CN105586333A - 一种用于核酸扩增的酵母样真菌总dna快速提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及真菌分子生物学领域，具体是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，所述方法将冻融法、化学裂解法、机械破壁法巧妙整合，在10到20分钟内完成DNA提取，是目前为止最快的廉价、无毒真菌DNA高效提取方法。本发明的提取方法具有快速、灵敏、无毒、便宜等优点，可适用于绝大部分酵母样真菌。

Description

一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法
技术领域
本发明涉及真菌的分子生物学研究领域，具体地说，是一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法。
背景技术
近几十年来，生物医学领域的巨大进步促进了人类疾病防控能力的显著提升。然而，随着造血干细胞和实体器官移植、肿瘤化疗、免疫抑制剂、广谱抗生素、各种置管技术的广泛使用及HIV在全球的持续蔓延，各种侵袭性真菌感染的发病率及死亡率在全球呈显著上升趋势。比如，据保守估计，在医疗发达地区每年有250000例侵袭性念珠菌病新发病例，引起大于50000人死亡，其人群患病率为2-14人每十万人。1995～2002年美国49所医院连续7年的监测资料表明，念珠菌败血症在医院感染性败血症中居第4位(8–10％)，病死率则居首位，且其发病率在大部分地区逐年上升或保持稳定。又如，据相关的流行病学研究，在HIV(+)人群中，每年全球约有957900新发隐球菌脑膜炎患者，导致其中624700人在患病三个月内死亡。据ChenYu-Chong人等调查，我国于1985–2010年间，共有8769例隐球菌病报道，且呈现逐年上升趋势。同时，某些新兴酵母感染有抬头趋势。在各种侵袭性真菌感染中，酵母样病原真菌(Yeast-LikeFungalPathogens)处于重要地位。
酵母样病原真菌既包括新生隐球菌(Cryptococcus.neoformans)、格特隐球菌(Cryptococcus.gattii)、白念珠菌(Candidaalbicans)等酵母菌，也包括一些温度变化型双向真菌(ThermallyDimorphicFungi)，比如组织胞浆菌(Histoplasmacapsulatum)在常温(22-28℃)下为菌丝形态，而在人体37℃状态下呈现酵母形态。由于上述酵母菌和双向真菌菌的组织形态具有很大的相似性，对于没有系统深厚病原真菌学基础的检验人员，难以通过形态学确诊，并且真菌感染疾病谱正发生变化，不同病种治疗药物差异较大，非基于病原体确诊的经验性抗真菌治疗效果有限。直接镜检通常敏感性不够高，存在一定的假阳性和假阴性。真菌培养往往需要很长时间(一周到一个月)，而临床急诊的救治工作争分夺秒，确诊时常常错过最佳诊治时机。血清学检测是临床侵袭性真菌感染的重要检测方法，然而其影响因素较多，存在不同程度的假阳性和假阴性结果。与传统方法相比，分子生物学检测手段因其高灵敏度、高特异性及检测时间短等优点，为不易培养病原真菌的快速检测和鉴定、抗真菌药物抗性检测以及宿主组织体液的直接性快速检测带来了希望，是未来真菌感染性疾病诊断的新趋势，具有重大的发展前景。
酵母样真菌的DNA的提取，是后续进行临床快速分子诊断的基础。在酵母样真菌DNA提取中，菌体破壁是其最为关键的技术难点。不同于其他微生物，真菌的细胞壁由几丁质、葡聚糖、甘露聚糖、糖蛋白组成，十分坚固厚实，难以通过简单的物理或者化学方法去除。虽然现有多种市售试剂盒以及经典实验室方法，但是存在多种缺陷如下：1、试剂盒价格昂贵，YeaStarTMGenomicDNAKit酵母菌提取试剂盒为例提取每个样本将近25元，zymoZRFungal/BacterialDNAKit提取试剂盒提取每个样本将近20元；2、提取速度慢，由于大部分市售试剂盒以及实验室方法都加入了蛋白酶K、蜗牛酶的消化步骤，使得提取时间过程需要几个小时，比如生工EzupColumnYeastGenomicDNAPurificationKit试剂盒，仅酶消化步骤就需要四个小时以上(蛋白酶K一小时，蜗牛酶三小时)；3、运输保存困难，由于蛋白酶活性对于运输条件较为敏感，试剂盒对于运输保存有一定的要求。4、有毒有害物质，如氯化苄提取法中的氯化苄是致癌物，经典的酚氯抽提法中的苯酚氯仿也会刺激人体呼吸道，试剂盒常用到的巯基乙醇为剧毒物，有强烈的恶臭。5、大部分商用试剂盒以及实验室现有提取方法，对于少量真菌提取效果较差，故缺乏用于临床诊断潜力。以上种种提取方法的缺陷增加了提取时间，损害了操作人员的健康，同时其高昂的成本限制了以DNA为基础的分子诊断技术在实验室以及临床的应用。所以廉价而快速得到高浓度以及高质量的真菌DNA仍为业内一大难点。亟需一种廉价、高速、无毒、方便运输的真菌DNA提取方法，方便科研与临床工作。
对于真菌DNA提取，主要的破壁方法可以分为四类
1、冻融法(thermiclysis)：通过液氮、干冰等低温介质结合水浴或者加热块导致温度的急剧变化，对于细胞壁加以损害。温度变化对于DNA损伤不大，基于液氮和水浴反复冻融的方法是提取真菌DNA中的较为经典步骤；
2、酶解法(enzymaticlysis)：通过蛋白酶K，蜗牛酶等，降解真菌细胞壁，但是该过程通常需要多个小时，这就是导致YeaStarTMGenomicDNAKit、TakaraDr.(fromYeast)HighRecovery、EzupColumnYeastGenomicDNAPurificationKit等试剂盒速度较慢的主要原因；
3、化学裂解法(chemicallysis)：使用以尿素、胍盐、强酸、强碱等为主要成分的裂解液，裂解真菌细胞壁，但是单纯的化学裂解对于真菌细胞壁的作用十分有限，提取效率不高；
4、机械破壁法(mechanicallysis)：使用因酸洗而产生微孔的微玻璃珠、微波、研钵和杵等，通过机械力损伤真菌细胞壁。该方法破壁效果可靠，但是由于机械破壁的同时也会导致DNA降解，破坏细胞壁取得DNA和DNA的断裂消耗是该方法下的一对矛盾。比如在玻璃珠持续撞击细胞壁的同时，也会导致已经存在提取液中的水合DNA产生持续性降解。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，所述方法将冻融法(thermiclysis)、化学裂解法(chemicallysis)、机械破壁法(mechanicallysis)巧妙整合，在10到20分钟内完成DNA提取，是目前为止最快的廉价、无毒真菌DNA高效提取方法，称为TCM法(Thermic–Chemical-MechanicalMethod)。
本发明的第一方面，提供一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，本发明的提取方法所需材料和仪器：真菌裂解液，清洗液；酸洗玻璃珠(200微米左右)；无水乙醇；高速离心机；细胞破碎仪(celldisruptor)，液氮，加热块或者水浴锅、离心柱。
所述的酵母样真菌包括：隐球菌、念珠菌、胶红酵母，以及双向真菌的酵母形态(如组织胞浆菌)。
所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法包括以下步骤：
A、在2mlEP管中加入150-200mg酸洗玻璃微珠，加入真菌固体菌落；
*若为菌液或者真菌感染组织液化标本(真菌细胞壁由于较为坚固，无法用普通试剂短时间随着组织一起液化)，在加入玻璃珠后加入菌液或者临床液化样本(至多1.8ml)，高速离心12000rpm/min2分钟，移液器尽量吸取上清(由于离心后菌体沉淀于玻璃珠之下，故菌体不容易随上清被吸附)；
B、加入300μl胍盐裂解液；
C、金属浴(又叫做干式加热器)105℃加热90秒(如果室温为25℃，则裂解液温度大致到达70-80℃)；
D、迅速放入液氮冷冻(大约30秒)；
E、迅速放入金属浴105℃加热150秒(裂解液温度大致到达40-50℃)；
F、组织破碎仪55Hz破碎60秒钟；
G、12000rpm/min离心一分钟；
H、取200μl上清加入1.5mlEP管，加入20μl清洗液(清洗液配方：无水乙醇90％体积+3MNaAC10％体积，pH＝5.2，用HAc调节pH值)，充分混匀；
I、加入560μl无水乙醇，轻柔混匀；
J、取750μl混合液加入核酸吸附柱，10,000rpm/min离心一分钟，弃离心液；
K、加入500μl洗脱液(双蒸水或者TE缓冲液)，10,000rpm/min离心一分钟，弃离心液；
L、重复步骤K；
M、核酸吸附柱10,000rpm/min空转2-3分钟；
N、将吸附柱从收集管中取出，放入新的1.5mlEP管，在离心柱吸附膜中心加入60μl双蒸水或者TE缓冲液；
O、10,000rpm/min离心30秒收集DNA溶液。
所述的步骤B中的胍盐裂解液中异硫氰酸胍的浓度为4.0-5.5M，优选4.7M。
所述的胍盐裂解液具体配方为：
每1000ml裂解液中，包含：
三羟甲基氨基甲烷(Tris)0.047mol
乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)0.020mol
异硫氰酸胍4.0-5.5mol(最优值4.7mol)
TritonX-10011.3ml
用水补足1000ml
用盐酸将pH调至6.53，将溶液转移至储存容器，贴上标签，室温避光保存。
优选的，所述的步骤B之后，加入工作浓度的蛋白酶K，在56℃消化一小时，再进行后续的液氮冻融以及玻璃珠击打步骤。
本发明优点在于：
1、优点：快速、灵敏(10c.f.u./ml)、无毒、便宜。
2、本发明采用的提取液配方较为常见，但是胍盐裂解液的浓度，大约4.7M左右，能达到较强的裂解效果，同时能够在液氮冰冻之后，较快融化。
3、本发明重点在于几种提取方法(化学裂解、温度变化、机械)的巧妙组合，使用了最短的时间(与所有文献报道真菌DNA提取方法相比较为最快)，达到了最大的提取效果。现有其他的组合方式(具体见下)，但是提取效果均没有本发明的方法优秀。
4、本发明的方法具体的优点在于：时间短(仅需十五分钟)；无刺激性气味(其他试剂盒使用了巯基乙醇，苯酚、氯仿、异戊醇等，危害操作人员健康。)；提取得率高(108菌提取得到将近1000ng/μl，效果等同于目前最好的试剂盒，优于大部分试剂盒)；敏感度高(即能够提取样本量极小的真菌，具体是能够成功提取总量为10个酵母菌(1ml浓度为101/ml菌液)，并通过实时定量PCR验证，有临床推广的潜质)。
5、本发明的提取方法为几种真菌裂解方法的组合，其组合的巧妙之处在于：在机械破壁之前，用较为剧烈的液氮金属浴反复冻融方法做预处理，首先将样本温度通过金属浴(105℃)快速升高2分钟(大约到75度左右，在较高温度下，胍盐裂解液将会剧烈腐蚀真菌细胞壁以及细胞膜)，然后快速放入液氮(边摇晃边冷冻，可以加快冷冻速度，液氮冷冻一方面降低了细胞壁的完整性，另一方面可以使得真菌细胞质内水分快速形成冰晶，刺破细胞膜以及细胞壁)，大约30秒之后从液氮中取出样本，再次放入金属浴(105度)，在三分钟内，样本完成解冻并上升到50-60度左右，此时，真菌细胞壁经过上述过程已经大大削弱。将样本快速放入组织破碎仪(样本管中以及在试验之初，加入了表面有尖锐微孔的酸洗微玻璃珠，在破碎仪的作用下，玻璃珠快速击打刮擦真菌细胞壁，完成破壁)，破碎频率为55Hz，时间为60秒。与之相比：ZRFungal/BacterialDNAKits也运用了玻璃微珠击打，但是由于该试剂盒没有进行样本预处理，所以击打时间需要五分钟，得到的菌仅有本发明方法得到的十分之一左右。存在该差异的原因为由于没有事先预处理，所以破壁需要的玻璃珠击打时间较长，一方面玻璃珠打碎细胞壁释放DNA，另一方面，快速运动的玻璃珠长时间作用于释放的DNA，导致DNA大量降解。另一个与之比较的方法CTAB+玻璃珠+蛋白酶K法。该方法大致流程为在裂解作用较弱的CTAB缓冲液的样本，首先进行45S55HZ玻璃珠破壁，然后蛋白酶K56度作用一小时，然后再次45S破壁。该方法得到的DNA质量高，但是该方法耗时较长，需要大约四小时左右。
6、便宜：本发明的方法未使用价格较高的酶做真菌细胞壁的消化，裂解液选择了较为普通的胍盐裂解液，后续的清洗液、洗脱液均较为常规。值得一提的是，由于胍盐裂解液不会影响真菌细胞壁的消化酶——蛋白酶K的活性，所以，如果想要达到更高的提取效果，可以在液氮冻融复温后，再加入蛋白酶K，消化一小时，再进行玻璃珠击打。
7、本发明的方法可适用于绝大部分酵母样真菌，因为温度变化、机械破壁以及化学裂解对不同的菌种作用近似，较为稳定，但是不同的酶对不同的真菌作用效果不同。比如YeaStarTMGenomicDNAKit试剂盒的yeastlytic酶对于Aspergillsfumigatus,Aspergillsnidulans,Aspergillsnivensvar.aureus,Candidaalbicans,Pichiapastoris,Saccharomycescerevisiae,Schizosaccharomycespombe等真菌破壁效果较好，但是对于细胞壁结构对于yeastlytic酶不敏感的菌种，该试剂盒无法提取。
附图说明
图1.本发明的方法可用于微量真菌的抽提，并用RT-PCR证明提取成功。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明提供的具体实施方式作详细说明。
实施例1：提取DNA效果：
选取五种真菌进行DNA抽提：
表1本方法对于大量真菌的提取效果
总量为107-101的上述菌株用TCM法提取DNA后，使用NS5与NS6真菌通用引物进行实时荧光定量PCR(RT-PCR)的结果，均扩增成功。无模板对照(NTC)未见扩增。
引物序列：
NS5:AACTTAAAGGAATTGACGGAAG(SEQIDNO.1)
NS6:GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC(SEQIDNO.2)
扩增体系为：
PremixExTaqTMII(TliRNaseHPlus)(takara)12.5μl
NS51μl
NS61μl
DNA模板10.5μl
共25μl
扩增条件
95℃30秒-{95℃5秒-55℃30秒-72℃60秒}共40个循环-95℃5秒-60℃30秒
本发明的方法可用于微量真菌的抽提，并用RT-PCR证明提取成功，见图1。
实施例2：与其他提取方法的比较
本发明的方法与其他真菌提取试剂盒的比较见表2，与文献报道的其他方法的比较见表3。
表2与其他真菌提取试剂盒比较
表3与文献报道的方法比较
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可做出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。

Claims (9)

1.一种用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、在2mlEP管中加入150-200mg酸洗玻璃微珠，加入真菌固体菌落；或在2mlEP管中加入150-200mg酸洗玻璃微珠，加入菌液或者真菌感染组织液化标本，高速离心12000rpm/min2分钟，移液器尽量吸取上清；
B、加入300μl胍盐裂解液；
C、金属浴105℃加热至裂解液温度到达70-80℃；
D、迅速放入液氮冷冻30秒；
E、迅速放入金属浴105℃加热至裂解液温度到达40-50℃；
F、组织破碎仪55Hz破碎60秒；
G、12000rpm/min离心一分钟；
H、取200μl上清加入1.5mlEP管，加入20μl清洗液，充分混匀；
I、加入560μl无水乙醇，轻柔混匀；
J、取750μl混合液加入核酸吸附柱，10,000rpm/min离心一分钟，弃离心液；
K、加入500μl洗脱液，10,000rpm/min离心一分钟，弃离心液；
L、重复步骤K；
M、核酸吸附柱10,000rpm/min空转2-3分钟；
N、将吸附柱从收集管中取出，放入新的1.5mlEP管，在离心柱吸附膜中心加入60μl双蒸水或者TE缓冲液；
O、10,000rpm/min离心30秒收集DNA溶液。
2.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的酵母样真菌包括酵母菌和双向真菌的酵母形态。
3.根据权利要求2所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的酵母菌包括隐球菌、念珠菌、胶红酵母、毛孢子菌，所述的双向真菌的酵母形态包括组织胞浆菌。
4.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的步骤B中的胍盐裂解液中异硫氰酸胍的浓度为4.0-5.5mol。
5.根据权利要求4所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的步骤B中的胍盐裂解液配方为：每1000ml裂解液中包含：三羟甲基氨基甲烷0.047mol，乙二胺四乙酸二钠0.020mol，异硫氰酸胍4.0-5.5mol，TritonX-10011.3ml，用水补足1000ml，用盐酸将pH调至6.53。
6.根据权利要求4所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的胍盐裂解液中异硫氰酸胍的浓度为4.7M。
7.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的步骤H中的清洗液为：90％体积的无水乙醇加入10％体积的3MNaAC，所述的清洗液的pH为5.2，用HAc调节pH值。
8.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的步骤K中的洗脱液为双蒸水或者TE缓冲液。
9.根据权利要求1所述的用于核酸扩增的酵母样真菌总DNA快速提取方法，其特征在于，所述的步骤B之后，加入工作浓度的蛋白酶K，在56℃消化一小时，再进行后续的液氮冻融以及玻璃珠击打步骤。
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