CN108949748A - 一种痰液液化及核酸保护试剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种液化痰液同时有效保护样本核酸的试剂，由胍类、半胱氨酸衍生物和高分子惰性颗粒组成，其中胍类为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；半胱氨酸衍生物为半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、高半胱氨酸、甲基半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种或多种；高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒、聚乙烯颗粒、聚氯乙烯颗粒、聚苯乙烯颗粒中的一种或多种。本发明试剂为粉末和颗粒混合的固体，能够较好地渗入痰液样本中，充分混匀痰液样本，从而实现痰液充分液化，同时本发明涉及的试剂能够在常温条件下长效保护痰液样本中的核酸不被降解。本发明涉及的试剂成分简单且成本低，生产工艺简易，使用操作简单，非常适合在临床广泛使用。

Description

一种痰液液化及核酸保护试剂

技术领域

本方法属于用于医学检测的样本处理及保存技术领域，涉及一种痰液液化及核酸保护试剂，技术关键在于促进样本液化以及保护样本中的核酸不被降解。

背景技术

痰是人体呼吸道的分泌物，它是通过支气管纤毛运动上皮纤毛的运动，从肺部向上呼吸道推动，最后，通过人的正常咳嗽反射从气管内咳出排出体外，正常人痰很少，只是保持呼吸道湿润而分泌的少量粘液。当人吸入刺激性气体、尘埃、致病细菌、病毒等有害微生物时，上呼吸道就可能发生炎症；或者肺部发生疾病，如支气管扩张、肺脓肿、肺癌等，呼吸道就会分泌增加，痰量就会增加，痰液中包含多种病原微生物、各类炎症细胞、脱落坏死的黏膜上皮细胞以及肿瘤细胞等。通过检测痰液样本中病原体的核酸来鉴定病原体的种类是目前较精准且最快速的呼吸道病原体诊断方法。随着荧光定量PCR以及多重PCR技术在病原体检测领域的快速发展，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、检测迅速、检出率高等特点，该技术已逐渐在临床诊断领域占据重要地位。此外，从肺癌高危人群及肺癌患者的痰液样本中提取核酸，可用于早期肺癌的预测以及肺癌患者的基因突变检测和治疗监测。

痰液样本具有粘度大、蛋白多、成分复杂等特点，痰液包含粘蛋白和其他多种蛋白(如免疫蛋白)、多种酶类、脱落细胞、微生物及其他吸入杂质等。由于痰液粘稠度大，不便于直接检测，临床上痰液样本的检测需要先对痰液进行液化处理，目的是释放黏蛋白，降低痰液粘度。常见的痰液液化方法为氢氧化钠法、DTT(二硫苏糖醇)法以及蛋白酶法。氢氧化钠法是最常用的痰液液化方法，该方法比较简单，利用主成分为一定浓度的氢氧化钠溶液在60-80℃(也可在室温条件下)液化痰液，该方法用于核酸检测时其强碱性环境易造成核酸损失。蛋白酶法的原理是利用蛋白酶消化痰液黏蛋白，该方法的酶解反应耗时较长，所需蛋白酶成本较高，且黏蛋白消化效率低。DTT(二硫苏糖醇)法是目前最常用的痰液液化方法，利用含巯基(-SH)的DTT(二硫苏糖醇)断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，以PBS缓冲液(磷酸盐缓冲液)提供生理缓冲，通常还会加入乙醇等固定细胞。该方法耗时长，且使用的DTT(二硫苏糖醇)成本较高，且DTT稳定性差，需要在低温条件下保存，同时DTT存在一定的毒性，不适合临床上大批量处理痰液样本。此外，由于痰液样本粘度大，常规液化处理过程中易产生混合不均的问题。

痰液样本中的核酸(尤其是RNA)极不稳定，通常在温室条件下数小时就被降解。然而在临床检测中，往往不能及时处理和检测痰液样本中的核酸，因此发明一种能够快速充分液化痰液同时有效保护样本核酸的方法十分必要。目前已公开的关于痰液液化及核酸保护的发明较多。然而，这些方法普遍存在成分复杂、成本高、样本混匀及液化不充分等问题。

目前已公开的相似专利为中国专利申请文件CN104232621A公开的《一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法》，该专利描述的消化液同时具有液化痰液和保存核酸的功能，但是该消化液的组成复杂，成本较高，且处理后的痰液样本只能低温条件下有效保存。其他发明专利仅单独涉及痰液液化或痰液核酸保护，例如：中国专利申请文件CN205020193U公开的《痰液旋转研磨均质液化装置》均匀机械法液化痰液，不仅装置成本高，还无法有效保护样本核酸不被降解；中国专利申请文件CN104263721A公开的《一种保护痰液中核酸(DNA和RNA)的痰纸及核酸提取方法》主要存在以下不足：其专利所述，仅在痰纸上浸润了的核酸保护液，浸润的保护液含量有限，不能保证痰液样本与核酸保护液充分接触，对痰液中核酸的保护效果一般。

此外，关于保护细胞或组织核酸的相关专利，例如中国专利申请文件CN105145545A公开的《用于常温条件下长期保存和运输组织样本的核酸保护液》以及中国专利申请文件106065400A公开的《一种核糖核酸保护剂、试剂盒、应用及保存方法》等，这些专利涉及的技术均可用于保护组织或细胞的核酸。然而，这些专利涉及的核酸保护剂成分比较复杂，如含有防腐剂、缓冲剂、螯合剂、酶抑制剂、固定剂等，保护剂成分多且成本高，不适合临床广泛使用。

发明内容

痰液样本粘度大，常规液化处理耗时长且样本混匀不彻底，同时痰液样本中核酸极易被降解，目前缺乏成本低廉、生产工艺及操作简单、同时能够充分促进样本混匀且在室温条件下有效保护样本核酸的方法，本发明提供了一种有效液化痰液且保护痰液样本中核酸的试剂。

本发明的技术方案是：

本发明提供一种痰液液化及核酸保护试剂由胍类、半胱氨酸衍生物和高分子惰性颗粒组成，其中胍类为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；半胱氨酸衍生物为半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、高半胱氨酸、甲基半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种或多种；高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒、聚乙烯颗粒、聚氯乙烯颗粒、聚苯乙烯颗粒中的一种或多种。

进一步，胍类为盐酸胍或异硫氰酸胍。

进一步，半胱氨酸衍生物为半胱氨酸或乙酰半胱氨酸。

进一步，高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒或聚乙烯颗粒。

进一步，所述试剂由以下重量份数的成分组成：1-4.5份的胍类；0.1-0.5份的半胱氨酸衍生物；0.1-4份的高分子惰性颗粒。

进一步，所述试剂由以下重量份数的成分组成：2.5份盐酸胍、0.5份半胱氨酸、2份聚丙烯颗粒。

进一步，所述试剂为固体颗粒与粉末的混合物。其中胍类和半胱氨酸衍生物的为粉末状，高分子惰性颗粒为颗粒状，均匀混合即可。

进一步，所述试剂的添加量为每毫升痰液样本添加试剂0.5-2.5g。

经实验验证，最优组合试剂为：2.5g盐酸胍+0.5g半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒，适宜处理的痰液样本体积为2-6ml。该组合试剂处理后的痰液样本可在37℃条件下有效保存样本中核酸至少达到168小时(共7天)，在50℃和60℃条件下有效保存样本中核酸至少达到24小时。

本发明的原理如下：半胱氨酸及其衍生物是一种含有巯基的氨基酸或其衍生物类物质，其巯基(-SH)的作用是断裂痰液中导致粘稠的主要成分粘蛋白，从而降低痰液粘度，液化痰液，同时其还具有抑制核酸酶的作用。与传统常用的巯基试剂(β-巯基乙醇和二硫苏糖醇)相比，半胱氨酸及其衍生物具有以下优势：(1)半胱氨酸及其衍生物更稳定，可在在常温条件下放置，而β-巯基乙醇和二硫苏糖醇等需要在低温条件下放置；(2)半胱氨酸的成本较低；(3)半胱氨酸为天然氨基酸，对人体无毒副作用，生产和使用过程中更为安全；(4)半胱氨酸本身为两性化合物，具有良好的pH缓冲能力，更有利于痰液液化及核酸保护。为了进一步保护样本核酸，添加常用的核酸酶抑制剂——盐酸胍，进一步抑制样本中的核酸酶(包括DNase和RNase)活性，从而更有效保护样本核酸。聚丙烯等惰性颗粒不溶于水及常见的有机溶剂(乙醇、苯酚及氯仿等)，不与之发生反应，也不会吸附核酸等活性物质，其作用为：(1)促进痰液样本的充分混匀，与痰液样本混合过程中可有效打散并混匀样本，促进样本液化；(2)在产品生产过程中促进其他粉末原料的混匀；(3)作为产品的重量补充，增大最小包装量，便于生产自动化分装。

本发明的有益效果是：本发明提供了一种效液化痰液且保护痰液样本中核酸的试剂及方法。本发明涉及的试剂为粉末和颗粒混合的固体，能够较好地渗入痰液样本中，充分混匀痰液样本，从而实现痰液充分液化，同时本发明涉及的试剂能够在常温条件下长效保护痰液样本中的核酸不被降解。本发明涉及的试剂成分简单且成本低，生产工艺简易，使用操作简单，非常适合在临床广泛使用。

附图说明

图1为实施例2中电泳法检测痰液样本中的核酸的电泳图谱，从左至右依次为1号、2号、3号、4号、Marker。

具体实施方式

为验证本方法的有效性，分别使用荧光定量PCR法和电泳法对本方法进行对比验证实验。实施例中所用到的痰液样本由浙江今复康生物科技有限公司委托浙江大学医学院附属第一医院呼吸内科按临床标准取痰程序采集，参照《中国结核病防治规划·痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》，通过目测，黄色、灰色、铁锈色、血性、脓性、稠厚，呈现团块状的标本为接收标准。肺癌阳性痰液由临床确诊的肺癌患者采集得到。肺癌细胞中含有的端粒酶赋予了肺癌细胞无限增殖的能力，而端粒酶由肺癌细胞的hTERT mRNA翻译合成，因此hTERT mRNA是肺癌细胞的特征标志物。正常人的肺癌组织中无hTERT mRNA表达。在痰液的产生和咳出过程中，脱落的肺癌细胞混合在痰液中被咳出。因此在肺癌患者的痰液中能够检测到hTERT mRNA。核酸检测采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，该试剂盒可检测痰液样本中的hTERT mRNA。当PCR扩增结果为Ct值＜33时，表明检测结果为阳性即表示样本中含有hTERTmRNA；当PCR扩增结果为Ct值≥33或No Ct时，表明检测结果为阴性即表示样本中无hTERTmRNA。

实施例1：

一种痰液液化及核酸保护试剂，称取2.5g盐酸胍+0.5g半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒混合均匀，制得本实施例的试剂。

本试剂与传统方法对痰液液化效果的对比实验

步骤1：准备8-10例从医院收集得到的目测较为粘稠的痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取4份3ml样本，编号1-4；

步骤2：向1号样本中加入本实施例的痰液液化及核酸保护试剂；向2号样本中加入6ml二硫苏糖醇溶液(2％)；向3号样本中加入6ml胰蛋白酶溶液(含pH7.0的缓冲体系)；向4号样本中加入6ml氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，以上样本均振荡混匀5分钟；

步骤3：利用滤纸分别过滤上步得到的液化后的4个样本，观察并记录过滤现象，结果如下表所示，过滤结果表明，本方法液化后的痰液可顺利被过滤，证明本方法对痰液液化效果较好，痰液粘稠度明显下降。二硫苏糖醇法液化效果尚可，氢氧化钠法次之，蛋白酶法效果较差。

样品编号	1号	2号	3号	4号
					液化方法	实施例1	二硫苏糖醇法	蛋白酶法	氢氧化钠法
过滤现象	过滤顺利	过滤较顺利	过滤十分缓慢	过滤较缓慢
					液化效果	较好	较好	较差	一般

实施例2：本试剂与传统方法对液化后痰液核酸的保护作用对比

步骤1：准备4-6例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取4份2ml样本，编号1-4；

步骤2：向1号样本中加入实施例1的痰液液化及核酸保护试剂；向2号样本中加入6ml二硫苏糖醇溶液(2％)；向3号样本中加入6ml胰蛋白酶溶液(含pH7.0的缓冲体系)；向4号样本中加入6ml氢氧化钠溶液(0.1mol/L)，以上样本均振荡混匀5分钟；

步骤3：荧光定量PCR法检测样本中的mRNA：采用浙江今复康生物科技有限公司开发的“端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)检测1-4号样本中的hTERT mRNA。检测结果如下表所示，1-2号样品均为hTERT mRNA阳性，其中1号Ct值最低，表明1号样品中的hTERT mRNA含量最高。3-4号样品均为hTERT mRNA阴性，其中3号样品仍有Ct值，表明其中可能含有微量hTERT mRNA，4号样品未检测到hTERT mRNA。

5.电泳法检测样本中的核酸：向1-4号管中加入600μl盐酸胍溶液(2.0g/ml)、100μl β-巯基乙醇、30μl 20％NP-40；60℃保温5min，剧烈震荡混匀，12000rpm离心10min，取上清上核酸分离柱，12000rpm离心1min；取700μl洗涤液(10mM MES pH6.0，35％乙醇)洗涤2次；将柱子置于干净的1.5ml离心管上，向柱子膜中间位置加30μl TE溶液，60℃保温3min；12000rpm离心1min，收集流出液，取15μl流出液进行凝胶电泳，电泳结果见图1。有图可知，1号样品对应的电泳条带宽且亮，证明其核酸含量最高；2号电泳条带亮度明显降低，证明其核酸含量较1号低；3号电泳条带只可见微弱的电泳条带，证明其含有微量的核酸；4号未见电泳条带，证明其几乎不含核酸。以上结果表明，本方法可有效保护痰液样本中的核酸不被降解。

实施例3：不同配方组合试剂的核酸保护效果对比

步骤1：准备15-20例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取20份2ml样本，以4份样本为一组，共得5组样本；

步骤2：配置如下表所示的组合保护剂：

步骤3：分别向5组痰液样本中加入试剂1-试剂5；将样品管置于37℃条件下放置，分别放置36小时、72小时、120小时、168小时后检测；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤3得到的样品进行检测，实验结果见下表。结果表明，本发明权利要求范围内的试剂1-试剂5在37℃条件下均可有效保护痰液样本中核酸达到168小时，其中试剂3(即实施例1中的痰液液化及核酸保护试剂)对痰液样本中核酸保护效果最好。

实施例4：最优组合试剂可在37℃条件下保护痰液核酸达到13天

步骤1：准备6-8例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取8份2ml样本，以两份样本为一组，共得4组，编号1-4；

步骤2：分别向1-4组样本中加入实施例1的痰液液化及核酸保护试剂，振荡混匀，将样品管置于37℃条件下放置10天以及13天后检测；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的样品进行检测，实验结果见下表。结果表明，加入最优组合试剂的痰液样本在37℃条件下放置13天后仍可检测到hTERTmRNA。

实施例5：最优组合试剂可在42℃条件下保护痰液核酸达到13天

步骤1：准备6-8例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取8份2ml样本，以两份样本为一组，共得4组，编号1-4；

步骤2：分别向1-4组样本中加入实施例1的痰液液化及核酸保护试剂，振荡混匀，将样品管置于42℃条件下放置10天以及13天后检测；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的样品进行检测，实验结果见下表。结果表明，加入最优组合试剂的痰液样本在42℃条件下放置13天后仍可检测到hTERTmRNA。

实施例6：最优组合试剂可在50℃条件下保护痰液核酸至少24小时

步骤1：准备4-6例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取4份2ml样本，编号1-4；

步骤2：分别向1-4号样本中加入实施例1的痰液液化及核酸保护试剂，振荡混匀，将样品管置于50℃条件下放置24小时后检测；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的样品进行检测，实验结果见下表。结果表明，加入最优组合试剂的痰液样本在50℃条件下放置24小时仍可检测到hTERTmRNA。

实施例7：组合试剂：2.5g异硫氰酸胍+0.5g乙酰半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒可在37℃条件下保护痰液核酸至少168小时

步骤1：准备4-6例从医院收集得到的肺癌患者痰液样本，将这些痰液样本充分混合，分别取4份2ml样本，编号1-4；

步骤2：分别向1-4号样本中加入2.5g异硫氰酸胍+0.5g乙酰半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒，振荡混匀，将样品管置于37℃条件下放置，分别放置36小时、72小时、120小时、168小时后检测；

步骤3：利用端粒酶逆转录酶亚基(hTERT)mRNA检测试剂盒”(国械注准20173404247)，参照产品说明书操作步骤对步骤2得到的样品进行检测，实验结果见下表。结果表明，加入组合试剂：2.5g异硫氰酸胍+0.5g乙酰半胱氨酸+2g聚丙烯颗粒的痰液样本在37℃条件下放置168小时仍可检测到hTERT mRNA。

Claims (8)

1.一种痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，所述试剂由胍类、半胱氨酸衍生物和高分子惰性颗粒组成，其中胍类为盐酸胍、异硫氰酸胍、硫酸胍、碳酸胍中的一种或多种；半胱氨酸衍生物为半胱氨酸、乙酰半胱氨酸、高半胱氨酸、甲基半胱氨酸、半胱氨酸盐酸盐中的一种或多种；高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒、聚乙烯颗粒、聚氯乙烯颗粒、聚苯乙烯颗粒中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，胍类为盐酸胍或异硫氰酸胍。

3.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，半胱氨酸衍生物为半胱氨酸或乙酰半胱氨酸。

4.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，高分子惰性颗粒为聚丙烯颗粒或聚乙烯颗粒。

5.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，所述试剂由以下重量份数的成分组成：1-4.5份的胍类；0.1-0.5份的半胱氨酸衍生物；0.1-4份的高分子惰性颗粒。

6.根据权利要求5所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，所述试剂由以下重量份数的成分组成：2.5份盐酸胍、0.5份半胱氨酸、2份聚丙烯颗粒。

7.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，所述试剂为固体颗粒与粉末的混合物。

8.根据权利要求1所述痰液液化及核酸保护试剂，其特征在于，所述试剂的添加量为每毫升痰液样本添加试剂0.5-2.5g。