CN109486809A - 一种大量提取转化粪便dna的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种大量提取转化粪便DNA的方法。首先将1～5g粪便收集到含保护液管中，加入裂解液充分裂解，再除去抑制剂，用有机溶剂沉淀核酸，通过重悬沉淀获得核酸，用于核酸提取或核酸转化，通过一系列结合洗涤步骤，最后洗脱得到粪便DNA。本发明包含粪便DNA的提取、转化和提取转化合并的方法。具有成本低、利用率高、重复性好、简单快速的特点，能得到大量粪便DNA或转化后的粪便DNA，为转化或下游的检测提供了更多可能性。

Description

一种大量提取转化粪便DNA的方法
技术领域
本发明涉及一种大量提取转化粪便DNA的方法。
背景技术
大肠癌包括结肠癌与直肠癌，是常见的消化道恶性肿瘤，发生率仅次于胃癌和食道癌，已高居世界恶性肿瘤第3位病死率第4位。有资料显示早期大肠癌术后5年存活率高达90％，而晚期大肠癌术后5年存活率只有10％，因此大肠癌的早筛显得尤为重要。目前早筛查措施主要包括粪便潜血实验，钡灌肠检查、肠镜检查等，但是肠癌早期无明显症状且缺乏高灵敏度和强特异性的早期诊断技术，大部分患者被确诊时已是肠癌中晚期，失去了最佳的治疗时机，因此建立早期肠癌无损伤快速诊断方法成为了当前医学界重点攻克难题。
研究表明，正常人的粪便每天大约可排泄约1010个上皮细胞，提取脱落到粪便里的结肠黏膜细胞的DNA，再通过转化技术，将未甲基化的胞嘧啶高效转化成尿嘧啶，最后检测基因启动子区的一段甲基化序列是否发生甲基化，是一种理想的早期结直肠癌筛查手段。
粪便样品获得比较容易，而且不会对病人造成任何的痛苦和不便。另外使用样本量少，取样过程非常方便且对病人无任何影响。但是目前应用于临床诊断还有诸多困难需要解决，比如采集和分离过程中存在DNA酶的降解，各种抑制剂的存在导致从粪便里提取出的人类粪便DNA量很少或提取的DNA难以用于PCR扩增。
目前市面上，已有相关粪便DNA提取方法，但是提取获得的粪便DNA量少或DNA难以用于PCR扩增，另外存在操作繁琐且价格昂贵；也已有相关粪便DNA转化方法，但是存在转化效果不稳定、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点；另外，传统方法对于粪便DNA提取与转化是分两个阶段完成，存在DNA损耗大、利用率低、操作繁琐且价格昂贵等诸多缺点，很难满足下游的分子诊断需求。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种大量提取转化粪便DNA的方法，可为下游的检测提供更多可能性。
本发明解决其技术问题的所采用的技术方案是：
技术方案一：
一种大量提取粪便DNA的方法，包括以下步骤：
1.取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2.先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；
3.将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；
4.取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；
5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；
6.往离心管加入100～800μL Buffer DTE，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA，涡旋混匀至沉淀散开；
7. 10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管；
8.加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及4～6M胍盐，胍盐包括异硫氰酸胍或盐酸胍中的至少一种，充分振荡混匀；
9.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
10.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
11.加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mMTris，40～100mM的EDTA，2～5M异硫氰酸胍以及40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
12.加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，所述Buffer DW2包括300～700mMTris，0.8～1.2M的NaCl以及70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
13.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
14.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
15.滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mMTris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
16. 10000～14000g离心1～5min，得到粪便DNA。
技术方案二：
一种大量转化粪便DNA的方法，包括以下步骤：
1.往离心管中加入10～200μL内含1ng～5μg待转化的粪便DNA；
2.再加100～800μL Buffer BCB，所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐，溶液pH4.0～7.0；
3.再往离心管加入10～300μL Buffer DPB，所述Buffer DPB包括10～500mMEDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚，混匀后瞬离；
4.将离心管放在扩增仪器上转化；
5.完成转化后，加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，所述BufferDBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍，充分振荡混匀；
6.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
7.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体；
8.加入500～750μL Buffer BDD于纯化柱中，所述Buffer BDD包括20～400mMTris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
9.加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mMTris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
10.加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，所述Buffer DW2包括300～700mMTris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
11.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
12.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
13.滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mMTris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
14. 10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便DNA。
技术方案三：
一种大量提取转化粪便DNA的方法，包括以下步骤：
1.取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2.先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；
3.将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；
4.取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；
5.取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；
6.往离心管加入100～800μL Buffer DTE，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA，涡旋混匀至沉淀散开；
7. 7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μL Buffer BCB，所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐；
8.再往离心管加入10～300μL Buffer DPB，所述Buffer DPB包括10～500mMEDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚，混匀后瞬离；
9.将离心管放在扩增仪器上转化；
10.完成转化后，加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，充分振荡混匀；所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍；
11.将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
12.将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
13.加入500～750μL Buffer BDD于纯化柱中，所述Buffer BDD包括20～400mMTris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
14.加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mMTris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，
15.加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇；
16.换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
18.滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mMTris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
19. 10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便DNA。
技术方案四，用于大量提取和转化粪便DNA的组合物，按体积比包括：
1)5-35mL Buffer SPB；
2)50～1000μL Buffer SLS；
3)1-2mL Buffer SDL；
4)100-800μL Buffer DTE；
5)100-800μL Buffer BCB；
6)10-300μL Buffer DPB；
7)20-800μL Buffer DBB；
8)500～750μL Buffer BDD；
9)500～750μL Buffer DW1；
10)500～750μL Buffer DW2；
11)30～200μL Buffer DTE。
本发明方法相比于传统方法具有以下优势：
1.Buffer SPB可以有效的保护人类粪便细胞或DNA不被降解，能满足冷链运输，也能满足室温运输；
2.通过使用本发明方法来提取转化人类粪便DNA能明显去除粪便中的PCR抑制剂；
3.传统方法普遍提取少量人类粪便且只用部分核酸去做转化，操作繁琐、价格昂贵且获得转化后人类粪便DNA量少。本发明方法可以提取1～5g人类粪便且在提取过程全部应用于转化；
4.传统方法一般转化1ng～2μg人类粪便DNA，存在转化效果不稳定、操作繁琐、价格昂贵且转化后人类粪便DNA量少，很难满足下游的分子诊断需求。本发明方法可以转化1ng～5μg人类粪便DNA，具有成本低、利用率高、重复性好、简单快速且能得到大量转化后的人类粪便DNA，为下游的检测提供了更多可能性；
5.传统对于人类粪便DNA提取与转化方法是分两个阶段完成，本发明方法将提取和转化合并为一，实现了成本低、利用率高、重复性好、简单快速且能得到大量转化后的人类粪便DNA，为下游的检测提供了更多可能性；
6.本发明方法样本不局限于人类粪便，也可应用于其他动物粪便样本类型。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
图1～2为人类粪便DNA提取浓度比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取方法，白色填充柱表示Qiagen提取方法。
图3～4为人类粪便DNA转化后荧光PCR Ct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的转化方法，白色填充柱表示Qiagen转化方法。
图5～6为人类粪便DNA提取转化后荧光PCR Ct值图，黑色填充柱表示的是本发明的提取转化方法。
具体实施方式
下面对本发明做进一步说明。现以人类粪便为例：
实施例1
对照试剂盒采用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit，共提取8例粪便样本，提取步骤如下：
1.取10mL InhibitEx Buffer于离心管中，再取1g粪便样本，涡旋1min至样本充分均质；
2.取2mL悬浊液至离心管中，全速离心1min；
3.取600μL上清至2mL离心管中，分别加入25μL蛋白酶K、加入600μL Buffer AL，震荡混匀并涡旋15s；
4. 70℃加热裂解10min；
5.取出再加入600μL无水乙醇，震荡混匀；
6.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
7.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
8.使用500μL Buffer AW1，12000g离心1min，倒去收集管中液体；
9.使用500μL Buffer AW2，12000g离心3min，换用新的收集管；
10.空甩12000g离心3min，换新的离心管；
11.使用50μL ATE洗脱产物，静置1min后12000g离心1min，得到人类粪便DNA。
根据本发明，共提取8例与对照一样的粪便样本，提取步骤如下：
1.取6mL Buffer SPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM NaCl、30％无水乙醇)至离心管中，再取1g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2.先加入500μL Buffer SLS(50mM EDTA、50mM Tris、20％SDS)，颠倒混匀，再加入100μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴10min；
3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；
4.取5mL上清于新的离心管中，加入1mL Buffer SDL(50mM EDTA、50mM Tris、2％PVP10和1M醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；
5.取全部上清于新的离心管中，再加3mL异丙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；
6.往离心管加入300μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)，涡旋混匀至沉淀散开；
7. 12000g离心2min，吸取全部液体至离心管；
8.加入300μL Buffer DBB(50mM EDTA、50mM Tris及4.5M异硫氰酸胍)和300μL无水乙醇，充分振荡混匀；
9.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
10.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
11.加入700μL Buffer DW1(50mM Tris，50mM EDTA，2M异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
12.加入700μL Buffer DW2(50mM Tris，0.8M NaCl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
13.换用新的收集管，12000g离心2min；
14.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
15.滴加50μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；
16. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。
实施例2
对照试剂盒采用EpiTect Fast BisμLfite Conversion Kits，共转化5例粪便核酸样本，转化步骤如下：
1.在PCR管中加入20μL DNA样本中加入85μL Bisulfite Solution和35μL DNAProtect Buffer；
2.混匀后将离心管放在扩增仪器上，按说明书程序转化；
3.转化后将上述140μL液体转入干净的1.5mL离心管中；
4.加入310μL Buffer BL和250μL无水乙醇，混匀后瞬时离心；
5.将混合液加入到离心柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；
6.加入500μL Buffer BW于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；
7.加入500μL Buffer BD于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；
8.加入500μL Buffer BW于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；
9.重复步骤“8”一次；
10.加入250μL无水乙醇于纯化柱中，12000g离心1min，丢弃收集管中的液体；
11.换用新的收集管，12000g离心2min；
12.将纯化柱放置于60℃金属浴上5min；
13.丢弃收集管，将纯化柱放置于新离心管中；
14.滴加50μL Buffer EB于纯化柱膜上，室温孵育5min；
15. 12000g离心1min，得到转化后的人类粪便DNA。
根据本发明，共转化8例与对照一样的粪便核酸样本，转化步骤如下：
1.往离心管中加入20μL待转化的人类粪便DNA；
1.往离心管加100μL Buffer BCB(50mM EDTA、50mM Tris及4M亚硫酸氢钠)；
2.再往离心管加入20μL Buffer DPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM对苯二酚)，混匀后瞬离；
3.将离心管放在扩增仪器上转化；
4.完成转化后，加入300μL Buffer DBB(50mM EDTA、50mM Tris及4.5M异硫氰酸胍)和250μL无水乙醇，充分振荡混匀；
5.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
6.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
7.加入700μL Buffer BDD(50mM Tris，50mM EDTA，50mM NaOH，90％乙醇)于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
8.加入700μL Buffer DW1(50mM Tris，50mM EDTA，2M异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
9.加入700μL Buffer DW2(50mM Tris，0.8M NaCl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
10.换用新的收集管，12000g离心2min；
11.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
12.滴加50μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；
13. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。
实施例3
根据本发明，共提取转化6例粪便样本，提取转化步骤如下：
1.取6mL Buffer SPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM NaCl、30％无水乙醇)至离心管中，再取1g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2.先加入500μL Buffer SLS(50mM EDTA、50mM Tris、20％SDS)，颠倒混匀，再加入50μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅70℃水浴10min；
3.将离心管转至室温水浴3min，10000g离心1min；
4.取5mL上清于新的离心管中，加入1mL Buffer SDL(50mM EDTA、50mM Tris、2％PVP10和1M醋酸钠)上下颠倒混匀，10000g离心2min；
5.取全部上清于新的离心管中，再加3mL异丙醇，上下颠倒混匀，12000g离心10min，弃上清；
6.往离心管加入250μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)，涡旋混匀至沉淀散开；
7. 12000g离心2min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加500μL Buffer BCB；
8.再往离心管加入50μL Buffer DPB(50mM EDTA、50mM Tris、100mM对苯二酚)，混匀后瞬离；
9.将离心管放在扩增仪器上转化；
10.完成转化后，加入600μL Buffer DBB(50mM EDTA、50mM Tris及4.5M异硫氰酸胍)和600μL无水乙醇，充分振荡混匀；
11.将混合液体加到纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
12.将剩余液体全部转移至纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
13.加入700μL Buffer BDD(50mM Tris，50mM EDTA，50mM NaOH，90％乙醇)于纯化柱中，室温静置15min，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
14.加入700μL Buffer DW1(50mM Tris，50mM EDTA，2M异硫氰酸胍，50％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
15.加入700μL Buffer DW2(50mM Tris，0.8M NaCl，80％乙醇)于纯化柱中，12000g离心30s，倒去收集管中液体；
16.换用新的收集管，12000g离心2min；
17.丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
18.滴加50μL Buffer DTE(20mM Tris，10mM EDTA)于纯化柱膜上，60℃孵育2min；
19. 12000g离心2min，得到转化后的人类粪便DNA。
利用ThermoScientific公司生产的NanoDrop2000测定以上3个实施例所获DNA的浓度。利用标准差分析3个实施例所获DNA浓度和荧光PCR Ct值，并作图。
用未转化荧光PCR体系检测提取效果，用转化后荧光PCR体系检测转化效果。采用以下扩增程序：95℃预变性5min；95℃变性10s，60℃变性20s，72℃延伸20s，15个循环；95℃变性10s，60℃变性20s，收集荧光信号，72℃延伸20s，35个循环。
图1～2为人类粪便DNA提取浓度和未转化荧光PCR Ct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取方法，白色填充柱表示Qiagen提取方法；图3～4为人类粪便DNA转化后DNA浓度和荧光PCR Ct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的转化方法，白色填充柱表示Qiagen转化方法；图5～6为人类粪便DNA提取转化后DNA浓度和荧光PCR Ct值比较图，黑色填充柱表示的是本发明的提取转化方法。

Claims (10)

1.一种大量提取粪便DNA的方法，包括以下步骤：
1)取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2)先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mMTris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；
3)将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；
4)取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；
5)取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；
6)往离心管加入100～800μL Buffer DTE，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA，涡旋混匀至沉淀散开；
7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管；
8)加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及4～6M胍盐，胍盐包括异硫氰酸胍或盐酸胍中的至少一种，充分振荡混匀；
9)将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
10)将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
11)加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM的EDTA，2～5M异硫氰酸胍以及40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
12)加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M的NaCl以及70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
13)换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
14)丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
15)滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
16)10000～14000g离心1～5min，得到粪便DNA。
2.如权利要求1所述的一种大量提取粪便DNA的方法，其特征在于，步骤5)所述的有机溶剂包括异丙醇或乙醇。
3.一种大量转化粪便DNA的方法，包括以下步骤：
1)往离心管中加入10～200μL内含1ng～5μg待转化的粪便DNA；
2)再加100～800μL Buffer BCB，所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mMTris及0.5～5M亚硫酸盐，溶液pH4.0～7.0；
3)再往离心管加入10～300μL Buffer DPB，所述Buffer DPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚，混匀后瞬离；
4)将离心管放在扩增仪器上转化；
5)完成转化后，加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍，充分振荡混匀；
6)将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
7)将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体；
8)加入500～750μL Buffer BDD于纯化柱中，所述Buffer BDD包括20～400mM Tris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
9)加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
10)加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
11)换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
12)丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
13)滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
14)10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便DNA。
4.如权利要求3所述的一种大量转化粪便DNA的方法，其特征在于，步骤4)转化程序如下：95℃加热5min、60℃加热30min。
5.如权利要求3所述的一种大量转化粪便DNA的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢铵中的至少一种。
6.一种大量提取转化粪便DNA的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
1)取5～35mL Buffer SPB至离心管中，所述Buffer SPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、50～500mM NaCl、10～70％无水乙醇，再取1～5g粪便样本至管中，充分振荡混匀；
2)先加入50～1000μL Buffer SLS，所述Buffer SLS包括10～500mM EDTA、10～500mMTris、10～20％SDS，颠倒混匀，再加入50～500μL蛋白酶K，颠倒混匀后置恒温水浴锅56～75℃水浴5～30min；
3)将离心管转至室温水浴1～5min，8000～12000g离心1～3min；
4)取2～6mL上清于新的离心管中，加入1～2mL Buffer SDL，所述Buffer SDL包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、0.5～5％PVP10和0.5～3.5M醋酸钠，上下颠倒混匀，8000～12000g离心1～3min；
5)取全部上清于新的离心管中，再加2～5mL有机溶剂，上下颠倒混匀，10000～14000g离心5～15min，弃上清；
6)往离心管加入100～800μL Buffer DTE，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM的EDTA，涡旋混匀至沉淀散开；
7)10000～14000g离心1～5min，吸取全部液体至离心管，再往离心管加100～800μLBuffer BCB，所述Buffer BCB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及0.5～5M亚硫酸盐；
8)再往离心管加入10～300μL Buffer DPB，所述Buffer DPB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris、20～1000mM对苯二酚，混匀后瞬离；
9)将离心管放在扩增仪器上转化；
10)完成转化后，加入200～800μL Buffer DBB和300～700μL无水乙醇，充分振荡混匀；所述Buffer DBB包括10～500mM EDTA、10～500mM Tris及3～5.5M异硫氰酸胍；
11)将混合液体加到纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
12)将剩余液体全部转移至纯化柱中，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
13)加入500～750μL Buffer BDD于纯化柱中，所述Buffer BDD包括20～400mM Tris，20～500mM EDTA，20～500mM NaOH，60～100％乙醇，室温静置5～20min，10000～14000g离心30～60s，倒去收集管中液体；
14)加入500～750μL Buffer DW1于纯化柱中，所述Buffer DW1包括150～400mM Tris，40～100mM EDTA，2～5M异硫氰酸胍，40～70％乙醇，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，
15)加入500～750μL Buffer DW2于纯化柱中，10000～14000g离心10～60s，倒去收集管中液体，所述Buffer DW2包括300～700mM Tris，0.8～1.2M NaCl，70～90％乙醇；
16)换用新的收集管，10000～14000g离心1～5min；
17)丢弃收集管，将纯化柱放置于新的离心管中；
18)滴加30～200μL Buffer DTE于纯化柱膜上，所述Buffer DTE包括10～20mM Tris，5～10mM EDTA，50～70℃孵育1～5min；
19)10000～14000g离心1～5min，得到转化后的粪便DNA。
7.根据权利要求6所述的一种大量提取转化粪便DNA的方法，其特征在于，步骤9)转化程序如下：95℃加热5min、60℃加热30min。
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述亚硫酸盐包括亚硫酸钠、亚硫酸氢钠、亚硫酸氢镁、焦亚硫酸钠和亚硫酸氢铵中的至少一种。
9.如权利要求1至8任一项所述的方法，其特征在于，所述的粪便包括人类粪便或动物粪便。
10.用于大量提取和转化粪便DNA的组合物，按体积比包括：
1)5-35mL Buffer SPB；
2)50～1000μL Buffer SLS；
3)1-2mL Buffer SDL；
4)100-800μL Buffer DTE；
5)100-800μL Buffer BCB；
6)10-300μL Buffer DPB；
7)20-800μL Buffer DBB；
8)500～750μL Buffer BDD；
9)500～750μL Buffer DW1；
10)500～750μL Buffer DW2；
11)30～200μL Buffer DTE。
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