CN112391445B - 用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及病毒检测技术，旨在提供一种用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法。该样本释放剂能够同时用作样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存用途，其所含组分及浓度关系为：KCl，40mM；非离子表面活性剂Triton X‑100，质量百分比浓度为0.1％；防腐剂BND‑10，质量百分比浓度为0.1％；余量为去离子水。本发明既可作为已有样本的裂解液使用，又可直接作为样本采集使用的样本保存液。可有效地对含有病原体的样本进行裂解，其成分不影响下游PCR检测效果，且在4℃、室温、37℃等多种温度条件下都可稳定有效的检出核酸。确保在不同条件下采集的样本，都可完成后续检验。能够极大提高实验室工作效率，有效避免实验污染环节，减少医疗废弃物的产生。

Description

用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法
技术领域
本发明涉及病毒检测技术，特别涉及用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法。
背景技术
现行传统的病毒样本保存液主要有灭活型和非灭活型两种。非灭活型病毒样本保存液主要是Hank氏病毒保存液，是病毒运送的常见的平衡盐溶液(Balanced SaltSolution，BSS)。受各种因素的影响，Hank's液保存病毒只能保存数个小时，数个小时之后病毒形态就会受到影响，进而会影响到病毒的核酸检测效率。如果时间再延长一些，那么还很容易滋生细菌、真菌，导致Hank's液pH值下降，加速病毒降解，所以很难用于病毒的长期保存与核酸检测。灭活型病毒保存液常见的是基于胍盐的病毒保存液。其中的盐酸胍或者Rnasin的浓度相对而言较高(3-5M)，高浓度的胍盐适用于常温下的病毒灭活。但是由于胍盐浓度太高，对于诸如磁珠法的核酸提取或纯化有很大的抑制作用，需要多次洗涤或者用于离心柱的方式才可进行。并且，后续的病毒培养等试验无法使用胍盐保存液。
PCR(Polymerase Chain Reaction)——聚合酶链式反应经过世界范围内无数学者的不断补充完善，已经成为整个生命科学领域应用最广泛、使用频率最高也是最重要的基础研究手段。传统PCR技术以及在此基础上衍生出来的各项新技术新应用，都有一个前提，就是需要事先获得高纯度的核酸模版。DNA与RNA的分离提取一直以来都是相关科研技术人员每天需要不断重复的基础工作。新的Direct PCR技术(直扩法)解决了这一难题。Direct PCR技术是指无需对核酸进行分离提取，直接以组织样本为对象，加入目标基因引物进行PCR反应。它的模板既包括传统的DNA模版，也包含RNA模版的逆转录PCR。Direct PCR技术不仅仅是直接对组织样本进行常规定性PCR反应，还包括Real-Time qPCR反应，这就要求反应体系具备极强的抗背景荧光干扰能力以及对内源性荧光淬灭剂的拮抗能力。DirectPCR技术针对的组织样本，只需要核酸模版的释放，并不对干扰PCR反应的蛋白、多糖、盐离子等进行去除，这要求反应体系中的保存液可以保护核酸聚合酶和PCR Mix的功能，能够在复杂的条件下保证酶活性和复制准确性。
直扩法检测可以节省检测时间，提高效率。但是，现行常见的病毒预处理液，例如Hank氏病毒保存液和基于胍盐的保存液均不能很好的用于后续的直扩法检测，从而很难用于病毒样本的快速检测和筛查的应用场景中。因此，本领域需求一种能够很好适配于基于直扩法的病毒核酸检测的样本保存液。
发明内容
本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种用于病毒核酸检测的样本释放剂、试剂盒及预处理方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的解决方案是：
提供一种用于病毒核酸检测的样本释放剂，其所含组分及浓度关系为：
KCl，40mM；
非离子表面活性剂Triton X-100，质量百分比浓度为0.1％；
防腐剂BND-10，质量百分比浓度为0.1％；
余量为去离子水。
本发明还提供了一种试剂盒，包括能够同时用作样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存用途的样本释放剂；该样本释放剂的组分及浓度关系为：
KCl，40mM；
非离子表面活性剂Triton X-100，质量百分比浓度为0.1％；
防腐剂BND-10，质量百分比浓度为0.1％；
余量为去离子水。
本发明提供了前述样本释放剂在病毒核酸检测中用作样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存的用途。
本发明进一步提供了利用前述样本释放剂进行病毒核酸检测预处理的方法，包括步骤：
(1)将病毒样本浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到细胞保存液，保存备用；
(2)将细胞保存液涡旋混匀，吸取PCR扩增所需用量，加入等体积的样本释放剂；混合均匀后在4～37℃条件下放置10min，得到完成核酸释放的待检样本混合液；
(3)直接将待检样本混合液用于荧光定量PCR检测；或者，将待检样本混合液保存在4～37℃条件下，备用于荧光定量PCR检测。
本发明中，所述步骤(1)、(3)中，所述保存时间均控制在15天内。
本发明中，所述步骤(2)中，在吸取PCR扩增所需用量后，先在12000rpm离心10min，弃上清；再加入等体积的样本释放剂。
发明原理描述：
非离子表面活性剂Triton X-100(聚乙二醇辛基苯基醚)在多个技术领域均有广泛应用。例如在农药、橡胶工业用作乳化剂，建筑行业用作沥青乳化剂；气相色谱固定液、分离分析烃类化合物、含氧化合物。可广泛的应用于不同的学科领域。在显微镜和组织学实验室，其稀释的溶液可作为润湿剂，协助染色，并可作为清洁剂对钻石刀进行清洁。在电子工业领域，该产品的作为晶片清洁剂，以便增强和加速某些程序和操作。在生命科学领域，该产品经常被用于水中帮助分解蛋白酶；但是，必须使用尽可能低的浓度否则会污染样品，污染还会影响MS分析。该产品通常还作为聚合乳液的配方使用。
本发明通过使用非离子表面活性剂Triton X-100代替传统的胍盐的使用，其作用原理是：使用中性的表面活性剂裂解病毒的同时，提高了核酸保存的稳定性。保证已释放的核酸可直接进行后续PCR反应，取代了核酸提取步骤；另一方面，可以直接使用本样本释放剂完成采样工作，采集的生物标本可室温存放15天。因此，本发明能够有效地对含有病原体的样本进行裂解，释放其中的核酸，并降低对下游实验的抑制，大大缩短了检测时间，同时病原体DNA/RNA充分释放且本身不干扰后续PCR的扩增。
现有技术中，也会采用Triton X-100或SDS、胍盐等进行样本裂解与核酸释放，但通常需要加入裂解、洗涤、洗脱等繁琐的提取步骤，这就导致了预处理试剂复杂、操作流程多、检验时间延长等问题，无法适应重大疫情等特殊情况下的大批量样本、快速出结果的要求。本发明所提供的样本释放剂，通过合理搭配辅助试剂，能够同步完成样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存；并且，无需提纯步骤即可直接用于检测，且由于保存方式灵活，极大提高了样本处置时间的可计划性，提供了样本大批量快速处理的可能性、样本复查复检的便利性。
与现有技术相比，本发明的技术效果是：
1、本发明采用的核酸释放剂使用非离子表面活性剂代替传统的胍盐，可有效地对含有病原体的样本进行裂解。通过下游试验结果说明，本发明可以有效替代现有的病毒裂解液。
2、本发明采用的核酸释放剂成分不影响下游PCR检测效果，且在4℃、室温、37℃等多种温度条件下都可稳定有效的检出核酸。确保在不同条件下采集的样本，都可完成后续检验。
3、本发明采用的核酸释放剂既可作为已有样本的裂解液使用，又可直接作为样本采集使用的样本保存液。本发明作为裂解液使用只需10min即可完成裂解，直接取处理液完成检测，节省操作时间。本发明作为保存液使用，无需多余步骤的处理，可直接取样检测。
4、本发明不需要像传统的核酸提取试剂盒一样进行裂解、洗涤、洗脱等繁琐的提取步骤，极大提高实验室工作效率，并有效避免了实验操作过程中可能发生污染的环节，同时还减少医疗废弃物的产生。
附图说明
图1为实施例一中的扩增曲线图示(其中核酸对照标示为N1、N2、N3；样本释放剂处理标示为S1、S2、S3。)。
图2为实施例三中的扩增曲线图示(其中核酸对照标示为N1、N2、N3；样本释放剂处理标示为S1、S2、S3。)。
具体实施方式
为了检测样本释放剂的效果，本发明分别选择DNA病毒样本和RNA病毒样本使用本样本释放剂(KCl的浓度为40mM、Triton X-100的浓度为0.1％、防腐剂BND-10的浓度为0.1％)处理，同时完成real-time qPCR扩增检测。
下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。
实施例一
用于宫颈脱落细胞的预处理和人乳头瘤病毒(HPV)的快速检测的有效性。
为了测试本发明中的样本释放剂处理DNA病毒的有效性，使用样本释放剂对宫颈脱落细胞进行处理：
取3个带有宫颈脱落细胞的采样拭子，分别浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到3份细胞保存液，样本编号为1-3；针对样本1-3分别进行如下操作：
涡旋混匀后，吸取50μL，12000rpm离心10min，弃上清，加入50μL样本释放剂，室温处理10min。吸取5μL完成荧光定量PCR(Real Time-qPCR)检测。同时使用已经提取好的对应样本的核酸作为检测对照。
实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)扩增检测程序如表1所示，检测结果如表2。
所检测荧光的扩增曲线如图1。
表1
Figure GDA0003738646910000051
*在步骤4的52℃时收集荧光。
表2
Figure GDA0003738646910000052
上述结果表明，对于该发明中的病毒预处理方式，在室温预处理10min，对于人乳头瘤病毒(HPV)的DNA能够很好的进行释放(这里说了，10min可完成释放)，并且可以直接用于后续的Direct PCR检测。并且后续qPCR检测的结果与提取的核酸的检测Ct值相当。
实施例二
用于人乳头瘤病毒(HPV)样本的预处理和快速检测的稳定性。
为了测试本发明中的样本释放剂保存DNA病毒的稳定性，使用该发明的样本释放剂对人乳头瘤病毒(HPV)宫颈脱落细胞进行预处理：
取3个带有宫颈脱落细胞的采样拭子，分别浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到3份细胞保存液，样本编号为1-3；针对样本1-3，分别在第1天、第6天、第9天、第11天、第13天、第14天、第15天进行如下操作：
涡旋混匀后吸取50μL，12000rpm离心10min，弃上清，加入50μL样本释放剂，混匀后室温放置10min。然后放置于4℃冰箱、室温及37℃恒温培养箱中保存。在第15天取出所有样本，与当日处理的样本以及提取好的对应样本的核酸一并进行检测。检测结果如表3-5。
表3
Figure GDA0003738646910000061
表4
Figure GDA0003738646910000062
表5
Figure GDA0003738646910000063
上述结果表明，本发明中的样本释放剂除了能够有效保存生物样本，还可以直接保存被释放的病毒核酸。在15天内，均可稳定检出DNA病毒核酸。
实施例三
用于肠道病毒(EV)咽拭子样本的预处理和肠道病毒(EV)快速检测的有效性。
为了测试本发明中的样本释放剂处理RNA病毒的有效性，使用该发明的样本释放剂对肠道病毒(EV)咽拭子样本进行预处理：
取3个肠道病毒(EV)咽拭子，分别浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到3份细胞保存液，样本编号为1-3；针对样本1-3分别进行如下操作：
涡旋混匀后，吸取25μL，等比加入25μL样本释放剂，混匀后室温处理10min。吸取5μL完成荧光定量PCR(Real Time-qPCR)检测。同时使用已经提取好的对应核酸作为检测对照。
实时荧光定量PCR(Real-time qPCR)扩增检测程序如表6所示，检测结果如表7。所检测荧光的扩增曲线如图2。
表6
Figure GDA0003738646910000071
*在步骤3的58℃时收集荧光
表7
Figure GDA0003738646910000072
上述结果表明，本发明中样本释放剂在室温预处理10min，对于肠道病毒(EV)的RNA能够很好的进行释放，并且可以直接用于后续的Direct PCR检测。但后续qPCR检测的结果比提取的核酸的检测Ct值要偏大，即达到阈值的时间有延迟。但对于疫情等大批量、快速检测的应用场景，该延迟结果可以接受的。
实施例四
本发明用于肠道病毒(EV)样本预处理和快速检测的稳定性。
为了测试本发明中的样本释放剂保存RNA病毒的稳定性，使用该发明的样本释放剂对肠道病毒(EV)咽拭子样本进行预处理：
取3个肠道病毒(EV)咽拭子，分别浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到3份细胞保存液，样本编号为1-3；针对样本1-3分别进行如下操作：
分别在第1天、第6天、第9天、第11天、第13天、第14天、第15天进行处理。涡旋混匀后吸取25μL，等体积加入25μL样本释放剂，混匀后室温放置10min。然后放置于4℃冰箱，室温及37℃恒温培养箱中保存。在第16天取出所有样本，与当日处理的样本以及提取好的对应核酸一并进行检测。检测结果如表8-10。
表8
Figure GDA0003738646910000081
表9
Figure GDA0003738646910000082
表10
Figure GDA0003738646910000083
上述结果表明，对于该发明中的样本释放剂除了可以用于生物采集样本的保存，还可以直接保存已释放的核酸。15天以内，可以保证RNA病毒样本稳定检出。

Claims (4)

1.一种用于病毒核酸检测的样本释放剂，其特征在于，其所含组分及浓度关系为：
KCl，40mM；
非离子表面活性剂Triton X-100，质量百分比浓度为0.1%；
防腐剂BND-10，质量百分比浓度为0.1%；
余量为去离子水。
2.一种试剂盒，其特征在于，包括能够同时用作样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存用途的样本释放剂；该样本释放剂的组分及浓度关系为：
KCl，40mM；
非离子表面活性剂Triton X-100，质量百分比浓度为0.1%；
防腐剂BND-10，质量百分比浓度为0.1%；
余量为去离子水。
3.权利要求1所述样本释放剂在病毒核酸检测预处理中用作样本保存、蛋白裂解、核酸释放与保存的用途。
4.利用权利要求1所述样本释放剂进行病毒核酸检测预处理的方法，其特征在于，包括步骤：
（1）将病毒样本浸入样本释放剂中，摇晃、混匀后得到细胞保存液，保存备用；保存时间控制在15天内；
（2）将细胞保存液涡旋混匀，吸取PCR扩增所需用量，在12000rpm离心10min，弃上清；再加入等体积的样本释放剂，混合均匀后在4～37℃条件下放置10min，得到完成核酸释放的待检样本混合液；
（3）直接将待检样本混合液用于荧光定量PCR检测；或者，将待检样本混合液保存在4～37℃条件下，备用于荧光定量PCR检测；保存时间均控制在15天内；所述荧光定量PCR检测是非诊断目的的。
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