CN109136373A - 一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疾病诊断预防技术领域，具体公开了一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用。本发明涉及lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用作为肺癌或肺癌转移诊断分子标记物的应用，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516在肺癌患者血清中特异性显著上调表达，因此能够作为肺癌或肺癌转移诊断的分子标记物。所述LINC00511和LINC00516联合用于诊断肺癌转移诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于制备早期诊断肺癌转移的试剂盒。

Description

一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用
技术领域
本发明涉及疾病诊断预防技术领域，具体地，涉及一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用。
背景技术
肺癌发病率和死亡率在我国长期居各恶性肿瘤的首位，其发病时间短、转移快、预后不理想，其5年生存率仅为15％。肺癌容易发生各个不同脏器的转移，如脑转移、骨转移、肝转移等，并引起相应的症状，对病人生存造成极大的影响。大量研究和资料表明，早期诊断和早期治疗是防治肺癌和降低其死亡率的最有效方法，但由于缺乏理想的早期诊断方法，肺癌的早期诊断率仅14％左右。现有的传统肿瘤标志物(如癌胚抗原)的灵敏度和特异性均不够高。目前简单的胸透和痰液细胞学化验只能对肺癌进行早期诊断且敏感性非常低，关于肺癌转移诊断方式还缺乏有效、方便的检测手段。因此，开发一种微创而又特异灵敏的肺癌转移诊断标记物显得尤为重要。
人体外周血的循环肿瘤细胞和肿瘤相关的DNA和RNA都可以被用作体外诊断。研究发现，来自血浆和血清中循环核酸相对比较稳定，一些肿瘤组织中会出现表达异常，且和肿瘤恶化有着密不可分的关系。lncRNA是一种长度大于200个核苷酸的RNA分子，没有编码蛋白质功能，部分可编辑一些肽类。lncRNA可通过表观遗传学、转录调控和转录后调控等多个层面调节细胞内基因的表达，参与机体各种生理病理过程。相关研究已发现lncRNA可与蛋白质、RNA或DNA形成复合物，调节肿瘤细胞的生长，与癌症转移密切相关。进入循环系统的lncRNA在正常条件下能被qRT-PCR检测到。
血液是最常见的临床检验材料，采集血液也是微小创伤性、无痛苦和极易于被人们接受的取材方法。因此，基于外周血筛选肺癌转移特异性lncRNA，并用作为分子标记物具有重要的检测诊断价值。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术对肺癌以及肺癌转移早期诊断的不足，提供lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用作为肺癌或肺癌转移诊断分子标记物的应用，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516在肺癌患者血清中特异性显著上调表达，能够作为肺癌或肺癌转移诊断的分子标记物。
本发明的另一目的在于提供所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一组检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的荧光定量PCR引物组和探针。
本发明的另一目的在于提供上述荧光定量PCR引物组和探针在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。
本发明的另一目的在于提供一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明人从肺癌患者的血液中分离和检测到肺癌转移特异性lncRNA LINC00511和LINC00516呈显著高表达，发现高表达LINC00511后肺腺癌细胞的侵袭能力显著增加；LINC00516的表达与肺癌的病理类型呈显著正相关。因此，lncRNA LINC00511和lncRNALINC00516可联合使用作为一种新型的肺癌转移血液分子诊断标记物，能显著提高诊断的准确性、敏感性和特异性。此外，该分子标记物还可作为肺癌转移治疗药物的新治疗靶点。
因此，本发明请求保护lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用作为肺癌或肺癌转移诊断分子标记物的应用，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～2所示。
本发明还请求保护lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～2所示。
一组检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的荧光定量PCR引物组和探针，包括LINC00511荧光探针，LINC00511扩增正向引物和反向引物，LINC00516荧光探针，LINC00516扩增正向引物和反向引物；核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:3～8所示。
优选地，所述荧光定量PCR引物组和探针还包括内参基因荧光探针、内参基因扩增正向引物和反向引物，核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:9～11所示。
优选地，所述探针的5’末端结合有荧光物质，3’末端结合有淬灭物质；所述荧光物质为FAM、HEX、CY5中的至少一种；所述淬灭物质为BHQ1、BHQ2、BHQ3中的至少一种。
更优选地，所述LINC00511荧光探针的5’末端结合有荧光物质FAM，3’末端结合有淬灭物质BHQ1；所述LINC00516荧光探针的5’末端结合有荧光物质HEX，3’末端结合有淬灭物质BHQ 3；所述内参基因荧光探针的5’末端结合有荧光物质CY5，3’末端结合有淬灭物质BHQ2。
本发明还请求保护上述荧光定量PCR引物组和探针在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。
本发明还请求保护一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，包含检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516表达量的试剂。
优选地，所述试剂盒包含上述荧光定量PCR引物组和探针。
优选地，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液；所述阳性对照液为LINC00511和LINC00516标准品；所述阴性对照液为无模板空白对照。
优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应体系包括cDNA模板、2×Taqman DNA聚合酶、荧光染料、dNTP、镁离子。
优选地，所述试剂盒的荧光定量PCR反应条件为：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。
上述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
S1.采集血液，提供血浆中的总RNA；
S2.将总RNA逆转录成cDNA；
S3.利用上述荧光定量PCR引物组和探针对步骤S2所得cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，测定样品的Ct值。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516在肺癌患者血清中特异性显著上调表达，能够作为肺癌或肺癌转移诊断的分子标记物。所述LINC00511和LINC00516联合用于诊断肺癌转移诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于制备早期诊断肺癌转移的试剂盒。本发明所提供的试剂盒检测快速方便、准确率高，可以实现肺癌或肺癌转移的早期诊断和预测，能广泛应用于医疗行业肺癌疾病的辅助诊断和治疗。
附图说明
图1为LINC00511和LINC00516联合诊断肺癌转移的ROC曲线。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1
一组检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的荧光定量PCR引物组和探针，包括LINC00511荧光探针，LINC00511扩增正向引物和反向引物，LINC00516荧光探针，LINC00516扩增正向引物和反向引物，内参基因荧光探针，内参基因扩增正向引物和反向引物；核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:3～11所示。
LINC00511荧光探针(SEQ ID NO:3)：
5’-FAM-CTCCAACAGCCCTAAGGTCCGA-BHQ1-3’
LINC00511-F(SEQ ID NO:4)：
5’-AATTCTTGTTTGCTCCATTATCTT-3’
LINC00511-R(SEQ ID NO:5)：
5’-AGTGTTCATTTTTTGCCCTTCC-3’
LINC00516荧光探针(SEQ ID NO:6)：
5’-HEX-CACAGTTCCACATGGCTGGGGA-BHQ3-3’
LINC00516-F(SEQ ID NO:7)：
5’-TTGCCAGAGTAACCTGTGATAC-3’
LINC00516-R(SEQ ID NO:8)：
5’-TGAGCCTGAGTTGTCCTGTG-3’
内参基因ACTB荧光探针(SEQ ID NO:9)：
5’-CY5-TGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCG-BHQ2-3’
ACTB-F(SEQ ID NO:10)：
5’-CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
ACTB-R(SEQ ID NO:11)：
5’-AGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
所述LINC00511荧光探针的5’末端结合有荧光物质FAM，3’末端结合有淬灭物质BHQ1；所述LINC00516荧光探针的5’末端结合有荧光物质HEX，3’末端结合有淬灭物质BHQ3；所述内参基因荧光探针的5’末端结合有荧光物质CY5，3’末端结合有淬灭物质BHQ2。
实施例2
利用实施例1所述检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的荧光定量PCR引物组和探针对待测样本进行检测。
本试验中使用的154例非小细胞肺癌患者血清标本均来自2017年6月至2017年9月间中山大学肿瘤医院门诊或住院患者，其中肺腺癌106例，肺鳞癌45例，大细胞肺癌3例。
检测步骤如下：
1、血清标本采集：血清收集于促凝管内，于4℃、1600×g离心10min，然后进一步于4℃、16000×g离心10min，收集血清，置于-80℃冻存待测。
2、提取血浆样本总RNA(TRIzol LS法)及RNA浓度的测定：
(1)样品均质化：每0.25mL样品加入0.75mLTRIzol LS试剂(TRIzol LS试剂与样品的体积比为3:1)；移液器上下吹匀几次，使样品均匀。注意：污染物质含量高的生物液体(如全血)应该先用无RNase水按1:1稀释。当样品少量或者样品体积<0.25mL，为方便提取RNA，需用无RNase水调整样品体积到0.25mL。
(2)相分离：①室温静置5min，以利于匀浆样品中核蛋白体完全分离。②每0.75mLTRIzol LS试剂加入0.2mL氯仿。盖紧离心管的盖子。③震荡仪上震荡30s，室温静置2～15min。④4℃，12000rpm离心15min。离心后，混合物分离为3层，上层是澄清的水相，中间层，下层是红色的酚-氯仿相。RNA存在于水相里。水相体积约为70％均质时使用的TRIzol LS试剂量。
(3)RNA沉淀：①水相转移到一个新管。每0.75mLTRIzol LS试剂加入0.5mL 100％异丙醇到水相。②混合异丙醇以从水相中沉淀RNA。上下颠倒10次，-20℃静置样品30min，以利于RNA沉淀。③4℃，12000rpm离心15min。注意：往往离心前RNA沉淀不可见，离心后在管侧面和底部形成一个凝胶样沉淀。
(4)RNA洗涤：①移走离心管里上清液，只留RNA沉淀。②每0.75mL TRIzol LS试剂加入1mL 75％乙醇洗涤RNA沉淀。涡旋震荡，混匀样品。③4℃，7500rpm离心5min，弃上清液。
(5)重悬RNA：①真空或者空气干燥RNA沉淀5～10min，不要用真空离心干燥机干燥RNA沉淀。②用无RNase水(20～50μL)重悬RNA沉淀，移液器上下轻轻吹溶液几次。③在55～60℃的水浴槽中孵育10～15min。④继续下游操作，或保存于-40或-80℃冰箱中。注意：不要让RNA沉淀干燥太彻底，否则RNA沉淀溶解度降低，会使A260/280<1.6。
(6)RNA定量：①酶标仪Nanodrop 1000：启动Nucleic Acid模块后，按照屏幕提示用2μL无RNA酶水清洗基座；选择RNA40模式，用2μL对照空白溶液Blank；加入2μL RNA溶液Measure。②微孔板定量系统：共有24个孔，最右侧一列的三个孔为空白对照，剩余21个孔可以加入RNA样品进行检测。加样完毕后盖上玻片，放入载板中，用DNA_RNA quantification程序读值。
(7)定量结果判读：纯RNA的A260/280＝2，在1.7～2之间为正常，(＜1.7时表明有蛋白质或酚污染；＞2.0时表明可能有异硫氰酸残存)。A230表示样品中存在一些污染物，如碳水化合物、盐(胍盐)等，较纯净的核酸A260/A230的比值大于2.0。
3、总RNA的逆转录
(1)用MMLV Reverse Transcriptase(Promega)逆转录，操作如下：
表1反应体系
组分 体积
Random Primer(10μM) 1μL
RNA template 1μg
RNase Free H<sub>2</sub>O 余量
总体系 13μL
置于PCR仪中，70℃5min，然后立即在冰上冷却5min。
(2)在上述反应体系中加入以下试剂进行逆转录反应：
表2逆转录反应体系
组分 体积
M-MLV 5 X Reaction Buffer 5μL
dNTP Mix(2.5mM) 5μL
M-MLV RT 1μL
RNase Inhibitor(40U/μL) 0.5μL
RNase-free H<sub>2</sub>O 0.5μL
步骤(1)反应体系 13μL
总体系 25μL
轻轻混匀后，置于PCR仪中，40℃60min；70℃5min。逆转录产物置于4℃短暂保存，或者进行后续操作。
4、实时定量PCR检测LINC00516的表达量
(1)实时定量PCR：实时定量PCR反应使用罗氏480 Probe Master实时荧光定量PCR系统，利用CFX96TMReal-Time PCR Detection Systems(C1000 Touch PCR仪，Bio-rad)进行操作。定量PCR的扩增产物长度以80bp～150bp最为合适(可以延长至300bp)。反应体系如下：
表3荧光定量PCR反应体系
组分 体积
cDNA模板 2μL
Taqman Mix(Roche 480 Probe Master) 10μL
Forward Primer 1μL
Reverse Primer 1μL
Probe 1μL
H<sub>2</sub>O(PCR grade) 5μL
总体系 20μL
反应条件：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。
(2)数据分析：本实验采用相对定量分析方法。每个样品做三个复孔，结果取三个复孔的平均CT值。△Ct＝目的lncRNA平均CT值-内参基因平均CT值；△△Ct＝△Ct转移-△Ct未转移；相对表达量＝log2^(-△△Ct)。本试剂盒采用U6为内参，计算LINC00516的相对表达量。数据用SPSS20.0软件进行分析，以目标lncRNA相对表达量为自变量，组别为因变量，建立肺癌早期转移诊断的Logistic回归模型，回归模型的拟合度采用似然比检验，回归参数估计值采用非参数检验法。根据ROC曲线及曲线下面积(AUC)评估目标lncRNA诊断的敏感性和特异性。
5、检测结果
(1)目标lncRNA在测试集样本中的表达水平
与肺癌非转移组比，肺癌转移组中血浆LINC00511和LINC00516的相对内参表达量均显著上调(P&lt;0.05)。
表4肺癌转移组相对于肺癌非转移组各lncRNA相对内参表达量的变化倍数
目标lncRNA 倍数 P值
LINC00511 2.78±0.12 0.000
LINC00516 2.70±0.16 0.001
(2)测试集目标lncRNA的ROC曲线分析
以测试集肺癌转移组和肺癌非转移组所有样本中LINC00511和LINC00516的相对内参表达量作为自变量(设X1＝LINC00511相对内参表达量，X2＝LINC00516相对内参表达量)，以组别作为应变量(肺癌转移组设为1，肺癌非转移组设为0)，对LINC00511和LINC00516在肺癌转移组和肺癌非转移组样本中的相对内参表达量进行二元Logistic回归，得到二元Logistic回归方程，再将各样本中LINC00511和LINC00516的相对内参表达量代入该二元Logistic回归方程，即可得到各个样本的回归值，以可能的回归值作为诊断点，计算灵敏度和特异性，据此绘制ROC曲线。得Logistic回归方程：Logit(P)＝-5.709+1.480X1+0.908X2。模型拟合参数如表5。
表5目标lncRNA联合诊断肺癌转移的Logistic模型拟合参数
自变量 系数 标准误 Wald检验 P值 OR值
LINC00511 1.480 0.307 23.211 0.000 4.392
LINC00516 0.908 0.173 27.538 0.000 2.479
截距 -5.709 1.014 31.713 0.000 0.003
ROC曲线如图1所示，ROC曲线下面积为0.961，最佳cutoff值为0.177(诊断阈值)，最佳cutoff值处灵敏度为90.5％，特异性为89.8％。ROC曲线下面积AUC作为诊断试验真实性评价的固有准确度指标己被普遍认可，完全无价值的诊断试验AUC为0.5，理想的诊断试验AUC为1。一般认为，AUC在0.5～0.7之间时诊断价值较低，在0.7～0.9之间时具有一定的诊断价值，在0.9以上时诊断价值较高。因此，LINC00511和LINC00516联合诊断肺癌转移具有较高诊断价值。
(3)验证集验证目标lncRNA联合诊断肺癌转移的准确性
在验证集中，基于二元逻辑回归方程(Logit P＝-5.709+1.480X1+0.908X2)将验证集所有样本中目标lncRNA的相对内参表达量作二元Logistic回归变换，计算出所有样本中目标lncRNA相对内参表达量的Logistic回归值。低于最佳cutoff值0.177(诊断阈值)的预测为肺癌非转移患者，高于最佳cutoff值0.177的预测为肺癌转移患者，最后计算出以血浆LINC00511和LINC00516表达水平诊断肺癌转移的准确率、灵敏度和特异性。LINC00511和LINC00516在验证集中联合诊断肺癌转移的性能如表6所示。
表6目标lncRNA在验证集中诊断肺癌转移的性能
由上表可以看出，在验证集中，血浆LINC00511和LINC00516联合用于诊断肺癌转移的准确度极高，达89.61％，154个样本仅有16个样本诊断错误。
上述实验表明，本发明提供的血浆LINC00511和LINC00516联合用于诊断肺癌转移诊断性能优异，准确度和灵敏度高，特异性强，可以用于制备早期诊断肺癌转移的诊断试剂盒。
实施例3
一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，包含检测lncRNA LINC00511和lncRNALINC00516的荧光定量PCR引物组和探针，包括LINC00511荧光探针，LINC00511扩增正向引物和反向引物，LINC00516荧光探针，LINC00516扩增正向引物和反向引物，内参基因荧光探针，内参基因扩增正向引物和反向引物；核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:3～11所示。
LINC00511荧光探针(SEQ ID NO:3)：
5’-FAM-CTCCAACAGCCCTAAGGTCCGA-BHQ1-3’
LINC00511-F(SEQ ID NO:4)：
5’-AATTCTTGTTTGCTCCATTATCTT-3’
LINC00511-R(SEQ ID NO:5)：
5’-AGTGTTCATTTTTTGCCCTTCC-3’
LINC00516荧光探针(SEQ ID NO:6)：
5’-HEX-CACAGTTCCACATGGCTGGGGA-BHQ3-3’
LINC00516-F(SEQ ID NO:7)：
5’-TTGCCAGAGTAACCTGTGATAC-3’
LINC00516-R(SEQ ID NO:8)：
5’-TGAGCCTGAGTTGTCCTGTG-3’
内参基因ACTB荧光探针(SEQ ID NO:9)：
5’-CY5-TGCCCTCCCCCATGCCATCCTGCG-BHQ2-3’
ACTB-F(SEQ ID NO:10)：
5’-CACCCACACTGTGCCCATCTACGA-3’
ACTB-R(SEQ ID NO:11)：
5’-AGCGGAACCGCTCATTGCCAATGG-3’
所述LINC00511荧光探针的5’末端结合有荧光物质FAM，3’末端结合有淬灭物质BHQ1；所述LINC00516荧光探针的5’末端结合有荧光物质HEX，3’末端结合有淬灭物质BHQ3；所述内参基因荧光探针的5’末端结合有荧光物质CY5，3’末端结合有淬灭物质BHQ2。
所述试剂盒还包括cDNA模板、2×Taqman DNA聚合酶、阳性对照液、阴性对照液、荧光染料、dNTP、镁离子以及其他盐离子等。
所述阳性对照液为LINC00511和LINC00516标准品；所述阴性对照液为无模板空白对照。
所述荧光定量PCR反应条件为：95℃15min；95℃15s，60℃45s，重复40个循环。
所述试剂盒的使用方法包括如下步骤：
S1.采集血液，提供血浆中的总RNA；
S2.将总RNA逆转录成cDNA；
S3.利用上述荧光定量PCR引物组和探针对步骤S2所得cDNA溶液进行荧光定量PCR检测，测定样品的Ct值。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
序列表
&lt;110&gt; 中山大学
&lt;120&gt; 一种用于早期诊断肺癌转移的lncRNA检测试剂盒及其应用
&lt;160&gt; 11
&lt;170&gt; SIPOSequenceListing 1.0
&lt;210&gt; 1
&lt;211&gt; 2189
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 1
agggcgcgca ggcggcgcgg gtgcgcggtg cggcgctggt atccagagga cgcggtcacc 60
gcctctggca tttgtcgttc tgcgcttctc cgcaaggacc ctctgttagg caggcgccca 120
ccgtaagcct cccgggcctt gtgaacctgc aaacccaagt ctgagagacg atccgccttc 180
agcgctttcc agcttggcag agaggctttc ccggcgggga tctttggttg gcgctggcga 240
tgcgcgggga agaaaggcga ggagcggcgt ccaggctggg tgatgtccca gcacgagtag 300
gcgggatgcg ctcgcttggt cctccgggcg cccggtccct gcccgcgtcg cgcgcccacc 360
cctggggacg agaaggcggc cgcctgagga cccccgcccg cgacctccgc gagtctggag 420
cgcagaggac agggtctggc tgctctttgg ccttggatgg aaagtgggga attgggtggg 480
gggctgcgga ccccttaacg tggattactt ggtgtgtatc agctgggctc agaagaccca 540
cgacctcttc tccatccgtg gattgatttg ttctgcttaa cagctgggtc gccaagctgg 600
aggtggaatc agaggtttct ggctgactcg gtgggtgctt tgaaccagga aaggacaaga 660
aagaggatgg gaaggactga tccacattcc caccaggaag tttagcagaa cccccgcgtg 720
ccacctggac cccttggaag gacctggctc aggctggacc acctcttgag aggcaggagc 780
tctggatttg atcaagaatt ctttgctgag catggtgcct catgcctata atcccaacac 840
tttgggaggc cagtgtggga ggatctcttg agcccaggag ttcaagacta gcctgggcaa 900
cacagagaga ccccatctct aaaataataa taataataaa ataaaaaatt agcagggcat 960
ggtggcatgt gcctgtagtc ccagctaccc aggaggctga ggcaagagga tggctggagc 1020
ctgggatgtt gaggctgcaa tgaactgtga ttaccccact gcactccagc ctgggcaaaa 1080
gagcgagaga ccctgtctca aataataata ataataataa tcttattttg gagaataaag 1140
agacctctgg atttgaggtg ccatttgggt agaaagaaaa gacgtttaca ccgagaaata 1200
gtctgtgttg ccctgaagga gcagagggat gcatcgctgg aggtgaccta cagttgaaga 1260
agactcatta tgacagacct tgtccttctt ccttgtggaa agtgtttcct ctgctgctac 1320
tgctcatgag actcttcccc ctccctgtcc cagggaacca aagggctttc taccacaccc 1380
tttcttgccc cccgcctccc atgtctgctg tgcctttgta ctcagcaatt cttgtttgct 1440
ccattatctt ccagccggat acagagtgaa tagttaacca cacttaggtc aaataggatc 1500
taaatttttg ttcctgctcc gtgtaaagag gccagtgttt gtgtgttgca agcagccttg 1560
gaatagtaac tcttctcatt tgtttgggat ctggccacca agttccagaa tgatacacgg 1620
atcagtgcag aagttcatca ggctctcgga ccttagggct gttggagaag gcttcagcag 1680
cagaactgat ggtgaaggct cgtgttctcc atcctcaact ttctttgctt cgatcataca 1740
caagaataca tttggaaggg caaaaaatga acactgtcgt tcattgcagc cgtgttttgt 1800
gacacagatg cacagtctgc tgtgaagacc ttctctcaag tggcatttgg gagtccatgc 1860
cagatcatgg tgcttcatga gagactgaca gctatcaggg gttgtggcac ttagtgagga 1920
ctctcctccc ccagtgtgtg ctgatgacac atacacacct gacaatagct tgagtcttct 1980
ctgttccttt tactctgtag ccaacataca catgatttaa aaccctttct aaatatctat 2040
catggttcat ccttgtccaa atgcagagtc agagctattt gtacttcatt attatttcca 2100
aggcgaatag ttggctttct ttttgcaaaa ataattaaag tttttgtatg ttgcagttgc 2160
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaa 2189
&lt;210&gt; 2
&lt;211&gt; 725
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 2
gccacgtgaa ggatgtgttt gcttcccctt ccaccatgat tgtaagtttc ctgaggcctc 60
cccagccatg tggaactgtg aattaaactt ctttcctgga gtgtgaaaat gaactaataa 120
actctgtgac ctcagagact ccctctcagt gaccctgttc tcaaatgtat gaagatgggt 180
gctcaaagat ctctctctaa acatggaaca gggcctgtct gaagacataa gtgattaact 240
tctaatctat aactaaggtc tgagtcctga agaccttcct ctggaggctg agtagttaat 300
ctagatgggt ccaggtgctg caggtaaaat acctcttttc tgacaagact aggactctta 360
catagactac catgaactaa aagaagcaca acattgccag agtaacctgt gatactgtct 420
tcatgcgaac ttggtatcct gtttccatcc cagccttcta taacccagta acatcttttt 480
tgaaaccagt gggtgagaaa gacacctggt caggaacgcg gaccacagga caactcaggc 540
tcacccacgg catcagacta aaggcaaaca aggactctgt ataaagtacc ggtggcatgt 600
gtattagtgg agatgcagcc tgtgctctgc agacagggag tcacacagac acttttctat 660
aatttcttaa gtgctttgaa tgttcaagta gaaagtctaa cattaaattt gattgaacaa 720
ttgta 725
&lt;210&gt; 3
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 3
ctccaacagc cctaaggtcc ga 22
&lt;210&gt; 4
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 4
aattcttgtt tgctccatta tctt 24
&lt;210&gt; 5
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 5
agtgttcatt ttttgccctt cc 22
&lt;210&gt; 6
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 6
cacagttcca catggctggg ga 22
&lt;210&gt; 7
&lt;211&gt; 22
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 7
ttgccagagt aacctgtgat ac 22
&lt;210&gt; 8
&lt;211&gt; 20
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 8
tgagcctgag ttgtcctgtg 20
&lt;210&gt; 9
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 9
tgccctcccc catgccatcc tgcg 24
&lt;210&gt; 10
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 10
cacccacact gtgcccatct acga 24
&lt;210&gt; 11
&lt;211&gt; 24
&lt;212&gt; DNA
&lt;213&gt; 人(human)
&lt;400&gt; 11
agcggaaccg ctcattgcca atgg 24

Claims (10)

1.lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用作为肺癌或肺癌转移诊断分子标记物的应用，其特征在于，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～2所示。
2.lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516联合使用在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用，其特征在于，所述lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:1～2所示。
3.一组检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516的荧光定量PCR引物组和探针，其特征在于，包括LINC00511荧光探针，LINC00511扩增正向引物和反向引物，LINC00516荧光探针，LINC00516扩增正向引物和反向引物；核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:3～8所示。
4.根据权利要求3所述的荧光定量PCR引物组和探针，其特征在于，还包括内参基因荧光探针、内参基因扩增正向引物和反向引物，核苷酸序列分别依次如SEQ ID NO:9～11所示。
5.权利要求3或4所述的荧光定量PCR引物组和探针在制备肺癌或肺癌转移诊断试剂盒和/或制剂中的应用。
6.一种肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，其特征在于，包含检测lncRNA LINC00511和lncRNA LINC00516表达量的试剂。
7.根据权利要求6所述的肺癌或肺癌转移诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求3或4所述的荧光定量PCR引物组和探针。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性对照液和阴性对照液。
9.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光定量PCR反应体系包括cDNA模板、2× Taqman DNA聚合酶、荧光染料、dNTP、镁离子。
10.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的荧光定量PCR反应条件为：95℃ 15min；95℃ 15s，60℃ 45s，重复40个循环。
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