CN104232621A

CN104232621A - 一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法

Info

Publication number: CN104232621A
Application number: CN201410492307.8A
Authority: CN
Inventors: 邱英华; 周细武; 唐涛
Original assignee: NINGBO UNIGENEDX BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: NINGBO UNIGENEDX BIO-PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2014-09-23
Filing date: 2014-09-23
Publication date: 2014-12-24

Abstract

本发明涉及生物学领域中以痰液为样本提取核酸的方法及其应用。本发明提供了一种能够从痰液中提取核酸的专用试剂盒及提取方法，具体提取方法为：在痰液中加入1～5倍量的消化液KB，震荡混合均匀，加入蛋白酶于37～65℃保温1～5小时后，加入痰液样本量0.5～3倍量的结合液BS，震荡混合均匀后将溶液全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，再经过洗涤、洗脱等步骤，提取出痰液中含有的核酸。使用本发明提供的试剂盒提取得到的核酸得率高、纯度高，可直接用于分子生物学检测。

Description

一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法

技术领域

本发明涉及生物学领域中核酸(DNA和RNA)的提取方法，具体涉及一种从人类痰液中提取核酸的方法及其应用。

技术背景

肺癌(lung cancer)是一种常见的严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一。据统计，我国每年死于肺癌的患者达60万人，且以每年25％的速度增长，其死亡率及发病率在我国的几大城市位高居首位(范振符，陈志周，范飞舟.糖基化改变与肿瘤的基础研究[J].标记免疫分析与临床.2012,27(3):122-314)。在肺癌病人中，高达三分之二的病例在确诊时已是晚期阶段(Spiro SG,Silvestri GA.Thetreatment of advanced non-small cell Jung cancer[J].Curr Opin Pulm Med,2005,11:287-291)。虽然肺癌的早期诊断率只有15％，但这些患者的5年生存率可达60％～90％。因此，对高危、疑似肺癌人群进行早期诊断，是降低肺癌死亡率的重要途径。

纤维支气管镜、经皮肺活检、手术是肺癌确诊的主要手段，但这些手段系创伤性、花费大，且具有一定的并发症，不适合用于肺癌的早期筛查。痰脱落细胞学检查在过去30年里长期用于肺癌早期普查和诊断，与CT和支气管内镜检查相比，其标本取材方便、简单易行、费用低、无损伤。通过31290例痰标本细胞病理学检验结果,与CT、MRI、X线、气管镜、肺穿、手术结果对照,肺癌痰脱落细胞检查阳性率达到90.4％(王玲,王永才，赵成艳.肺癌痰脱落细胞检查诊断价值[J]中国医疗前沿,2008,3(16),92-93)。然而痰脱落细胞学检查存在如下缺点：需使用新鲜痰液，且选择其中带有特征性的部分进行检查；肿瘤细胞具有其特定的发育演变过程及形态特征,有些病例常常是在未见到典型的肿瘤细胞前而出现不正常细胞的形态变异，在判断是否为肿瘤细胞时需要依靠检验医师的业务水平、谨慎程度和责任心，存在主观因素。

寻找一种有效、安全、无创的辅助诊断手段以提高肺癌的早期临床诊断率是临床所迫切需要的。恶性肿瘤细胞的DNA含量异常是其基本生物学特征之一，它在肿瘤的发生、发展上具重要意义。研究表明，在肺癌的早期阶段，部分基因的表达出现了异常，例如KRAS、P53等，采用现代生物学技术分析检测病人痰液中的DNA，分析其中的异常情况，可为肺癌的早期诊断提供强有力的参考，必将会提高肺癌的发现率，对病人的临床诊断和治疗具有积极的意义。

由于痰液中有大量黏液，使其中的细胞成分不易分离，高纯度及较大量的DNA提取存在着一定困难。发明人采用了高效的痰液液化方法，在不破坏核酸的情况下对痰液进行液化处理，再采用蛋白酶消化痰液中的粘蛋白后，用离心柱法提取痰液中的核酸。采用本方法提取得到的痰液DNA纯度高、质量稳定，适用于分子生物学检测。

发明内容

本发明的目的是为了克服实验室现有技术的不足，提供一种能够从痰液中提取核酸的专用试剂盒及提取方法。

本发明提供的提取痰液核酸试剂盒所含试剂及耗材见表1，提取流程为：在痰液中加入1～10倍量的消化液KB，震荡混合均匀，加入蛋白酶于37～65℃保温1～5小时后，加入痰液样本量0.5～3倍量的结合液BS，震荡混合均匀后将溶液全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上。用洗涤液SWB1和SWB2分别洗涤吸附柱后，再用洗脱液将核酸从吸附柱上洗脱下来。

表1：痰液核酸提取试剂盒所含试剂及耗材

本发明的发明人以临床收集的痰液为样品，进行了大量的对比、优化实验，优选出提取痰液核酸的最适操作步骤及相应溶液的最佳配方。

消化液KB的成分包括但不限于SDS、EDTA、吐温20、DTT、Tris-HCl，在配方中的浓度见表2。

表2：消化液KB的配方

在消化液KB中，SDS的浓度为0.25g/L～0.95g/L，最适浓度为0.55g/L～0.75g/L；EDTA的浓度为0.05mmol/L～1.5mmol/L，最适浓度为0.06mmol/L～0.09mmol/L；吐温20的浓度为0.1％～6％，最适浓度为2.5％～3％；DTT的浓度为20mmol/L～100mmol/L，最适浓度为60mmol/L～85mmol/L；Tris-HCl浓度为20mmol/L～100mmol/L，最适浓度为50mmol/L～85mmol/L，最适pH为8.0～8.8。

结合液BS的成分包括但不限于盐酸胍、氯化钠、Tris-HCl，在配方中的浓度见表3。在结合液BS中，盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为6mol/L～7mol/L；氯化钠的浓度为50mmol/L～1mol/L，最适浓度为150mmol/L～350mmol/L；Tris-HCl浓度为50mmol/L～500mmol/L，最适浓度为100mmol/L～180mmol/L，最适pH为5.8～6.4。

表3：结合液BS的配方

洗涤液SWB1的配方见表4。其中盐酸胍的浓度为3mol/L～7mol/L，最适浓度为4mol/L～5mol/L；Tris-HCl浓度为50mmol/L～500mmol/L，最适浓度为200mmol/L～280mmol/L，最适pH为5.8～6.4；乙醇浓度为50％～80％，最适浓度为65％～75％。

表4：洗涤液SWB1配方

洗涤液SWB2的成分及配方见表5。

表5：洗涤液SWB2配方

洗脱液可以为纯水或pH值大于7.0的低盐溶液。

本发明以痰液作为样本，从中提取出高纯度、高质量的核酸，具有以下优势和应用价值：

1.方便痰液样本保存：本发明中的消化液同时具有液化痰液和保存核酸的功能，与痰液混合均匀后，可放置于4℃30天，有效保护样本中的核酸不被降解。

2.操作简便：操作步骤简单方便，适合大规模样品处理。

3.提取所得核酸完整：本试剂盒提取得到的核酸包含了痰液中的游离核酸和痰液中脱落细胞内的核酸，最大限度地保证了样品中核酸的完整性。

4.所提取的核酸纯度高：本试剂盒所提取的核酸纯度高，质量稳定，可直接用于分子生物学检测。

5.安全无毒：本试剂盒中所用试剂及耗材对人体无毒，使用安全。

附图说明：

图1：痰液DNA电泳图。

图2：以肺癌患者痰液DNA为模板，突变型KRAS(34G>T)为目的基因进行PCR扩增。

具体实施方式

下面以具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对本发明做出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

取扁桃腺炎病人的痰液1份，加入2倍量的消化液KB，震荡混合均匀。加入50μL蛋白酶K溶液，55℃水浴2h。加入与痰液等量的结合液BS，震荡混合均匀后将全部溶液离心通过核酸吸附柱(分批过柱，每次700μL)。在吸附柱中加入500μL SWB1，12000rpm离心1min后，再加入500μL SWB2，12000rpm离心1min，最后用50μL洗脱液进行洗脱得到DNA溶液。

取5μL DNA溶液与6×DNA Loading Buffer混合均匀后，加入0.7％琼脂糖凝胶的加样孔中，以5V/cm电泳30分钟后，在凝胶成像仪下观察电泳结果，见图2。在电泳图中能看到从痰液中提取得到的条带，分子量大于23Kb。

实施例2：

取已被确诊为肺癌患者的痰液(患者用力从肺部咳出的痰液样本)，加入3倍量的消化液KB，充分震荡混匀。加入100μL蛋白酶K，55℃水浴3h。加入与痰液等量的结合液BS，震荡混合均匀后将全部溶液离心通过核酸吸附柱(分批过柱，每次700μL)。在吸附柱中加入500μL SWB1，12000rpm离心1min后，再加入500μL SWB2，12000rpm离心1min，最后用50μL洗脱液进行洗脱得到DNA溶液。

PCR扩增实验：以人的突变后的KRAS为目的基因，取2μL洗脱下来的核酸溶液作为PCR模板，加入11μL去离子水和7μL的预混液，反应体系为20μL，以超纯水为阴性对照。预混液配制方法见表6，PCR反应程序见表7。

引物序列为：KRAS-F aaacttgtggtagttggagtta；KRAS-R tatctgtatcaaagaatggtcc

表6：PCR预混液的配制方法

表7：PCR反应程序

PCR反应结束后，取5μL扩增产物与6×DNA Loading Buffer混合均匀后，加入4％琼脂糖凝胶的加样孔中，以5V/cm电泳45分钟后，在凝胶成像仪下观察电泳结果，见图2。在电泳图中能看到清晰的、以人的突变型KRAS为目的基因扩增得到的条带，长度为280bp，阴性对照无条带，因此能确认该患者的痰液DNA中含有突变型的KRAS基因。

Claims

1.一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：在痰液中加入消化液KB，震荡混合均匀，加入蛋白酶保温后，再加入结合液BS，震荡混合均匀后将溶液全部通过核酸吸附柱，样品中的核酸将结合到吸附柱的硅胶膜上，用洗涤液SWB1和SWB2分别洗涤吸附柱后，再用洗脱液将核酸从吸附柱上洗脱下来。

2.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：消化液KB同时具有液化痰液和保存核酸的功能，与痰液混合均匀后，可放置于4℃1～30天，有效保护样本中的核酸不被降解。

3.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：消化液KB的用量为痰液样本的1～10倍量。

4.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：在消化液KB中，SDS的浓度为0.25g/L～0.95g/L，最适浓度为0.55g/L～0.75g/L；EDTA的浓度为0.05mmol/L～1.5mmol/L，最适浓度为0.06mmol/L～0.09mmol/L；吐温20的浓度为0.1％～6％，最适浓度为2.5％～3％；DTT的浓度为20mmol/L～100mmol/L，最适浓度为60mmol/L～85mmol/L；Tris-HCl浓度为20mmol/L～100mmol/L，最适浓度为50mmol/L～85mmol/L，最适pH为8.0～8.8。

5.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：使用蛋白酶消化痰液中的蛋白，加入蛋白酶后，于37～65℃保温1～5小时进行酶解。

6.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：在结合液BS中，盐酸胍的浓度为2mol/L～8mol/L，最适浓度为6mol/L～7mol/L；氯化钠的浓度为50mmol/L～1mol/L，最适浓度为150mmol/L～350mmol/L；Tris-HCl浓度为50mmol/L～500mmol/L，最适浓度为100mmol/L～180mmol/L，最适pH为5.8～6.4。

7.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：洗涤液SWB1中，盐酸胍的浓度为3mol/L～7mol/L，最适浓度为4mol/L～5mol/L；Tris-HCl浓度为50mmol/L～500mmol/L，最适浓度为200mmol/L～280mmol/L，最适pH为5.8～6.4；乙醇浓度为50％～80％，最适浓度为65％～75％。

8.如权利要求1所述的一种从痰液中提取核酸的试剂盒及提取方法，其特征在于：洗脱液SWB2可以为纯水或pH值大于7.0的低盐溶液。