CN110004227A - 一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了TNF‑α的cfRNA作为生物标记物在制备鼻咽癌诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用。本发明研究发现TNF‑α的cfRNA在鼻咽癌患者和健康人中存在表达差异，可以作为鼻咽癌诊断和/或预后评估的参考依据，对提高患者生存率具有重要指导意义。本发明还提供了检测TNF‑α的cfRNA表达的产品在鼻咽癌诊断和/或预后评估中的应用以及一种鼻咽癌检测试剂盒。

Description

一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物。
背景技术
鼻咽癌是指发生于鼻咽腔顶部和侧壁的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一，发病率为耳鼻咽喉恶性肿瘤之首。鼻咽癌的发病部位隐蔽，早期症状不明显，难以早期发现，误诊误治率高。因此，对鼻咽癌进行筛查和诊断，尤其是创伤性、取材方便的体液检查，对进行早期治疗，提高患者生存率具有重要意义。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物。
第一方面，本发明提供了TNF-α的cfRNA作为生物标记物在制备鼻咽癌诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用。
可选的，所述TNF-α的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。进一步的，所述TNF-α的RNA序列如SEQ NO:2所示。
可选的，所述TNF-α的cfRNA包括体液中TNF-α的cfRNA。在本发明中，所述体液可以但不限于为血液、唾液、汗液、尿液等。进一步的，所述体液中TNF-α的cfRNA包括血液中TNF-α的cfRNA。具体的，可以但不限于为外周血，易于采集和检测。
在本发明中，cfRNA(cell free RNA，游离RNA)通过细胞主动分泌、凋亡和死亡等途径产生，其中细胞主动分泌的cfRNA较少，凋亡和死亡是细胞释放cfRNA的途径之一。发明人在鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物研究中发现，与健康人相比，鼻咽癌患者中TNF-α的cfRNA表达量上调，因此，对TNF-α的cfRNA检测可以很好的反映细胞的凋亡和死亡等状态，作为一种新型有效的鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物；即使现有技术中有关于TNF-α蛋白与鼻咽癌关系的研究报道，但目前还未有关于TNF-α的cfRNA与鼻咽癌关系的研究，而且cfRNA水平的表达量与其蛋白的表达量之间的关系仍未清楚，根据现有技术并不能得出TNF-α的cfRNA与鼻咽癌关系，因此，本发明相当于提供了关于TNF-α与鼻咽癌之间新的检测方向。与此同时，鼻咽癌的发病部位隐蔽，无法预测其发病部位，更不用说通过检测病变部位分析是否患有鼻咽癌，而发明人研究发现体液中TNF-α的cfRNA表达量在鼻咽癌患者和健康人群中存在显著差异，并且体液提取简单方便；因此，通过抽取体液，提取cfRNA，分析TNF-α基因的表达量，可以对鼻咽癌的诊断和/或预后评估提供重要的参考依据。在实际的临床诊断中，又可以结合现有的其他检测手段，提高鼻咽癌诊断的准确率，进一步提高患者的生存率。
综上，TNF-α的cfRNA作为生物标记物在制备鼻咽癌诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用具有重大意义。
第二方面，本发明提供了检测TNF-α的cfRNA表达的产品在鼻咽癌诊断和/或预后评估中的应用。
可选的，所述TNF-α的cfRNA包括体液中TNF-α的cfRNA。在本发明中，所述体液可以但不限于为血液、唾液、汗液、尿液等。进一步的，所述体液中TNF-α的cfRNA包括血液中TNF-α的cfRNA。具体的，可以但不限于为外周血，易于采集和检测。
可选的，所述TNF-α的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。进一步的，所述TNF-α的RNA序列如SEQ NO:2所示。
可选的，所述检测TNF-α的cfRNA表达的产品通过PCR、原位杂交、芯片检测的方法检测TNF-α的cfRNA的表达水平。进一步的，所述检测TNF-α的cfRNA表达的产品包括引物对和探针中的一种或两种。
具体的，所述引物对可以但不限于为F1:5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’，R1:5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’，和F2:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，R2:5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’中的至少一组。
具体的，所述探针的序列可以但不限于为如SEQ NO:3所示的序列。
在本发明中，所述引物对和所述探针的长度决定了其不能检测cfRNA中的miRNA，而是用于检测cfRNA中的mRNA。一般的，mRNA由DNA的一条链作为模板转录而来的、携带遗传信息的能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸，绝大多数mRNA位于细胞内，而极少数因细胞的凋亡和死亡游离至细胞外，因此，cfRNA中的mRNA即携带有遗传信息，又游离在细胞外，检测其中的TNF-α基因表达水平更能反映鼻咽癌情况。
第三方面，本发明提供了一种鼻咽癌检测试剂盒，包括与TNF-α的cfRNA特异性结合的检测物。
可选的，所述TNF-α的cfRNA包括体液中TNF-α的cfRNA。在本发明中，所述体液可以但不限于为血液、唾液、汗液、尿液等。进一步的，所述体液中TNF-α的cfRNA包括血液中TNF-α的cfRNA。具体的，可以但不限于为外周血，易于采集和检测。
可选的，所述TNF-α的氨基酸序列如SEQ NO:1所示。进一步的，所述TNF-α的RNA序列如SEQ NO:2所示。
可选的，所述检测物包括与所述TNF-α的cfRNA特异性结合的引物对和探针中的一种或两种。
可选的，所述引物对为F1:5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’，R1:5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’，和F2:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，R2:5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’中的至少一组。
可选的，所述探针的序列包括如SEQ NO:3所示的序列。具体的，所述探针通过原位杂交检测TNF-α的cfRNA表达量。
可选的，所述鼻咽癌检测试剂盒还包括cfRNA提取试剂。
可选的，所述TNF-α的cfRNA在鼻咽癌组织中表达上调。
使用本发明提供的鼻咽癌检测试剂盒检测TNF-α的cfRNA相对表达量，当TNF-α的cfRNA相对表达量为健康人群平均水平的6倍及以上，则可辅助诊断鼻咽癌。
本发明的有益效果：
本发明研究发现TNF-α的cfRNA在鼻咽癌患者和健康人中存在表达差异，将TNF-α的cfRNA作为生物标记物应用于制备鼻咽癌诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中、检测TNF-α的cfRNA表达的产品应用于鼻咽癌诊断和/或预后评估中，以及与TNF-α的cfRNA特异性结合的检测物制成鼻咽癌检测试剂盒，能够对鼻咽癌筛查和诊断提供重要的参考依据，提高患者生存率；同时，该操作简单，灵敏性好，特异性高。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的TNF-α的cfRNA在血液中的相对表达量结果图；
图2为本发明实施例2提供的TNF-α的cfRNA在血液中的相对表达量结果图；
图3为本发明实施例3提供的TNF-α的cfRNA在血液中的相对表达量结果图；
图4为本发明实施例4提供的TNF-α的cfRNA在血液中的相对表达量结果图。
具体实施方式
以下所述是本发明实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明实施例的保护范围。
实施例1
实验组：对鼻咽癌患者(9人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(10人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
将实验组和对照组进行以下实验：
(1)使用Quick-cfRNA Serum&Plasma试剂盒进行cfRNA提取。具体步骤为：全血在12000g条件下离心15min，去除细胞；等比加入含蛋白酶K的消化液，静置1h-2h去除蛋白；加入含乙醇的结合溶液，充分混合；使用试剂盒提供的抽滤管连接气动泵，在80KPa下抽滤；按试剂盒提供步骤洗脱，获得cfRNA。
(2)提取的cfRNA冻存后进行qPCR阵列分析。使用如下公式：△Ct＝Ct目的基因-Ct管家基因；△△Ct＝△Ct实验组-△Ct对照组；相对表达量＝2-△△Ct，计算基因表达。经筛选99个基因的cfRNA后得到多个备选标记物，经过分析如图1所示，TNF-α的cfRNA表达量在鼻咽癌患者和健康受试者中差异显著。
实施例2
实验组：对鼻咽癌患者(6人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(6人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
使用Quick-cfRNA Serum&Plasma试剂盒提取上述两组的cfRNA，再进行qPCR，采用引物对F1:5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’，R1:5’-GAGGACCTGGGAGTAGATGAG-3’，其中qPCR的反应条件为95℃10min，40个循环(95℃15s；60℃20s；72℃45s)。经检测和分析，结果如图2所示，可以看出在鼻咽癌患者和健康受试者中TNF-α的cfRNA表达存在显著差异，TNF-α基因在鼻咽癌患者中表达量高。
实施例3
实验组：对鼻咽癌患者(13人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(7人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
使用Quick-cfRNA Serum&Plasma试剂盒提取上述两组的cfRNA，再进行qPCR，采用引物对F2:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，R2:5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’，其中qPCR的反应条件为95℃10min，60个循环(95℃15s；60℃20s；72℃45s)。经检测和分析，结果如图3所示，可以看出在鼻咽癌患者和健康受试者中TNF-α的cfRNA表达存在显著差异，TNF-α基因在鼻咽癌患者中表达量高。
实施例4
实验组：对鼻咽癌患者(29人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
对照组：对健康受试者(7人)采集其外周血血浆10mL，置于采集管中。均匀摇动以充分混合抗凝剂和RNA酶抑制剂，采血后置于4℃备用。
使用Quick-cfRNA Serum&Plasma试剂盒提取上述两组的cfRNA，再进行qPCR，采用引物对F2:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，R2:5’-CGGGCCGATTGATCTCAGC-3’，其中qPCR的反应条件95℃10min，60个循环(95℃15s；60℃20s；72℃45s)。经检测和分析，结果如图4所示，可以看出在鼻咽癌患者和健康受试者中TNF-α的cfRNA表达存在显著差异，TNF-α基因在鼻咽癌患者中相对表达量为对照组平均水平的6倍及以上，可辅助诊断鼻咽癌。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 江苏省肿瘤医院
<120> 一种鼻咽癌诊断和/或预后评估的生物标记物
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 1
Met Ser Thr Glu Ser Met Ile Arg Asp Val Glu Leu Ala Glu Glu Ala
1 5 10 15
Leu Pro Lys Lys Thr Gly Gly Pro Gln Gly Ser Arg Arg Cys Leu Phe
20 25 30
Leu Ser Leu Phe Ser Phe Leu Ile Val Ala Gly Ala Thr Thr Leu Phe
35 40 45
Cys Leu Leu His Phe Gly Val Ile Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro
50 55 60
Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser
65 70 75 80
Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro
85 90 95
Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu
100 105 110
Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser
115 120 125
Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly
130 135 140
Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala
145 150 155 160
Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro
165 170 175
Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu
180 185 190
Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu
195 200 205
Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly
210 215 220
Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu
225 230
<210> 2
<211> 702
<212> RNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
augagcacug aaagcaugau ccgggacgug gagcuggccg aggaggcgcu ccccaagaag 60
acaggggggc cccagggcuc caggcggugc uuguuccuca gccucuucuc cuuccugauc 120
guggcaggcg ccaccacgcu cuucugccug cugcacuuug gagugaucgg cccccagagg 180
gaagaguucc ccagggaccu cucucuaauc agcccucugg cccaggcagu cagaucaucu 240
ucucgaaccc cgagugacaa gccuguagcc cauguuguag caaacccuca agcugagggg 300
cagcuccagu ggcugaaccg ccgggccaau gcccuccugg ccaauggcgu ggagcugaga 360
gauaaccagc ugguggugcc aucagagggc cuguaccuca ucuacuccca gguccucuuc 420
aagggccaag gcugccccuc cacccaugug cuccucaccc acaccaucag ccgcaucgcc 480
gucuccuacc agaccaaggu caaccuccuc ucugccauca agagccccug ccagagggag 540
accccagagg gggcugaggc caagcccugg uaugagccca ucuaucuggg aggggucuuc 600
cagcuggaga agggugaccg acucagcgcu gagaucaauc ggcccgacua ucucgacuuu 660
gccgagucug ggcaggucua cuuugggauc auugcccugu ga 702
<210> 3
<211> 500
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
ggccaaggct gcccctccac ccatgtgctc ctcacccaca ccatcagccg catcgccgtc 60
tcctaccaga ccaaggtcaa cctcctctct gccatcaaga gcccctgcca gagggagacc 120
ccagaggggg ctgaggccaa gccctggtat gagcccatct atctgggagg ggtcttccag 180
ctggagaagg gtgaccgact cagcgctgag atcaatcggc ccgactatct cgactttgcc 240
gagtctgggc aggtctactt tgggatcatt gccctgtgag gaggacgaac atccaacctt 300
cccaaacgcc tcccctgccc caatcccttt attaccccct ccttcagaca ccctcaacct 360
cttctggctc aaaaagagaa ttgggggctt agggtcggaa cccaagctta gaactttaag 420
caacaagacc accacttcga aacctgggat tcaggaatgt gtggcctgca cagtgaagtg 480
ctggcaacca ctaagaattc 500

Claims (10)

1.TNF-α的cfRNA作为生物标记物在制备鼻咽癌诊断和/或预后评估试剂、试剂盒或检测装置中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述TNF-α的cfRNA包括体液中TNF-α的cfRNA。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述体液中TNF-α的cfRNA包括血液中TNF-α的cfRNA。
4.检测TNF-α的cfRNA表达的产品在鼻咽癌诊断和/或预后评估中的应用。
5.一种鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，包括与TNF-α的cfRNA特异性结合的检测物。
6.如权利要求5所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，所述检测物包括与所述TNF-α的cfRNA特异性结合的引物对和探针中的一种或两种。
7.如权利要求6所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，所述引物对为F1:5’-CCTCTCTCTAATCAGCCCTCTG-3’，R1:5’-GAGGACCTGGGAGTAG ATGAG-3’，和F2:5’-GAGGCCAAGCCCTGGTATG-3’，R2:5’-CGGGCCGAT TGATCTCAGC-3’中的至少一组。
8.如权利要求5所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，所述TNF-α的氨基酸序列如SEQNO:1所示。
9.如权利要求8所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，所述TNF-α的RNA序列如SEQNO:2所示。
10.如权利要求5所述的鼻咽癌检测试剂盒，其特征在于，所述鼻咽癌检测试剂盒还包括cfRNA提取试剂。
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