和44.2％，大部分患者(51.9%)咽拭子和痰标本检测结果相同，然而相当多的患者(40.4%)痰标本阳性、咽拭子阴性，只有极少数患者(7.7%)痰标本阴性、咽拭子阳性，痰液样本显示出明显高于咽拭子样本的阳性率（P=0.001）。

目前已经明确取样对于检测的重要性，痰液样本的检测阳性率高于咽拭子。国家卫健委发布的《新冠肺炎实验室检测技术指南》建议采集痰液或肺泡灌洗液等敏感性更高的样本进行复测。

痰液检验包括显微检查、涂片检查和病原微生物检查，可以辅助诊断或确诊某些呼吸系统疾病。病原体分离培养法是确定下呼吸道感染病原体的“金标准”，是临床检验科进行呼吸道分泌物检测的常规方法。分离培养法通过区分痰液中分离到的微生物是病原菌还是上呼吸道的正常菌群进行临床诊断。例如，痰液中培养出结核分枝杆菌、放线菌、或嗜肺军团菌，具有临床意义；而分离出草绿色链球菌、表皮葡萄球菌、念珠菌等鼻咽腔正常菌群，则视微生物的数量进行判别。随着分子生物学技术的发展，以聚合酶链式反应为代表的分子生物学检测方法可以定性确诊病原体感染，具快速、灵敏、特异性强的优点。该方法需要对痰液提取核酸后进行检测。但痰液中有大量黏液，其内细胞成分不易分离，对核酸提取存在很大困难。常规提取时为去除黏液进行了多次抽提，导致过程中细胞减少或核酸丢失，其次混入蛋白质使核酸纯度下降。因此，痰液核酸提取前的液化非常关键，能够降低黏液影响。

现有痰液标本使用普通的干燥塑料瓶采集，随后在一小时内完成送检制片。但实际操作中常会出现痰标本中细胞变性自溶情况；此外，细胞中黏液的存在使细胞发生重叠，杂乱排布，影响阅片。针对此，出现了针对痰液前处理的保存液和消化液产品。例如，主要成分为次氯酸钠和表面活性剂的溶痰剂；主要成分为乙酰基一半胱氨酸，枸缘酸钠和磷酸盐缓冲液的痰消化液；主要成分为氨性水溶液液化剂和苏糖醇溶液的液化剂；主要成分二硫苏糖醇、氯化钠、氯化钾、磷酸盐等的痰样本稀释液（痰消化液）。作为优化方案CN106967778B公开了一种快速痰液溶解保存液，包括乙醇、甘油、植物油、分支酸、EDTA二钠、SDS、硫代糖等组分，将溶解速度从2分钟减少到30秒。

从已经公布的技术方案看，现有痰液处理试剂的预期用途主要包括三种，第一种用于涂片或培养前的均质化处理；第二种用于病理分析前对人体细胞标本的制片，主要配合薄层细胞制片；第三种用于痰样本消化，用于体外诊断试剂或仪器对痰标本进行检测（主要用于核酸检测）。如果一份痰液样本要进行不同的检测，如薄层细胞制片和核酸提取，需要分别用不同的处理液进行处理，操作过程繁琐复杂。

因此，本领域急需一种可同时适用于后续不同检测的测痰液保存液。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

一种痰液保存液，包含下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍118g~236g/L，8-羟基喹啉0.01~0.5M，十二烷基肌氨酸钠1 g ~10 g/L，乙二胺四乙酸1~10mM，氯化钾1~10g/L，丙三醇1%~10%（v/v），异丙醇5~20%（v/v）。

优选地，所述痰液保存液包含下述含量的下述组分：异硫氰酸胍150g~200g/L，8-羟基喹啉0.08~0.3M，十二烷基肌氨酸钠3 g ~6 g/L，乙二胺四乙酸3~7mM，氯化钾2~5g/L，丙三醇3%~7%（v/v），异丙醇8~12%（v/v）。

优选地，所述痰液保存液包含下述含量的下述组分：异硫氰酸胍178g/L，8-羟基喹啉0.1M，十二烷基肌氨酸钠4 g/L，乙二胺四乙酸5mM，氯化钾3 g/L，丙三醇5%（v/v），异丙醇10%（v/v）。

优选地，所述痰液保存液还包含防腐剂，所述防腐剂的含量为0.1%~0.5%（v/v）。

优选地，所述防腐剂的含量为0.1%（v/v）。

优选地，所述防腐剂为proclin300或叠氮化钠。

本发明中异硫氰酸胍为蛋白质变性剂，可变性RNAse；8-羟基喹啉为RNAse抑制剂，与异硫氰酸胍联合可增强抑制RNAse的作用；十二烷基肌氨酸钠为表面活性剂，具有生物溶解性；乙二胺四乙酸为二价盐离子螯合剂；氯化钾为提供盐离子环境，丙三醇为稳定溶液，异丙醇用于沉淀核酸，减少表面活性剂的起泡情况。

本发明保存液能够保持痰液样本稳定，并快速液化痰液，抑制RNA酶，获得纯度较高的RNA，提高检测的准确性。液化后的痰液样本进行RNA提取，得率纯度均优于对比方法。本发明保存液保存后的样本可用于磁珠法、柱提法、裂解法等多种方法，未见干扰。

使用本发明保存液液化后的痰液样本，可同时适用于薄层细胞制片和核酸提取后PCR检的测痰液保存液。直接用于细胞学检测，未见对细胞密度或细胞染色的影响。直接进行RNA提取，通过对样本处理自动化、核酸提取自动化及兼容性测试，并对病原体检测全流程进行整合。操作简单、便利，无需特别培训，适合大规模样本筛查，整个过程中人工干预少，降低了对于临床样本，特别是传染性强样本的风险和潜在的生物危害。

附图说明

图1为肉眼观察痰液细胞染色制片效果。图中编号字母A、B、C分别代表用实施例1、实施例3和对比例1的保存液处理，数字1-4分别表示四份样本。

图2为镜下（×100倍）观察痰液细胞染色制片效果。图中编号字母A、B、C分别代表用实施例1、实施例3和对比例1的保存液处理，数字1-4分别表示四份样本。

图3为不同保存液与提取方法提取RNA纯度比较结果。

图4为不同保存液与提取方法提取RNA得率比较结果。

图5为不同保存液保存模拟样本第0天的对比结果。图A为商品化痰样本稀释液的结果，图B为本发明实施例1保存液的结果。

图6为不同保存液保存模拟样本第7天的对比结果。图A为商品化痰样本稀释液的结果，图B为本发明实施例1保存液的结果。

图7为不同保存液保存模拟样本对比结果。图A-C依次为实施例1-3痰液保存液结果。

图8为不同保存液保存模拟样本对比结果。图A-C依次为对比例1-3痰液保存液结果。

图9为不同样本使用不同提取方法提取RNA纯度比较结果。

图10为不同样本使用不同提取方法提取RNA得率比较结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明作进一步的说明。下述实施例中的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料及试剂，如无特别说明，均购自常规生化试剂商店。

实施例1

一种痰液保存液，由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍178g/L，8-羟基喹啉0.1M，十二烷基肌氨酸钠4 g/L，乙二胺四乙酸5mM，氯化钾3 g/L，丙三醇5%v/v，异丙醇10%v/v，proclin300 0.1%v/v，DEPC水 余量。

实施例2

一种痰液保存液，由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍236g/L，8-羟基喹啉0.5M，十二烷基肌氨酸钠10g/L，乙二胺四乙酸10mM，氯化钾10g/L，丙三醇10%v/v，异丙醇15%v/v，proclin300 1%v/v，DEPC水 余量。

实施例3

一种痰液保存液，由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍118g/L，8-羟基喹啉0.01M，十二烷基肌氨酸钠1g/L，乙二胺四乙酸5mM，氯化钾1g/L，丙三醇5%，异丙醇5%，proclin3000.1%，DEPC水 余量。

实施例4

本实施例考察痰液保存液预处理细胞的液基制片效果。取4例样本，各分为三份。第一份（A组）编号A-1、A-2、A-3、A-4，样本加入实施例1的痰液保存液；第二份（B组）编号B-1、B-2、B-3、B-4，样本加入实施例3的痰液保存液；第三份（C组）编号C-1、C-2、C-3、C-4，样本加入对比例1的痰液保存液，其余的实验因素均一致。

对比例1痰液保存液由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍178g/L，8-羟基喹啉0.1M，十二烷基肌氨酸钠20 g/L，乙二胺四乙酸5mM，氯化钾3 g/L，丙三醇5%v/v，异丙醇10%v/v，proclin300 0.1%v/v，DEPC水余量。

样本处理流程：样本中加入5mL保存液或稀释液，震荡30分钟；样本过滤并转移至12mL离心管；600g 10分钟离心富集细胞，弃上清；加入PBS缓冲液清洗细胞，600g 5分钟离心，弃上清；制片，染色，封片后观察结果。

染色后肉眼观察如图1所示，A组处理玻片上的细胞附着量最多（色深），B组次之，C组在1号和3号样本着色极浅，怀疑细胞损失严重。镜下观察，如图2所示，细胞形态无明显差异，A组和B组处理细胞密度佳，巴氏染色清晰，符合细胞学诊断要求，而C组出现不同程度的细胞丢失情况，细胞密度低。推测细胞保存液里的组分浓度可能影响细胞对载玻片的附着或者在样本预处理过程中造成细胞破裂并丢失。

因此，本发明痰液保存液处理后的样本可用于液基细胞制片前样本预处理。

实施例5

取4份痰液样本，随机编号后加入到实施例1所述的本发明保存液、商品化痰样本稀释液、生理盐水、NaOH溶液（4%m/v）中，对比磁珠法、Trizol提取和柱提法3种核酸提取方法的效果。其中，商品化痰液样本稀释液的配方为：二硫苏糖醇13.4g/L、氯化钠104g/L、氯化钾2.7g/L、磷酸盐17.6g/L、纯化水1/000ml。

结果如图3-4和表1所示。使用实施例1的保存液处理痰液，8min后液化效果良好；使用商品化痰样本稀释液处理痰液，15min后液化效果良好；使用NaOH保存液处理痰液，5min后液化效果良好；使用生理盐水处理痰液，仍可见痰液存在。

表1 不同保存液和提取方法处理痰液样本的RNA纯度

由表1、图3、图4可知，使用本发明保存液处理的痰液样本，RNA纯度高于使用商品化痰样本稀释液、生理盐水和NaOH溶液处理的痰液样本，磁珠法、Trizol提取和柱提法3种核酸提取方法的结果一致。使用柱提或Trizol法提取得到的RNA纯度满足要求，A260/A280比值均大于1.8；磁珠法提取RNA A260/A280比值在0.97～1.45间，可能有蛋白质等污染。但后续PCR检测时，未见抑制影响，也能够满足RT-PCR检测的要求。从得率上看，使用本发明保存液组提取的RNA优于另三种保存液。

实施例6

使用模拟样本（包含ORF1ab和N基因片段的假病毒，病毒拷贝数1×105copies/ml）和痰液样本进行检测评估。模拟样本分别加入本发明实施例1的保存液和商品化痰样本稀释液（配方见实施例5）。37℃保存7天后，使用磁珠法进行提取，提取后的核酸使用包含ORF1ab/N/E基因的RT-PCR体系进行检测，评估保存效果。

由图5-6和表2可知，与商品化痰样本稀释液比较，使用本发明痰液保存液的痰样本可以稳定保存7天，RNA质量不受影响；但相对商品化痰样本稀释液，使用本发明痰液保存液的痰样本的CT值略靠前，差异不明显。

表2 样本保存液与其他保存液的CT值对比

综上，使用本发明保存液可以稳定保存样本至少7天。经保存液保存的样本可以根据需要使用不同方法，包括但不限于磁珠法、柱提法或TRIZOL法进行核酸提取。

实施例7

痰液样本分别加入本发明实施例1-3的痰液保存液，以及对比例1-3的痰液保存液，于37℃放置1天后检测。使用磁珠法进行提取，提取后的核酸使用包含ORF1ab/N/E基因的RT-PCR体系进行检测，考察保存液组分含量对RNA提取及检测效果的影响。

对比例1痰液保存液见实施例4。对比例2的痰液保存液由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍100g ，8-羟基喹啉 0.1M，乙二胺四乙酸 5mM，十二烷基肌氨酸钠 4 g/L，氯化钾 3g，丙三醇 5%v/v，异丙醇 10%v/v，proclin300 0.10%v/v，DEPC水余量。对比例3痰液保存液由下述含量的下述组分组成：异硫氰酸胍178g/L，8-羟基喹啉0.1M，十二烷基肌氨酸钠4 g/L，乙二胺四乙酸15mM，氯化钾3 g/L，丙三醇5%v/v，异丙醇10%v/v，proclin300 0.1%v/v，DEPC水余量。

如图7所示，使用实施例1-3痰液保存液处理后的样本进行RNA提取，检测结果符合预期，说明本发明痰液保存液适用于核酸提取前样本预处理。

如图8所示，使用对比例1痰液保存液处理样本（图8A），会影响细胞与玻片的吸附能力，对qPCR检测影响不明显，说明该痰液保存液可以适用于核酸提取前样本预处理。使用对比例2痰液保存液处理样本（图8B，未检测出ORF1ab基因），扩增曲线线型明显变差。使用对比例3痰液保存液处理样本（图8C），qPCR检测显示荧光值下降，扩增效率下降。说明对比例2-3的痰液保存液不适用于核酸提取前样本预处理，对反应有抑制作用。

实施例8

使用本发明保存液处理痰液样本，整个操作中，由医生取样后，技术人员只需简单操作三步，即可完成样本结果分析：样本处理放样、取样，核酸提取放样、取样，核酸扩增配制体系、加样、上机。

S1、样本采集，放入样本保存液中。

S2、样本自动化预处理：装有样本的保存液的管放入自动样本转移机进行样本前处理。本实施例中使用安必平自动样本转移机（LBP-2801）完成样本前处理。

S3、自动化核酸提取：使用自动化核酸提取仪进行样本RNA提取。本实施例中使用安必平自动化的核酸提取仪（LBP-6832或 LBP-6808），程序设置包括裂解、取磁、结合、洗涤、洗脱五个步骤。通过仪器设置裂解70℃，洗脱55度。

S4、检测：提取后的RNA使用试剂盒（荧光RT-PCR法）进行检测。

本实施例中，步骤S1和步骤S2具体内容包括：痰液取样后，放入专门的痰液采集瓶。瓶盖上具穿插口，方便自动化处理时，搅拌棒或取液臂处理。使用安必平自动样本转移机（LBP-2801）进行痰液样本处理。本发明针对新冠的检测，使用样本保存液代替常规细胞保存液，借助样本转移机完成样本的前期处理，解决痰液样本液化过程，同时富集细胞，为后续的核酸提取及检测提供了有效样本。

表3、样本自动化预处理与手工处理对比表

使用自动样本转移机预处理痰液样本不需人工干预，可避免潜在生物危害；最多8次的混匀程序保证接触充分；低速离心去杂质；高速离心富集全部细胞；收集样本可全部用于RNA提取，处理效率高、质量好。

本实施例还对核酸提取自动化、手工提取的效果做了对比。结果如表4、图9和图10所示。表4中为RNA浓度，单位ng/ul，括号内数值为OD260/OD280。

1、手工磁珠提取步骤：（1）加入20μL磁珠悬浮液和500μL裂解液至离心管中。（2）转移200μL血清、血浆、组织匀浆液、拭子浸泡液等样品至含磁珠/裂解液的离心管中。涡旋混匀15秒，70℃孵育10分钟。（3）转移至磁力架上，静置1分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（4）取下离心管，加入500μL 洗脱液1并涡旋混匀10秒。转移至磁力架上，静置1分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（5）取下离心管，加入500μL 洗脱液2并涡旋混匀10秒。转移至磁力架上，静置1分钟吸附磁珠，小心吸弃所有溶液。（6）重复步骤（5）一次。（7）短暂离心以甩下管壁上的液滴。转移至磁力架上，小心吸弃所有溶液。（8）取下离心管，开盖空气干燥5分钟。（9）加50~200μL洗脱液，吸打或涡旋打散磁珠，室温静置3分钟。（10）短暂离心收集管壁上的液滴，转移至磁力架上，静置2分钟。（11）转移提取产物至新的1.5mL离心管中。

2、自动化设备（磁珠）提取步骤

预装试剂包括磁珠液、裂解液和两种洗涤液。待测样本加入量200µL和20µL蛋白酶K。使用50~100µl 洗脱液洗脱。（1）打开机器，启动对应程序。（2）把搅拌套插到仪器中，并把试剂条放到仪器中。（3）约40分钟后，结束。（4）取出样本、试剂条和搅拌套。

Trizol法的具体提取方法是本领域公知技术，不再赘述。

表4 对比两种提取方式效率

由表4、图9和图10可知，RNA纯度表现为Trizol法＞磁珠（手工）＞磁珠（自动化）。但得率上磁珠法优于Trizol法；自动化设备操作便利，省时，总体表现佳。

以上所述实施例仅表达了本发明的诸多实施方式中的少数，虽然其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (6)

1.一种痰液保存液，其特征在于，包含下述含量的下述组分：异硫氰酸胍118g~236g/L，8-羟基喹啉0.01~0.5M，十二烷基肌氨酸钠1 ~10 g/L，乙二胺四乙酸1~10mM，氯化钾1~10g/L，丙三醇1%~10%v/v，异丙醇5~20%v/v。

2.权利要求1所述的痰液保存液，其特征在于：包含下述含量的下述组分：异硫氰酸胍150g~200g/L，8-羟基喹啉0.08~0.3M，十二烷基肌氨酸钠3 ~6 g/L，乙二胺四乙酸3~7mM，氯化钾2~5g/L，丙三醇3%~7%v/v，异丙醇8~12%v/v。

3.权利要求2所述的痰液保存液，其特征在于：所述痰液保存液包含下述含量的下述组分：异硫氰酸胍178g/L，8-羟基喹啉0.1M，十二烷基肌氨酸钠4 g/L，乙二胺四乙酸5mM，氯化钾3 g/L，丙三醇5%v/v，异丙醇10%v/v。

4.权利要求1所述的痰液保存液，其特征在于：还包含防腐剂，所述防腐剂的含量为0.1%~0.5%v/v。

5.权利要求4所述的痰液保存液，其特征在于：所述防腐剂的含量为0.1%v/v。

6.权利要求4所述的痰液保存液，其特征在于：所述防腐剂为proclin300或叠氮化钠。

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