CN111041024A - 一种核酸提取试剂盒及提取核酸的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种核酸提取试剂盒及提取核酸的方法，属于分子生物学领域，该核酸提取试剂盒包括裂解液、洗涤液I和洗涤液II；所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍该提取核酸的方法，将裂解液、核酸附着物和待提取样品混合，得到吸附有核酸的核酸附着物；再依次采用洗涤液I、洗涤液II和洗脱液清洗吸附有核酸的核酸附着物，每次清洗后固液分离并收集上清液，得到核酸。本发明提供的核酸提取试剂盒和核酸提取方法，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，得到浓度更高、纯度更高的核酸，保证后续操作的准确性，同时无需进行离心等操作，操作简单，一次提取均在1h内，提高了提取的效率。

Description

一种核酸提取试剂盒及提取核酸的方法
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种核酸提取试剂盒及提取核酸的 方法。
背景技术
根据世界卫生组织(WHO)2012年公布的全球疾病负担排序，下呼吸道感 染居第四位，仅次于缺血性心脏病、脑卒中和慢性阻塞性肺疾病；而在低收入 国家下呼吸道感染居死亡原因首位。目前国际上对肺炎进行长期动态的监测的 研究组织——美国和欧洲肺炎研究网络(CAPO和CAPNEZ)，该组织已成立近 20年，为肺炎流行病学、病原诊断、治疗方法和预防提供了大量的循证医学证 据，但我国仍缺乏这方面的长期动态研究，尤其是对病毒性肺炎的认识更不足。
肺泡灌洗液是研究下呼吸道感染的一种最重要样本类型，是作为病毒性肺 炎，细菌肺炎和真菌肺炎检测较为理想的样本，其阳性检出率高于痰液；但肺 泡灌洗液的采样，如BAL操作时混血，大气道分泌物混入，吸引负压大小，对 关系量回收量都会产生影响，采样到微生物的量会存在很大差异，加之肺泡灌 洗液比较粘稠，对其中微生物的提取存在较大困难。
微生物核酸的提取是能否准确检出病原菌的首要要素，现在市面上存在的 核酸提取试剂盒，有很少是专门针对肺泡灌洗液这类样本的，BAL中提取微生 物核酸的就更为稀少了，这就会造成BAL中微生物的提取效率偏低，极有可能 出现假阴性的情况
发明内容
为了克服上述现有技术的缺陷，本发明所要解决的技术问题是：提供一种 用于提取肺泡灌洗液中核酸的核酸提取试剂盒及提取核酸的方法。
为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种核酸提取试剂盒， 包括裂解液、洗涤液I和洗涤液II；所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二 硫苏糖醇和异硫氰酸胍。
本发明采用的另一种技术方案为：一种提取核酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、将裂解液、核酸附着物和待提取样品混合，得到吸附有核酸的核酸 附着物；
步骤2、依次采用洗涤液I、洗涤液II和洗脱液清洗吸附有核酸的核酸附着 物，每次清洗后固液分离并收集上清液，得到核酸；
所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍；
所述洗脱液为无核酸水。
本发明的有益效果在于：本发明提供的核酸提取试剂盒适用于肺泡灌洗液 中的核酸提取，能够有效避免样本中混血和分泌物的干扰，试剂盒中的裂解液 用于肺泡灌洗液的核酸提取，能破坏待提取样品的细胞膜和或者细胞壁，高效 裂解样本，使待提取样品中的核酸绝大部分得到释放，同时可保护核酸的稳定 与完整，配合洗脱液I和洗涤液II，所得核酸浓度更高，且稳定性和完整性更高， 使得提取效率最大化，得到高质量的核酸，确保后续应用的准确性和稳定性。 该试剂盒配方合理，能够去除提取的核酸的杂质，获得高纯度的核酸，所得核 酸能够直接用于琼脂糖凝胶电泳检测及聚合酶链式反应、酶切反应、基因文库 构建等操作中。
具体实施方式
为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式予 以说明。
本发明的一种核酸提取试剂盒，包括裂解液、洗涤液I和洗涤液II；所述裂 解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的核酸提取试剂盒 适用于肺泡灌洗液中的核酸提取，能够有效避免样本中混血和分泌物的干扰， 试剂盒中的裂解液用于肺泡灌洗液的核酸提取，能破坏待提取样品的细胞膜和 或者细胞壁，高效裂解样本，使待提取样品中的核酸绝大部分得到释放，同时 可保护核酸的稳定与完整，配合洗脱液I和洗涤液II，所得核酸浓度更高，且稳 定性和完整性更高，使得提取效率最大化，得到高质量的核酸，确保后续应用 的准确性和稳定性。
进一步的，所述裂解液包括5-100mmol/L的Tris、1-200mmol/L的EDTA、 体积百分数含量为0.1-5％的Tween20、1-5mol/L的二硫苏糖醇和3-5mol/L的异 硫氰酸胍。
从上述描述可知，上述裂解液中，EDTA可抑制脱氧核糖核酸酶对DNA的 降解作用，在DNA释放到裂解液中以后保护DNA，和Tris联用可作为整个裂 解液的稳定剂，稳定pH与无离子环境，使得核酸在释放到裂解液中后，得到良 好的保护；由于肺泡灌洗液中细胞的类型丰富，裂解细胞的难易程度不同，加 入一定浓度的tween-20，可以使微生物的细胞膜加速破裂，使核酸更加容易的 释放到裂解液中，配合二硫苏糖醇(DTT)使用，可破坏RNase蛋白质中的二 硫键，使RNA酶变性，同时抑制酚类氧化引起的磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，使DNA与RNA分离，有助于如RNA建库，RNA扩增等实验 的进行；在裂解液中加入较高浓度DTT，可使肺泡灌洗液中含量丰富的蛋白质 变性，在异硫氰酸胍(GTC)的配合下，高浓度的GTC可更好的沉淀核酸，充 分变性蛋白，使释放到裂解液中的核酸很好的与蛋白分离，使BAL中含量非常 稀少的微生物核酸充分释放到裂解液中，使微生物核酸的提取效率提高。该试 剂盒配方合理，能够去除提取的核酸的杂质，获得高纯度的核酸，所得核酸能 够直接用于琼脂糖凝胶电泳检测及聚合酶链式反应、酶切反应、基因文库构建 等操作中。
进一步的，所述洗涤液I包括5-6mol/L的异硫氰酸胍，1-200mmol/L的EDTA， 以及质量百分数为30-50％的乙醇或40-80％的异丙醇。
从上述描述可知，通过在洗涤液I中加入EDTA、GTC，以及乙醇和异丙醇， 可有效抑制DNAse，使得DNA在洗涤中也能保持完整，使没有变性完全的蛋白 质完全变形，可对裂解液中未完全变性的蛋白的补充变性，起到补充裂解和初 步洗涤DNA的双重作用，且乙醇和异丙醇作为溶剂使用同时易挥发，这样使得 洗涤后获得的核酸在以后的应用，特别是DNANGS建库中使得建库效率得到很 大的提高。
进一步的，所述洗涤液II包括20-200mmol/L的NaCl，以及质量百分数为 70-100％的异丙醇或乙醇。
从上述描述可知，洗涤液II中一定浓度的氯化钠可使得的核酸不溶解于水 溶液中，增加核酸的析出，保持核酸的稳定，使其免受DNAse和RNAse的破 会，能更好的起到漂洗DNA的作用，使用洗涤液II洗涤是核酸提取的最后一步， 异丙醇和氯化钠共同作用将核酸中的杂质处理干净的同时，又能将影响核酸洗 脱效率的因素排除。
进一步的，所述裂解液包括5-40mmol/L的Tris。
本发明的另一种技术方案为：一种提取核酸的方法，包括以下步骤：
步骤1、将裂解液、核酸附着物和待提取样品混合，得到吸附有核酸的核酸 附着物；
步骤2、依次采用洗涤液I、洗涤液II和洗脱液清洗吸附有核酸的核酸附着 物，每次清洗后固液分离并收集上清液，取洗脱液固液分离后的上清液，得到 核酸；
所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍；
所述洗脱液为无核酸水。
从上述描述可知，本发明的有益效果在于：本发明提供的提取核酸的方法，
进一步的，所述裂解液包括5-100mmol/L的Tris、1-200mmol/L的EDTA、 体积百分数含量为0.1-5％的Tween20、1-5mol/L的二硫苏糖醇和3-5mol/L的异 硫氰酸胍；优选的，所述裂解液包括5-40mmol/L的Tris。
进一步的，所述洗涤液I包括5-6mol/L的异硫氰酸胍，1-200mmol/L的EDTA， 以及质量百分数为30-50％的乙醇或40-80％的异丙醇；所述洗涤液II包括 20-200mmol/L的NaCl，以及质量百分数为70-100％的异丙醇或乙醇。
进一步的，所述核酸附着物为磁珠、电化学芯片或吸附膜。
从上述描述可知，通过设置核酸附着物能够将核酸从裂解后的待提取样品 中分离出来，无需进行物理或化学破碎细胞，操作简单，能够较大限度避免核 酸的损失。
进一步的，所述步骤1中裂解液、核酸附着物和待提取样品混合的温度为10-40℃，混合的时间为2-8min。
实施例1-实施例7的具体配方见表1所示：
表1
Figure BDA0002350640110000051
上述实施例1-10的配方中，余量为灭菌无核酸纯化水。
实施例11：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于10℃下混合5min，再加入核酸附着物于 40℃下混合5min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为非患病人来源肺泡灌洗液；所述核酸附着物为磁珠；
步骤2、采用洗涤液I于40℃下浸泡吸附有核酸的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液I和一次清洗后的核酸附着物；
采用洗涤液II于10℃下浸泡1min一次清洗后的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液II和二次清洗后的核酸附着物；
采用洗脱液于10℃下浸泡3min二次清洗后的核酸附着物，采用磁分离进行 固液分离，得到上清液Ⅲ；取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例1所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例12：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于40℃下混合2min，再加入核酸附着物于 10℃下混合2min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为非患病人来源肺泡灌洗液；所述核酸附着物为磁珠；
步骤2、采用洗涤液I于10℃下浸泡5min吸附有核酸的核酸附着物，采用 磁分离进行固液分离，得到上清液I和一次清洗后的核酸附着物；
采用洗涤液II于40℃下浸泡5min一次清洗后的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液II和二次清洗后的核酸附着物；
采用洗脱液于40℃下浸泡1min二次清洗后的核酸附着物，采用磁分离进行 固液分离，得到上清液Ⅲ；取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例2所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例13：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于25℃下混合3min，再加入核酸附着物于 25℃下混合3min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为非患病人(确定未患有下呼吸道疾病)来源肺泡灌洗液； 所述核酸附着物为磁珠；
步骤2、采用洗涤液I于25℃下浸泡3min吸附有核酸的核酸附着物，采用 磁分离进行固液分离，得到上清液I和一次清洗后的核酸附着物；
采用洗涤液II于10℃下浸泡2min一次清洗后的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液II和二次清洗后的核酸附着物；
采用洗脱液于10℃下浸泡3min二次清洗后的核酸附着物，采用磁分离进行 固液分离，得到上清液Ⅲ；取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例3所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例14：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于30℃下混合5min，再加入核酸附着物于 40℃下混合5min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为正常人(未进行下呼吸道疾病的检测和诊断)来源肺泡 灌洗液；所述核酸附着物为磁珠；
步骤2、采用洗涤液I于40℃下浸泡吸附有核酸的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液I和一次清洗后的核酸附着物；
采用洗涤液II于10℃下浸泡1min一次清洗后的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液II和二次清洗后的核酸附着物；
采用洗脱液于10℃下浸泡3min二次清洗后的核酸附着物，采用磁分离进行 固液分离，得到上清液Ⅲ；取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例4所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例15：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于30℃下混合5min，再加入核酸附着物于 10℃下混合5min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为正常人来源肺泡灌洗液；所述核酸附着物为磁珠；
步骤2、采用洗涤液I于40℃下浸泡吸附有核酸的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液I和一次清洗后的核酸附着物；
采用洗涤液II于10℃下浸泡1min一次清洗后的核酸附着物，采用磁分离 进行固液分离，得到上清液II和二次清洗后的核酸附着物；
采用洗脱液于10℃下浸泡3min二次清洗后的核酸附着物，采用磁分离进行 固液分离，得到上清液Ⅲ；取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例5所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例16：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于30℃下混合5min，再加入核酸附着物于 40℃下混合5min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为正常人来源肺泡灌洗液；所述核酸附着物为硅胶吸附膜 (购于深圳逗点生物技术有公司)；过滤压力为0.10Mpa
步骤2、于25℃采用硅胶吸附膜过滤洗涤液I，过滤压力为0.10Mpa，得到 上清液I和一次过滤后的硅胶吸附膜；
于25℃采用硅胶吸附膜过滤洗涤液II，过滤压力为0.10Mpa，得到上清液 I和二次过滤后的硅胶吸附膜；
于25℃采用硅胶吸附膜过滤洗脱液，过滤压力为0.10Mpa，得到上清液Ⅲ； 取上清液Ⅲ，得到核酸；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例6所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例17：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于20℃下混合8min，再加入核酸附着物于 40℃下混合5min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
所述待提取样品为正常人来源肺泡灌洗液；所述核酸附着物为磁珠；
步骤2：同实施例11；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例7所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例18：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1和步骤2同实施例13；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例8所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例19：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1、将裂解液和待提取样品于30℃下混合2min，再加入核酸附着物于 30℃下混合2min，得到吸附有核酸的核酸附着物；
步骤2同实施例13；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例9所示，所述洗脱液为 无核酸水。
实施例20：
一种提取核酸的方法，具体包括以下步骤：
步骤1和步骤2同实施例13；
所述裂解液、洗涤液I和洗涤液II的组成如实施例10所示，所述洗脱液为 无核酸水。
对比例1：
对比例1除裂解液中不添加EDTA外，其余组分均与实施例2相同，提取 核酸的方法与实施例12相同。
对比例2：
对比例2除洗涤液1中不添加GCT外，其余组分均与实施例2相同，提取 核酸的方法与实施例12相同。
对比例3：
对比例3除洗涤液II不添加NaCl外，即仅使用乙醇或异丙醇，其余组分均 与实施例6相同，提取核酸的方法与实施例16相同。
对比例4：
对比例4除洗涤液II使用醋酸钠代替NaCl外，其余组分均与实施例6相同， 提取核酸的方法与实施例16相同。
采用nanodrop分光光度仪测定实施例11-20和对比例1-4的核酸的浓度和纯 度；其中，纯度为OD260与OD280的比值，OD260表示核酸在波长为260nm 下的吸光值，OD280表示核酸在波长为280nm下的吸光值，测定结果详见表2 所示。
表2
实施例 浓度(ng/ul) 纯度
实施例11 15 1.73
实施例12 24 1.62
实施例13 96 1.90
实施例14 48 1.75
实施例15 75 1.83
实施例16 100 1.85
实施例17 18 1.66
实施例18 53 1.77
实施例19 28 1.80
实施例20 64 1.83
对比例1 23 1.60
对比例2 17.8 1.62
对比例3 58 1.65
对比例4 30 1.72
从表2可以看出，实施例11-20得到的核酸的浓度为15-100ng/μL，且核酸 的纯度为1.62-1.90，说明上述实施例的核酸提取试剂盒能够提取得到质量较高 的核酸，对比例1-4的核酸得率和纯度和实施事例相比都较差，从另一个角度说 明，本专利洗涤液选择的合理性和有效性，使用不完全或者有替代作用的洗涤 液，都不能达到较好的提取效果。
综上所述，本发明提供的核酸提取试剂盒适用于肺泡灌洗液中的核酸提取， 能够有效避免样本中混血和分泌物的干扰，试剂盒中的裂解液用于肺泡灌洗液 的核酸提取，能破坏待提取样品的细胞膜和或者细胞壁，高效裂解样本，使待 提取样品中的核酸绝大部分得到释放，同时可保护核酸的稳定与完整，配合洗 脱液I和洗涤液II，所得核酸浓度更高，且稳定性和完整性更高，使得提取效率 最大化，得到高质量的核酸，确保后续应用的准确性和稳定性。本发明提供的 核酸提取试剂盒和核酸提取方法，能够充分有效地裂解细胞，裂解效率高，以 使细胞中的核酸能够充分释放，能够较大限度的降低核酸的丢失，得到浓度更 高、纯度更高的核酸，保证后续操作的准确性，以能够直接用于聚合酶链式反 应、酶切反应、基因文库构建等操作中，同时无需进行离心等操作，操作简单， 一次提取均在1h内可以完成，提高了提取的效率。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利 用本发明说明书内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域， 均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种核酸提取试剂盒，其特征在于，包括裂解液、洗涤液I和洗涤液II；所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍。
2.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括5-100mmol/L的Tris、1-200mmol/L的EDTA、体积百分数含量为0.1-5％的Tween20、1-5mol/L的二硫苏糖醇和3-5mol/L的异硫氰酸胍。
3.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液I包括5-6mol/L的异硫氰酸胍，1-200mmol/L的EDTA，以及质量百分数为30-50％的乙醇或40-80％的异丙醇。
4.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述洗涤液II包括20-200mmol/L的NaCl，以及质量百分数为70-100％的异丙醇或乙醇。
5.根据权利要求1所述的核酸提取试剂盒，其特征在于，所述裂解液包括5-40mmol/L的Tris。
6.一种提取核酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、将裂解液、核酸附着物和待提取样品混合，得到吸附有核酸的核酸附着物；
步骤2、依次采用洗涤液I、洗涤液II和洗脱液清洗吸附有核酸的核酸附着物，每次清洗后固液分离并收集上清液，取洗脱液固液分离后的上清液，得到核酸；
所述裂解液包括Tris、EDTA、Tween20、二硫苏糖醇和异硫氰酸胍；
所述洗脱液为无核酸水。
7.根据权利要求6所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述裂解液包括5-100mmol/L的Tris、1-200mmol/L的EDTA、体积百分数含量为0.1-5％的Tween20、1-5mol/L的二硫苏糖醇和3-5mol/L的异硫氰酸胍。
8.根据权利要求6所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述洗涤液I包括5-6mol/L的异硫氰酸胍，1-200mmol/L的EDTA，以及质量百分数为30-50％的乙醇或40-80％的异丙醇；所述洗涤液II包括20-200mmol/L的NaCl，以及质量百分数为70-100％的异丙醇或乙醇；所述裂解液包括5-40mmol/L的Tris。
9.根据权利要求6所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述核酸附着物为磁珠、电化学芯片或吸附膜。
10.根据权利要求6所述的提取核酸的方法，其特征在于，所述步骤1中裂解液、核酸附着物和待提取样品混合的温度为10-40℃，混合的时间为2-8min。
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