CN105274202A - 一种肝癌诊断剂 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。该试剂为一种长链非编码RNA(long？non-coding？RNA，lncRNA)H19和两种微小RNA(microRNA,miRNA)miR-21和miR-222的检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。以唾液作为检测样本的检测肝癌的试剂盒含有蛋白酶和H19、miR-21和miR-222检测试剂。本发明首次在唾液中寻找到诊断肝癌敏感特异的生物标志物，对肝癌的早诊早治，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。

Description

一种肝癌诊断剂
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种诊断肝癌的试剂及试剂盒。
背景技术
我国是肝癌大国，肝癌的发病率和死亡率都占了全球的一半以上。肝癌的准确诊断具有重要的现实意义。
现时，国际上通常用来筛查肝癌的生物标志物是血清AFP(甲胎蛋白)。但其敏感性只有39％至65％，特异性只有76％至94％。由于其检测肝癌的敏感性跟特异性不甚理想，因此美国的治疗指南不推荐血清AFP用于肝癌的诊断。中国跟欧洲的治疗指南都指出，正常个体的AFP水平应小于20ng/ml，大于400ng/ml则可提示肝癌的诊断。而20至400ng/ml则是诊断的“灰色地带”。因此利用AFP筛查肝癌容易导致误诊漏诊。
除了血液取样方式，另一种诊断方式是组织取样诊断。然而，肝组织取样对人体破坏性强，因此，亟须一种没有创伤式而准确的诊断方法。
人体唾液腺中存在许多毛细血管网，因此，唾液是血液循环的末端产物。血液中存在的分子物质，例如DNA、RNA、蛋白、药物、病毒等，都能在唾液中找到。因而唾液被认为是人体健康状态的一面镜子，能反映出机体的各种内环境状态，例如癌症、感染、系统性疾病等。美国的食品及药物管理局(FDA)已经批准了利用唾液检测药物滥用、HIV感染、激素水平、中毒等试剂在市场上应用，现已在全美都已经得到普及。在临床中，于唾液中寻找分子标记物是最理想的方法，因为收集唾液存在简单、方便、无创、经济、不会引起患者不安、操作者易于掌握等优点。研究已经证实了唾液中的转录物、蛋白、代谢物和其他分子物质能检测出口腔癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、干燥综合征等其他口腔或者系统性疾病。体内的长链非编码RNA(lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)与包括肝癌在内的多种癌症的发病与发展密切相关。研究发现多种lncRNA和miRNA在肝癌组织中表达失调，组织中表达失调的lncRNA和miRNA可作为生物标记物对肝癌有较佳的诊断价值。但唾液lncRNA和miRNA是否可作为生物标记物协助诊断肝癌，目前尚无报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种用于诊断肝癌的唾液检测试剂和试剂盒。
本发明同时提供了试剂盒的使用方法。
本发明还提供以唾液作为检测样本的方法。
发明首先提供了用于诊断肝癌的唾液检测试剂，该试剂为H19、miR-21和miR-222检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。
发明同时提供了H19、miR-21和miR-222唾液检测试剂在制备检测肝癌试剂或试剂盒中的应用。
以唾液作为样本来进行肝癌标记物的检测，最大的难点在于，需要寻找到能分泌到唾液中的，且在唾液中能稳定存在的标记物。尽管目前已有大批的肝癌标记物被发现，这些标记物存在于组织样品或血液样品中，然而，同样的标记物采用唾液样本取样，往往是另一个结果，不能用作肝癌诊断。这很可能是因为能被分泌到唾液中的标记物本身就很少，并且唾液中存在大量的酶，标记物容易降解。因此，以唾液样本检测肝癌，在此前仍未见任何报道。
而本发明的一大突破在于，发明人发现，在肝癌患者中其唾液样本存在大量的H19、miR-21和miR-222。其稳定而大量地存在，能被高重现性地检出。而正常样本中，该标记物表达水平非常低。这使得H19、miR-21和miR-222成为一种良好的唾液样本标记物，对于肝癌的检测或诊断具有突破性的意义。
本发明进一步提供给了用于诊断肝癌的唾液检测试剂盒，其含有蛋白酶和H19、miR-21和miR-222检测试剂。
1.上述的H19、miR-21和miR-222检测试剂含有检测用引物，所述引物的序列如H19为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；miR-21为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；miR-222为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
作为可选的实施方式所述的蛋白酶选自蛋白酶K。
优选地，所述的试剂盒还含有酸酚氯仿混合物。并且进一步优选地，还可含有DEPC(焦碳酸二乙酯)。
可选地，所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚-氯仿混合物；优选地；苯酚与氯仿的体积比为(4.5-5.5):1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7。
发明还提供给了一种检测唾液H19、miR-21和miR-222的方法，包括以下步骤：提取唾液中总RNA后，进行H19、miR-21和miR-222的逆转录，再通过qPCR(定量聚合酶链反应)分别检测H19、miR-21和miR-222水平。
提取唾液总RNA的方法可采用以下步骤：
S1.取唾液样本，加入蛋白酶，60-65℃孵育以去除唾液蛋白；
S2.加入酸酚氯仿混合物后，10000-12000g离心4-6分钟，收集上清；
S3.加入1.25倍体积的乙醇，再经5000-6000g离心20-60秒过滤离心，弃滤液；
S4.加入预热的DEPC水，10000-12000g离心20-60秒，收集RNA。
本发明首次在唾液中寻找到诊断肝癌敏感特异的生物标记物——H19、miR-21和miR-222。
通过统计学分析，建立logistic回归预测诊断肝癌的模型，再构建ROC曲线可得出联合唾液miR-21、miR-222和H19三种分子物质对肝癌诊断的价值。预测模型的公式为：logit＝-2.153+miR-21×0.018+miR-222×0.174+H19×0.174。即，将检测到的miR-21，miR-222和H19的表达量代入上述公式，我们前期研究得出正常个体的值应小于3.939813。若受检个体检测到的miR-21，miR-222和H19的表达量代入模型公式后结果大于此值，则受检个体判定为肝癌的敏感性为81.4％，特异性为91.8％.
唾液H19、miR-21和miR-222在成为协助筛查乙肝相关性肝癌的标志物方面具有良好的前景，收集唾液的取样方式简单、方便、无创、价廉、不会引起患者不安、操作者易于掌握、受检者易于接受，且准确率高，对肝癌的早诊早治，降低死亡率，减轻我国的医疗负担具有重大的意义。
附图说明
图1为不同肝组织样本中的H19(图1A)、miR-21(图1B)、和miR-222(图1C)表达水平。
图2为不同人群唾液样本中的H19(图2A、B)、miR-21(图2C、D)、和miR-222(图2E、F)表达水平。
图3为联合唾液H19、miR-21和miR-222检测结果的ROC(ReceiverOperatingCharacteristic)曲线。
图4为肝癌患者的血清AFP水平。
图5为不同AFP表达水平患者的唾液H19(图5A)、miR-21(图5B)、和miR-222(图5C)检出水平。
图6为H19(图6A)、miR-21(图6B)和miR-222(图6C)的qPCR扩增曲线(图6A),和H19(图6D)、miR-21(图6E)、和miR-222(图6F)的溶解曲线。
图7为MALAT1(图7A)和miR-224(图7B)的肝组织样本检测结果。
图8为MALAT1(图8A)和miR-224(图8B)的唾液样本检测结果。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
实施例1唾液采集
在唾液采集前，研究个体需禁食、禁饮、禁烟和禁止口腔清洁2h以上。
为增加唾液收集量，采用2％柠檬酸溶液湿润无菌棉签棉花头，然后将棉花头放于研究个体舌头一侧的后侧壁约5s，吐出唾液后，再将棉签放到另一侧的舌头后侧壁。如此反复收集。唾液收集量需达5ml以上，收集管使用50ml无菌无酶离心管。4℃、3000g离心15min取上层上清至1.5mlEppendoff管，再以4℃、12000g离心10min后再弃沉淀取上清。标本处理后均置-80℃保存。
实施例2唾液总RNA的提取
1.将1ml唾液平均分装在两支1.5ml的无酶EP管上，即每支EP管都盛有500μl的唾液，然后向每只EP管加入蛋白酶K(20mg/ml)15μl，混匀，放于65℃水浴锅孵育过夜。因为唾液中含有较多的消化酶类等蛋白，影响后续提取唾液RNA的效果，因此此法可去除唾液蛋白对实验的影响。
2.两支EP管各加0.5ml的酸酚氯仿混合物(主要成分为盐酸、苯酚与氯仿)到上述唾液混合液中。
酸酚氯仿的配置
2.1苯酚与氯仿的比例为：5:1
2.2用浓盐酸调pH值，pH值定在4.5左右，此pH值最利于提取RNA。混匀。
3.加入后手动摇匀30到60秒
4.室温下10000g离心5分钟。离心后中层液体需紧致，否则重新离心。
5.收集上清，需谨慎，不能搅动下层液相。
6.将1.25倍体积的100％乙醇加到上清液中。例如收集到500μl上清，则加625μl无水乙醇。
7.将过滤管放入收集管内，将上述混合物加到过滤管中(过滤管和收集管市场上有销售)。
8.6000g离心30秒。
9.丢弃过滤液。重复空甩离心1次。保留收集管。
10.将700μl的75％乙醇加到过滤管中，离心15秒。丢弃过滤液。将过滤管重新放入原来的收集管中。
11.重复第10步，再洗涤一次。
12.丢弃过滤液，将过滤管放入同样的收集管中。空甩离心1分钟。
13.将过滤管放入新的收集管中。加入95℃预热DEPC水。盖好盖子。离心30秒。收集RNA。
14.收集洗脱液。洗脱液即溶解有从唾液中提取的总RNA。提取后的总RNA在-80℃以下保存。
实施例3唾液H19、miR-21和miR-222逆转录及表达量检测
1.唾液H19的逆转录反应
取2μLRNA进行反转录。65℃反应5min后立即冰浴2min。
在上述2μLRNA中分别加入2μl5×RTBuffer、0.5μlEnzymeMix、0.5μlPrimerMix(均为Toyobo公司产品，货号FSK-100)和5μl经DEPC处理的无核酸酶水，然后继续进行逆转录，反应条件为37℃15min,98℃5min,4℃∞。
2.唾液miR-21和miR-222的逆转录反应
取2μLRNA进行反转录。每2μL的RNA中加入2μL的RTPrimer[锐博公司，货号为miRQ0000076-1-2(miR-21)或miRQ0004569-1-2(miR-222)]和7μL的无核酸酶水。70℃反应10min后立即冰浴2min。在上述11μL混合物中分别加入5μLRTbuffer(TAKARA公司，货号2641A)、2μLdNTP(TAKARA公司,2.5mM规格，货号DR001B)、0.5μLRNaseinhibitor(TAKARA公司，40U/μL规格，货号2313A)、0.5μLRT酶(TAKARA公司，200U/μL规格，货号2641A)、6μLddH2O，然后继续进行反转录，反应条件为42℃60min,70℃10min,4℃∞。
3.唾液H19、miR-21和miR-222的表达量检测(qPCR反应)
取逆转录产物3μL作为模板,用SYBRPremixExTaqⅡ试剂盒(TaKaRa公司，货号RB820A)进行RT-qPCR检测,20μL反应体系中加入9μL的5×SYBRPremixBuffer，0.8μL的上游引物，0.8μL的下游引物,和6.4μL经DEPC处理的无酶水。
H19的上游引物序列SEQIDNO.1:TGCTGCACTTTACAACCACTG
H19的下游引物序列SEQIDNO.2:ATGGTGTCTTTGATGTTGGGC
miR-21的上游引物序列
SEQIDNO.3：CGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-21的下游引物序列
SEQIDNO.4：CGGTAGCTTATCAGACTGATGTTGA
miR-222的上游引物序列
SEQIDNO.5:ACTTGCCCTCCTTTCCTTTC
miR-222的下游引物序列
SEQIDNO.6:AGGTGTTTCCGACGCATTAC
所有反应采用3复孔,反应条件为95℃2min,然后95℃5s,60℃10s,50个循环。溶解曲线设置：Meltcurve:65.0to95.0℃,increment0.5℃for0.05min+plateread。采用ABI7500实时定量PCR仪进行检测。
实施例4提取及检测方法鉴定
在以唾液为实验样本，经过上述总RNA提取、反转录、qPCR反应后，分别对H19、miR-21和miR-222进行扩增曲线及溶解曲线分析。
得出H19、miR-21和miR-222的qPCR扩增曲线和溶解曲线如图6。结果表明经上述方法检测唾液H19、miR-21和miR-222，能成功地扩增并检测出特定的唾液H19、miR-21和miR-222的表达水平，且溶解曲线成单一高峰状态，表明扩增和检测的H19、miR-21和miR-222具有专一特异性，无非特异性扩增。
实施例5肝组织中的miR-222表达水平检测
挑选50例乙肝相关肝癌组织样本和50例癌旁正常肝组织样本，15例正常肝组织(从手术切除的离肝血管瘤＞5cm的肝组织中选取)，使用TRIzol法提取其组织内的RNA并检测H19、miR-21和miR-222在各种组织中的表达水平。具体提取方法如以下文献所示：
BurchardJ,ZhangC,LiuAM,etal.microRNA-122asaregulatorofmitochondrialmetabolicgenenetworkinhepatocellularcarcinoma.MolSystBiol2010；6:402.
结果如图1所示，H19、miR-21和miR-222在癌组织中的表达水平均比在癌旁或正常肝组织的表达水平都显著增高。
实施例6唾液样本中的H19、miR-21和miR-222表达水平检测
收集健康对照个体、乙肝携带者、慢性活动性乙肝患者、乙肝相关性肝硬化患者、晚期乙肝相关性肝癌(HCC)患者、可切除乙肝相关性肝癌患者的术前和术后的唾液各50例共350例样本。
检测唾液H19、miR-21和miR-222在各组中的表达水平与差异性。唾液处理及检测方法如实施例3。
结果如图2所示。唾液中的H19、miR-21和miR-222在肝癌患者中的表达水平都均显著高于其它对照组。
通过统计学分析，建立logistic回归预测诊断肝癌的模型，再构建ROC曲线可得出联合唾液miR-21、miR-222和H19三种分子物质对肝癌诊断的价值。联合三者对肝癌诊断的敏感性为81.4％，特异性为91.8％，ROC的曲线下面积(AreaUnderCurve，AUC)为0.9249。AUC值越大，表示对疾病的诊断价值越大。三者联合的AUC值也大于miR-21(0.8378)、miR-222(0.8485)和H19(0.8392)单独对肝癌诊断AUC。或两两组合的AUC值(miR-21+miR-222为0.8723；miR-21+H19为0.8631；miR222+H19为0.8714)。因此，三者联合诊断肝癌的价值大于三者分别单独或两两组合对肝癌的诊断。
作为对比实验，发明人还检测了所收集的肝癌患者的血清AFP水平。在我们收集的肝癌患者中，只有20％的个体的血清AFP水平达到肝癌的诊断水平，约50％的个体处于正常水平。结果如图4所示。
发明人进一步分析了不同AFP表达水平患者的唾液H19、miR-21和miR-222检出水平，结果如图5所示。无论肝癌患者血清的AFP表达水平如何，唾液H19、miR-21和miR-222均能检测出肝癌。它们在肝癌患者的唾液中都出现显著性高表达。唾液H19、miR-21和miR-222均比血清AFP对肝癌更具有诊断价值。
对比例其他现有肝癌标记物的唾液样本检测结果
根据先前的研究报道，lncRNA中的MALAT1和miRNA中的miR-224在肝癌的癌组织中也表达上调。本发明同时对它进行了研究。
组织中的表达水平研究：
挑选50例乙肝相关肝癌组织样本和50例癌旁正常肝组织样本，15例正常肝组织(从手术切除的离肝血管瘤＞5cm的肝组织中选取)，提取其总RNA并检测MALAT1和miR-224在各种组织中的表达水平。
结果如图7所示。结果显示，在肝组织中个，MALAT1和miR-224在癌组织中的表达水平比在癌旁或正常肝组织的表达水平都显著增高。
唾液中的表达水平研究：
收集健康对照个体、乙肝携带者、慢性活动性乙肝患者、乙肝相关性肝硬化患者、晚期乙肝相关性肝癌(HCC)患者、可切除乙肝相关性肝癌患者的术前和术后的唾液各50例共350例样本。检测唾液MALAT1和miR-224在各组中的表达水平与差异性。
结果如图8所示。结果显示，唾液MALAT1和miR-224在肝癌患者及健康对照组中的表达均没有显著性差异，不能作为唾液取样的标记物。

Claims (9)

1.用于诊断肝癌的唾液检测试剂，其特征在于该试剂为H19、miR-21和miR-222检测试剂，该试剂的检测对象为唾液样本。
2.唾液H19、miR-21和miR-222检测试剂在制备检测肝癌试剂或试剂盒中的应用。
3.用于诊断肝癌的唾液检测试剂盒，其特征在于含有蛋白酶和H19、miR-21和miR-222检测试剂。
4.如权利要求1或2或3所述的试剂或应用或试剂盒，其特征在于所述H19、miR-21和miR-222检测试剂含有检测用引物，所述引物的序列如H19为SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；miR-21为SEQIDNO.3和SEQIDNO.4；miR-222为SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述的蛋白酶为蛋白酶K。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还含有酸酚氯仿混合物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述的酸酚氯仿混合物为盐酸-苯酚
-氯仿混合物；优选地；苯酚与氯仿的体积比为(4.5-5.5):1；更优选地，所述的酸酚氯仿混合物pH值为4.3-4.7。
8.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于还含有DEPC。
9.一种检测唾液H19、miR-21和miR-222的方法，其特征在于包括以下步骤：提取唾液中总RNA后，进行H19、miR-21和miR-222的逆转录，再通过qPCR反应分别检测H19、miR-21和miR-222水平。
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