CN106967813A - 一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒及其检测方法 - Google Patents

一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒及其检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，包含：1)收集外周血的EDTA‑K2抗凝管；2)预装Trizol的冻存管；3)外周血中总RNA提取试剂；4)检测miRNA‑141和U6基因表达的试剂；5)血液中miRNA‑141评分的计算公式：miRNA‑141分数＝miRNA‑141Ct值–U6Ct值。本发明提供的试剂盒有较高的重复稳定性，不需重复实验。利用本发明提供的miRNA‑141和U6扩增核酸序列，构建测定血液miRNA评分的诊断试剂盒，可达到无创诊断子宫内膜异位症的目的，将大大减少腹腔镜检测给病人带来的损伤，有利于子宫内膜异位症的早期治疗。

Description

一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒及其检测方法
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，尤其是涉及一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒及其检测方法。
背景技术
子宫内膜异位症(Endometriosis,EMs)，简称内异症，是一种常见的妇科疾病。该病在育龄妇女中的发病率约为10％，而在不育妇女中发病率则高达30-60％。其基本特征是在子宫被覆内膜及子宫肌层之外的其它部位出现具有生长功能的子宫内膜组织(腺体和间质)，临床上主要表现为慢性盆腔疼痛，性交痛和不孕1。子宫内膜异位虽然是一种良性妇科疾病，但具有增生，浸润，转移等恶性行为，恶变率为0.7-1％。异位内膜组织主要位于盆腔(如宫骶韧带、子宫直肠凹陷),其中卵巢是最常见的侵犯部位。
子宫内膜异位症目前存在有效的治疗方案，但缺乏简便高效的诊断方法。腹腔镜是子宫内膜异位症诊断的金标准，而目前我国妇科医学界尚未有统一、规范性的腹腔镜诊治标准出台。一般来说，镜下观察到典型的子宫内膜异位症病灶时，即可确诊。但研究表明，不同内异症成分参差不齐，形态多种多样，进展程度各不相同，同时也有其他病变导致的类似腹膜改变被误诊。据统计，腹腔镜检测的异位病灶仅半数得到病理学证实。同时因为是微创手术，临床医师和患者需要面对麻醉，手术，并发症以及费用等一系列问题。循环系统生物标志物的检测有创伤小，经济，简便快速等优势，是未来子宫内膜异位检测的一个发展方向。寻找高灵敏度，高特异性的子宫内膜异位症生物标志物，可以准确诊断病情并加以治疗，又可用于治疗后的进一步病情监控。这将有效改善目前子宫内膜异位症的诊疗现状，提高治疗效果，有着经济和社会双重效益。
循环系统中miRNA是一个丰富而有诊断潜力的生物标志物来源，也是目前子宫内膜异位症及其他疾病生物标记物研究的热点。基于基因芯片技术，对子宫内膜异位症患者血清中765个miRNA进行表达谱检测。研究发现，miR-200家族能够抑制肿瘤的转移侵袭，其主要机制是通过对ZEB蛋白的抑制作用，间接促进了该蛋白负调控的靶基因E-cadherin蛋白的表达2,3。E-cadherin蛋白与β-catenin组成复合物，介导钙依赖的胞间连接作用。这种胞间连接使上皮细胞间相互黏附，难以发生运动和迁移。上述研究表明miR-200家族与细胞的黏附作用过程密切相关。
目前临床开始尝试通过荧光定量PCR方法，测定外周血相关生物标志物，以早期检测子宫内膜异位症。这种定量检测的方法较其他方法有更高的敏感性和特异性。但目该方法检测过程中使用的检测试剂和扩增引物具有很大的随意性，造成检测效率和可靠性参差不齐。
发明内容
本发明解决的技术问题就是，提供一种从受试者血液中提取总RNA，并检测miRNA-141和U6基因的方法。通过测定miRNA-141和U6基因的Ct值的差值，计算miRNA-141评分，以达到早期诊断子宫内膜异位症，减少子宫内膜异位症腹腔镜手术，提高诊断的准确率的目的。
首先，本发明提供了一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，包含：
1)收集外周血的EDTA-K2抗凝管；
2)预装Trizol的冻存管；
3)外周血中总RNA提取试剂；
4)检测miRNA-141和U6基因表达的试剂；
5)血液中miRNA-141评分的计算公式：miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值。
其中，步骤4)检测miRNA-141和U6基因表达的试剂中miRNA-141和和U6基因的反转录引物和荧光定量PCR扩增引物，具体如下：
miRNA-141反转录引物：如SEQ ID NO:1所示；
用于扩增miRNA-141的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:2所示；
反向引物：如SEQ ID NO:3所示；
U6的反转录引物：如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增U6的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:4所示；
反向引物：如SEQ ID NO:5所示。
进一步地，本发明提供了所述试剂盒的检测方法，该方法包括步骤：血液采集、保存、总RNA提取、miRNA-141荧光定量PCR反应和结果分析。使用所述方法对人类血液总RNA进行特异性反转录反应和荧光定量PCR反应，通过反应Ct值测定miRNA-141和U6基因的表达水平。
优选的，该方法具体包括如下步骤：
1)采集外周静脉血于EDTA-K2抗凝管中；
2)分装于冻存管中，加入Trizol试剂；
3)用氯仿，异丙醇方法提取外周血总RNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；
4)反转录所述的miRNA-141和U6基因，经逆转录反应合成cDNA；
5)荧光定量PCR反应，测定miRNA-141和U6的Ct值，利用公式miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值，来判断子宫内膜异位症发病情况。
更进一步地，本发明提供了一种检测miRNA-141和U6基因的特异性引物在子宫内膜异位症诊断制剂中的应用，所述引物包括反转录引物和PCR引物，具体如下：
miRNA-141反转录引物：5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTAT
TCGCACTGGATACGAGGTAGA-3’如SEQ ID NO:1所示；
用于扩增miRNA-141的核苷酸扩增引物如下：
正向引物：5’-GCGCGGATTGTGACAGACCATT-3’，如SEQ ID NO:2所示；
反向引物：5’-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3’，如SEQ ID NO:3所示；
U6的反转录引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增U6的PCR引物如下：
正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，如SEQ ID NO:4所示；
反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，如SEQ ID NO:5所示。
优选的，所述诊断制剂包括基因水平的诊断制剂和蛋白水平的诊断制剂。
再进一步地，本发明提供了一种诊断子宫内膜异位症的生物标记物，所述生物标记物为miRNA-141基因的部分序列：GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAGGTAGAAATGGTCTGTCACAATGGCGCG如SEQID NO:6所示。
优选的，所述生物标记物在子宫内膜异位症检测、预后或联合诊断产品中的应用。
本发明的有益效果：
本发明提供的试剂盒有较高的重复稳定性，不需重复实验。利用本发明提供的miRNA-141和U6扩增核酸序列，构建测定血液miRNA评分的诊断试剂盒，可达到无创诊断子宫内膜异位症的目的，将大大减少腹腔镜检测给病人带来的损伤，有利于子宫内膜异位症的早期治疗。
具体实施方式
下文中将对本发明的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
实施例1：
一种人类血液中miRNA-141基因检测方法：
1.血液标本的采集和处理
首先通过抽取外周静脉血2mL到含EDTA-K2抗凝管中，30min内分装200μL到预装Trizol的冻存管，混匀后-80度保存。
2.总RNA提取
1)加入1mLTrizol，充分裂解细胞。
2)加入氯仿200μL，剧烈震荡15s，在室温放置3min后，于4℃12000r/min离心15分钟。
3)吸取上层水相至另一离心管中，加入1.5倍体积异丙醇混匀，室温放置10min后，于4℃12000r/min离心10min。
4)弃去上清，加入600μL 75％的乙醇，混匀。于4℃12000r/min离心5分钟。
5)弃去上清，加入800μL无水乙醇，混匀。于4℃12000r/min离心5分钟。
6)弃去上清，自然干燥，加入DEPC水完全溶解RNA沉淀。取4μL稀释50倍，紫外分光光度计测定A260、A280吸光值，RNA样品A260/A280应在1.8–2.0之间。
7)计算RNA含量，稀释RNA到0.5ug/μL，取2ug总RNA逆转录，其余样品－80℃保存。
3.逆转录(mRNA至cDNA)
(1)反应体系(10μL)：
(2)共10μL体系，反应参数：37℃15min，85℃5sec。所得cDNA于-20℃保存。
4.实时定量PCR
反应体系(20μL)：
miRNA-141荧光定量PCR扩增引物如下：
正向引物：5’-GCGCGG ATTGTGACAGACCATT-3’(SEQ ID NO:2)
反向引物：5’-TGCAGGGTCCGAGGTAT-3’(SEQ ID NO:3)
U6基因荧光定量PCR扩增引物如下：
正向引物：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’(SEQ ID NO:4)
反向引物：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’(SEQ ID NO:5)
按检测人份数配置各个样品miRNA-141的检测体系PCR反应液各XμL，每人份18μL分装：
X＝18μL反应液X(n份标本+1份阳性对照+1份阴性对照+1份空白对照)
n为检测标本数。
将4μL步骤(3)中获得的cDNA加入到检测体系PCR反应液中；对阳性对照实验而言，直接加4μL阳性对照品；对阴性对照实验而言，直接加4μL阴性对照品；对空白对照实验而言，加4μL生理盐水。
miRNA-141和U6扩增反应条件：每个基因扩增3个反应；95℃预变性30秒，PCR循环：95℃预变性5秒，60℃31秒，共40个循环，检测荧光信号；4℃保存。
判断结果：
反应结束后计算机显示样品扩增曲线，根据每个基因3个反应的Ct值计算每个样品的miRNA-141和U6基因扩增平均Ct值，然后根据公式计算miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值。
本方法诊断子宫内膜异位症的阈值为8.3，当miRNA-141评分高于或等于8.3时，结果判断为阳性，患者为子宫内膜异位症患者；当miRNA-141评分低于8.3时，结果判断为阴性，不支持患者为子宫内膜异位症患者。
另外，将miRNA-141荧光定量PCR引物扩增产物，送去测序，其序列如如SEQ ID NO:6所示。
实施例2：
用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，包含：
(1)收集保存外周血试剂盒，包括：EDTA抗凝管、冻存管、Trizol试剂；
(2)血液中总RNA提取试剂盒，包括：氯仿、异丙醇、75％的乙醇、无水乙醇、DEPC水；
(3)检测miRNA-141和U6基因表达的试剂盒，包括逆转录反应液、荧光PCR反应液。其中逆转录反应液包括10×逆转录Buffer、逆转录酶、dNTP、如SEQ ID NO:1,5所示的引物和DEPC水；荧光PCR反应液包括Premix Ex TaqTM II(2×)、如SEQ ID NO:2-5所示的引物和DEPC水；
(4)样品中血miRNA-141分数的计算公式：miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值。
当miRNA-141评分高于或等于8.3时，结果判断为阳性，患者为子宫内膜异位症患者；当miRNA-141评分低于8.3时，结果判断为阴性，不支持患者为子宫内膜异位症患者。
实施例3：
利用实施例2的试剂盒检测临床样本：
取送检妇科女性患者外周血样本，总计65例子宫内膜异位症患者，年龄22-49岁，平均为33.7岁；以18例无子宫内膜异位症的输卵管堵塞的患者作正常对照，年龄30-43岁，平均36.3岁。
按实施例1所述方法提取血液总RNA，并用荧光PCR方法检测血miRNA-141评分。每份样品重复3次，并同时做阳性，阴性，空白对照。根据评分结果进行判断。
子宫内膜异位症组miRNA-141评分为10.5±0.93、正常对照组为4.89±1.25。miRNA-141评分在2组之间有显著性差异，P＜0.01。
本试剂盒以miRNA-141评分8.3作为诊断子宫内膜异位症的临界值，65例子宫内膜异位症患者有56例阳性，9例阴性；18例非子宫内膜异位症患者有3例阳性，15例阴性。本试剂盒敏感性和特异性分别为86.1％和83.3％，本结果证明本试剂盒所检测miRNA-141评分可作为子宫内膜异位症的早期筛查指标。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
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序列表
<110> 上海润达榕嘉生物科技有限公司
<120> 一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒及其检测方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaggtaga 49
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gcgcggattg tgacagacca tt 22
<210> 3
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tgcagggtcc gaggtat 17
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
ctcgcttcgg cagcaca 17
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
aacgcttcac gaatttgcgt 20
<210> 6
<211> 71
<212> DNA
<213> miRNA-141
<400> 6
gtcgtatcca gtgcagggtc cgaggtattc gcactggata cgaggtagaa atggtctgtc 60
acaatggcgc g 71

Claims (9)

1.一种用于子宫内膜异位症诊断的试剂盒，其特征在于，包含：
1)收集外周血的EDTA-K2抗凝管；
2)预装Trizol的冻存管；
3)外周血中总RNA提取试剂；
4)检测miRNA-141和U6基因表达的试剂；
5)血液中miRNA-141评分的计算公式：miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值。
2.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，步骤4)检测miRNA-141和U6基因表达的试剂中miRNA-141和和U6基因的反转录引物和荧光定量PCR扩增引物，具体如下：
miRNA-141反转录引物：如SEQ ID NO:1所示；
用于扩增miRNA-141的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:2所示；
反向引物：如SEQ ID NO:3所示；
U6的反转录引物：如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增U6的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:4所示；
反向引物：如SEQ ID NO:5所示。
3.如权利要求1或2所述的试剂盒的检测方法：其特征在于，该方法包括步骤：血液采集、保存、总RNA提取、miRNA-141荧光定量PCR反应和结果分析。
4.如权利要求3所述的检测方法，其特征在于，具体包括如下步骤：
1)采集外周静脉血于EDTA-K2抗凝管中；
2)分装于冻存管中，加入Trizol试剂；
3)用氯仿，异丙醇方法提取外周血总RNA，经乙醇洗涤，弃上清后干燥、溶解并测定浓度；
4)反转录所述的miRNA-141和U6基因，经逆转录反应合成cDNA；
5)荧光定量PCR反应，测定miRNA-141和U6的Ct值，利用公式miRNA-141分数＝miRNA-141Ct值–U6Ct值，来判断子宫内膜异位症发病情况。
5.一种检测miRNA-141和U6基因的特异性引物，其特征在于，所述引物包括反转录引物和PCR引物，具体如下：
miRNA-141反转录引物：如SEQ ID NO:1所示；
用于扩增miRNA-141的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:2所示；
反向引物：如SEQ ID NO:3所示；
U6的反转录引物：如SEQ ID NO:5所示；
用于扩增U6的PCR引物如下：
正向引物：如SEQ ID NO:4所示；
反向引物：如SEQ ID NO:5所示。
6.如权利要求5所述的引物在子宫内膜异位辅助症诊断制剂中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诊断制剂包括基因水平的诊断制剂和蛋白水平的诊断制剂。
8.一种诊断子宫内膜异位症的生物标记物，其特征在于，所述生物标记物为miRNA-141基因的部分序列，如SEQ ID NO:6所示。
9.如权利要求8所述生物标记物在子宫内膜异位症检测、预后或联合诊断产品中的应用。
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