CN104946622A - 一种快速提取真菌基因组dna的方法 - Google Patents

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边银丙
王刚正
樊晓琳
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Abstract

本发明公开了一种快速提取真菌基因组DNA的方法，其过程为：在液氮研磨后的菌丝或子实体中加入裂解液，加入PCA，离心；取上层水相，加入3M醋酸钠，再加入预冷的无水乙醇，-20℃放置5-10min；离心；弃上清，用75%的酒精漂洗沉淀，离心，弃上清；加入ddH2O和RNase,溶解，-20℃保存。本发明公开的真菌基因组的提取方法，相对于其它方法，操作简单，可行性强，提取DNA所需材料少，提取DNA效率高，完整性和稳定性好，杂质含量相对较低，可以直接用于ITS测序等进一步的研究。同时子实体可以进行DNA的提取，节省了菌丝活化、培养的时间，为大型真菌分子生物学研究提供了一种高效可行的分子技术途径。

Description

一种快速提取真菌基因组DNA的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速提取真菌基因组DNA的方法。
技术背景
大型真菌是世界上极为重要的微生物，在人们的生活中扮着重要的角色。木霉对植物病害的防治作用；青霉代谢产物对人们疾病有着很好的防治作用；食用菌具有重要的营养价值和保健功能，能满足人们对健康食品的需求，食用菌产业能大量转化利用农作物秸秆，食用菌与人类生活的关系日益密切，如茯苓是中药的四大辅药之一，灵芝能提高人们的免疫能力，香菇富含膳食纤维和具有调节人体免疫能力的多糖类物质，冬虫夏草对人体代谢机能具有平衡调和作用等。因此，对大型真菌进行更深一步的研究，就显得非常必要。
分子生物学技术迅猛发展，并渗透到各个学科领域，分子生物学技术是探索生命科学奥秘的基石。随着一些大型真菌基因组序列分析的开展，克隆技术为木霉在植物病害上生防作用及青霉的在人类疾病方面起了重要的作用，分子辅助育种将成为食用菌产量提高、品质改良的重要途径。在分子生物学研究中，优良的DNA是开展研究的基本前提，快速高效地获得质量优良的基因组DNA具有非常重要的意义。
大型真菌具有富含几丁质的细胞壁，且含有各种复杂的多糖成分，导致提取的DNA溶液中杂质较多，提取过程繁琐。目前大型真菌基因组DNA提取方法主要参考植物基因组DNA提取的方法，如：CTAB法、SDS法、尿素法、氯化苄法、试剂盒法等。CTAB法和SDS法提取的DNA含量相对较高，但DNA纯度相对较低；尿素法提取的DNA中酚类、糖类等杂质含量相对较高，对后续的研究有一定的影响；氯化苄法，提取步骤虽简便易行，但DNA质量不够稳定，对于在提取缓冲液中分散性不好的材料，DNA的提取效果不好；试剂盒法提取的DNA纯度相对较高，但DNA含量相对偏低，且成本较高。上述几种方法在提取过程中，加入裂解液后，需要在65℃水浴条件中水浴30-60min，水浴过程中还需要每隔几分钟摇动一次，加入PCA后，需要摇动10min左右，然后静置10min，整个流程相当耗时费工。Tris饱和酚法提取的基因组DNA电泳条带显示出弥散。
随着分子生物学学科发展，非常必要找到一种快速高效获取DNA的方法。本方法旨在保证DNA质量的前提下，缩短提取时间。
发明内容
本发明提供了一种快速提取真菌基因组DNA的方法，该方法提取真菌基因组DNA所用时间短，提取成本低，效率高，操作方便，且获取的基因组DNA质量稳定，能够直接用于测序等进一步的研究工作。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种快速提取真菌基因组DNA的方法，步骤如下：
（1）取材：放置-70℃保持的菌丝或者子实体，放到预冷的研钵中；
（2）加入液氮研磨至粉末状，将粉末加入灭菌的离心管中；
（3）加入裂解液，混匀，所述的裂解液的配方为：100mM Tris-HCl(pH=7.8),20mM EDTA,1.4M NaAc,2%(w/v)CTAB,0.5%（v/v）SDS；
（4）加入PCA，混匀，PCA配方为：氯仿：苯酚：异戊醇=25:24:1，体积比；
（5）离心；
（6）取上层水相至另一离心管中，加入3M醋酸钠，再加入预冷的无水乙醇，-20℃放置5-10min；
（7）离心；
（8）弃上清，用75%的酒精漂洗沉淀，离心，弃上清；
（9）加入ddH2O和RNase,溶解，-20℃保存。
上述方案中，所选取的菌丝或子实体选自：香菇(Lentinula edodes)，赤芝（Ganoderma lucidum）、茯苓（Poriacocos）、茶树菇（Agrocybe cylindracea）、金针菇（Flammulina velutipes）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、毛木耳（Auricularia polytricha）、蛹虫草(Cordycepts militars）或绿色木霉（Trichodermaviride）。
优选的步骤（3）中，加入裂解液后，优选的混匀时间为10-15s；
上述方案中，步骤（4）中，加入PCA后，混匀时间为30s；
上述方案中，步骤（5）中，离心的最佳转速为12000rpm，离心时间为2min。
上述方案中，步骤（5）离心后，若中间层有白色沉底，重复步骤（4）和（5）直至无白色沉底。
上述方案中，步骤（6）中加入乙醇的体积为水相的2倍，加入的醋酸钠体积为水相的1/10。上述方案中，步骤（7）中离心的最佳转速为12000rpm，离心时间为2min。
上述方案中，步骤（8）中75%酒精漂洗两次。最佳离心转速为12000，离心时间为30s。
上述方案中，步骤（9）中RNase的浓度为10mg/ml。
与现有技术相比较，本发明具有以下特点：
（1）在提取大量基因组DNA时，省时省力，通常在一个小时内完成。
（2）提取DNA效率高，完整性和稳定性好，杂质含量相对较低，可以直接用于ITS测序等进一步的研究。
（3）相对于其它提取DNA的方法，操作简单，可行性强。
（4）提取DNA所需材料少，并且子实体可以进行DNA的提取，节省了菌丝活化、培养的时间，为大型真菌分子生物学研究提供了一种高效可行的分子技术途径。
（5）本方法亦可应用于其它大型真菌基因组DNA的提取，例如：木栖柱孢霉（Scytalidium lignicola）、蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium fungicola）、茄病镰刀菌（Fusarium solani）等大型真菌菌丝体基因组DNA的提取。
附图说明
图1为本发明方法和CTAB法提取的香菇及茯苓菌丝体基因组DNA电泳示意图。
其中：4为Marker2000，1-3为CTAB提取的DNA，5-7为本方法提取的DNA；1,5为香菇子实体DNA，2,6为为香菇菌丝体DNA，3,7为茯苓菌丝体DNA。
图2为ITS片段用来检测以香菇及茯苓菌丝体基因组DNA为模板的质量电泳示意图。
其中：M为Marker2000，2是以茯苓菌丝体为模板扩增产物，3是以香菇菌丝体为模板扩增产物，4是以香菇子实体为模板扩增产物。
具体实施方式
本发明实施例中所述技术方案，如未特别说明，均为本领域常规方案，所用试剂如未特别说明，均购自生化商店。
实施例1：
一、材料
香菇（Lentinulaedodes，品种：秋栽7号）、茯苓（Poria cocos品种：东北）为华中农业大学应用真菌研究所保存菌种。
二、试剂
裂解液：100mM Tris-HCl(pH=7.8),20mM EDTA,1.4M NaAc,2%(w/v)CTAB,0.5%（v/v）SDS;
PCA：氯仿：苯酚：异戊醇=25:24:1，体积比；
3M NaAc;
无水乙醇；
75%乙醇；
无菌ddH2O;
10mg/mlRNase。
实施例2：
一种快速提取真菌基因组DNA的方法，步骤如下：
香菇菌丝体和子实体基因组DNA的提取
（1）取放置-70℃保持的菌丝体或者子实体，放到预冷（-70℃）的研钵中。
（2）加入液氮进行研磨至粉末状，将粉末加入灭菌1.5ml的离心管中（为离心管的1/3）。
（3）加入混匀的裂解液400μl，充分混匀，放置10-15s。
（4）加入500μLPCA，混匀，放置30s。
（5）12000rpm，离心2min。
（6）取上层水相至另一离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠，再加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置5-10min。
（7）12000rpm，离心2min。
（8）弃上清，用75%的乙醇漂洗沉淀两次。将乙醇倒出离心管，12000rpm，离心30s，采用移液器吸出剩余的乙醇。
（9）加入无菌100μLddH2O和2μLRNase,37℃水浴溶解20min，-20℃保存。
本次提取所用时间为45min。同时利用常规CTAB进行DNA的提取，提取所用时间为3h以上。
对上述提取的DNA进行质量检测：
1.定量检测DNA提取质量
采用Nanodrop2000测定样品DNA的OD值和浓度。结果显示，本方法中香菇菌丝体和子实体的OD260/280分别为2.05和2.13，OD260/230分别为2.1和2.13，浓度为806.2ng/μL和1485.8ng/μL；常规CTAB法中OD260/280分别为2.15和2.16，OD260/230分别为1.92和2.04，浓度为438.5ng/μL和1073.4ng/μL。所以，本发明所述方法提取的DNA纯度高，且DNA浓度也较高。
2.琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量
取上述DNA样品各2μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳50min,EB染色，凝胶成像系统中观察提取的DNA质量，并进行照相。如图1中5、6所示，与经典CTAB法提取的DNA2、3相比：此方法所提取基因组DNA条带清晰明亮，无明显的拖尾现象，说明该方法能够从香菇菌丝体和子实体中提取较完整的基因组DNA，浓度相对较常规CTAB含量高，且所含杂质少
3.用ITS-PCR扩增方法检测DNA质量
选取ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)为引物，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应程序如下：94℃,5min(预变性);35个循环（94℃，50s；54℃，50s;72℃,1min）;72℃，10min;降至16℃即可。反应体系为25μL。1%琼脂糖电泳检测，结果如图2中3、4所示，所得产物片段在500bp-700bp之间，表明所提取DNA完整性好，杂质少，与预期结果相一致。所以本方法提取DNA可以用于PCR扩增等后续分子生物学实验。
实施例3：茯苓菌丝体基因组DNA的提取
（1）取放置-70℃保持的茯苓菌丝体，放到预冷（-70℃）的研钵中。
（2）加入液氮进行研磨至粉末状，将粉末加入灭菌1.5ml的离心管中（为离心管的1/3）。
（3）加入混匀的裂解液，充分混匀，放置10-15s。（400μl）
（4）加入500μLPCA，混匀，放置30s。
（5）12000rpm，离心2min。
（6）取上层水相至另一离心管中，加入1/10体积的3M醋酸钠，再加入两倍体积的预冷无水乙醇，-20℃放置5-10min。
（7）12000rpm，离心2min。
（8）弃上清，用75%的乙醇漂洗沉淀两次。将乙醇倒出离心管，12000rpm，离心30s，再用移液器吸出剩余的乙醇。
（9）加入无菌100μLddH2O和2μLRNase,37℃水浴溶解20min，-20℃保存。
本次提取所用时间为45min，同时利用常规CTAB进行DNA的提取，提取所用时间为3h以上。
对上述提取的DNA进行检测：
1.定量检测DNA质量
采用Nanodrop2000测定样品DNA的OD值和浓度。结果显示,本方法获得茯苓菌丝体基因组DNA的OD260/280为1.91，A260/230为2.03，浓度为2542.1ng/μL；常规CTAB法中OD260/280为2.10，A260/230为1.92，浓度为943.3ng/μL。所以该方法提取的DNA纯度高，且DNA浓度远高于CTAB法。
2.琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量
取上述DNA样品稀释10倍，取2μL进行1%的琼脂糖凝胶电泳，50min,EB染色，采用凝胶成像系统观察提取的DNA质量，并进行照相。如图1所示，与CTAB提取的DNA相比较，本方法所提取的基因组DNA条带清晰明亮，无明显拖尾现象，说明该方法能够从茯苓菌丝体提取出完整的基因组DNA，浓度高于常规CTAB，且含杂质少。
3.ITS-PCR扩增法检测提取的DNA质量
选取ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)为引物，以提取的DNA为模板进行PCR扩增，反应程序如下：94℃,5min(预变性);35个循环（94℃，50s；54℃，50s;72℃,1min）;72℃，10min;降至16℃即可。反应体系为25μL。1%琼脂糖电泳检测。结果如图2所示，所得产物片段在2000bp之间，表明所提取的DNA完整性好，所含杂质少，与预期结果相一致。所以本方法提取的DNA可以用于PCR扩增等后续分子生物学实验。

Claims (10)

1.一种快速提取真菌基因组DNA的方法，步骤如下：
（1）取材：放置-70℃保持的菌丝或者子实体，放到预冷的研钵中；
（2）加入液氮研磨至粉末状，将粉末加入灭菌的离心管中；
（3）加入裂解液，混匀，所述的裂解液的配方为：100mM Tris-HCl (pH=7.8),20mM EDTA, 1.4M NaAc, 2% CTAB, 0.5% SDS；
（4）加入PCA，混匀，PCA配方为：氯仿：苯酚：异戊醇=25:24:1，体积比； 
（5）离心；
（6）取上层水相至另一离心管中，加入3M醋酸钠，再加入预冷的无水乙醇，-20℃放置5-10min；
（7）离心；
（8）弃上清，用75%的酒精漂洗沉淀，离心，弃上清；
（9）加入ddH2O和RNase,溶解，-20℃保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的菌丝或子实体选自：香菇(Lentinula edodes)，赤芝（Ganoderma lucidum）、茯苓（Poriacocos）、茶树菇（Agrocybe cylindracea）、金针菇（Flammulina velutipes）、杏鲍菇（Pleurotus eryngii）、毛木耳（Auricularia polytricha）、蛹虫草(Cordycepts militars）或绿色木霉（Trichodermaviride）。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）中，加入裂解液后，混匀时间为10-15s。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）中，加入PCA后，混匀时间为30s。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）中，离心的转速为12000rpm，离心时间为2min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）离心后，若中间层有白色沉底，重复步骤（4）和（5）直至无白色沉底。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（6）中加入乙醇的体积为水相的2倍，加入的醋酸钠体积为水相的1/10。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（7）中离心的转速为12000rpm，离心时间为2min。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（8）中75%酒精漂洗两次；离心转速为12000，离心时间为30s。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（9）中RNase的浓度为10mg/ml。
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