CN103805522B - 一种白灵菇及其分子标记鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于白灵菇领域，更具体涉及一种白灵菇及其分子标记鉴定方法。本发明提供的白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54，已于2013年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013669。该白灵菇的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、EF1α-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。本发明的白灵菇54栽培周期短于普通白灵菇，产量较高，具有很好的开发应用前景。其分子标记鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。
Description
技术领域
本发明属于白灵菇领域，更具体涉及一种白灵菇及其分子标记鉴定方法。
背景技术
白灵侧耳原拉丁名为Pleurotus nebrodensis (Inzengae) Quél，后张金霞等研究认为我国栽培的白灵菇其拉丁名应为Pleurotus eryngii var. tuoliensis。白灵菇是白灵侧耳的商品名称，又名翅鲍菇、白灵芝菇、克什米尔神菇等，其分布与新疆阿魏（Ferula sinkiangensin K.M.Shen）的分布密切相关，在我国仅分布新疆的阿尔泰、托里、木垒、塔城等地有新疆阿魏生长的荒滩，分布海拔高度在720~1000m，基因资源有限，这就限制了其育种的进展。
目前白灵菇的育种方式主要有白灵菇菌株之间的杂交、原生质体融合杂种选育、诱变育种和系统选育，通过这些育种方式获得适合栽培的白灵菇品种，总的说来我国白灵菇品种还是比较单一，且主要来自同一亲本繁殖。
白灵菇具有食用、药用价值，获专家学者很高的评价，是最具有开发潜力的十大珍稀食用菌之一。然而白灵菇的栽培还是受到其品种比较单一和其生物学特性的影响，如栽培周期较长、栽培条件较苛刻等，在一定程度上制约了白灵菇产业的发展。
鉴于白灵菇具有很大的开发潜力，若能在白灵菇的育种上进行基因资源创新，将会促进白灵菇新品种的培育，进而促进白灵菇产业的发展。
发明内容
鉴于上述背景，本发明提供了一种白灵菇及其分子标记鉴定方法。
本发明提供的白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54，已于2013年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013669。
本发明提供的白灵菇菌株（Pleurotus eryngii var. tuoliensis 54，简称白灵菇54）是以白灵菇和杏鲍菇进行杂交选育的白灵菇54，其含有白灵菇与杏鲍菇的基因，打破了现有白灵菇基因资源较单一的局面。白灵菇54子实体具有白灵菇的菌盖贻贝状、子实体掌状、菌褶延伸等特征，其菌盖颜色同杏鲍菇的浅灰色与浅黄色，栽培周期70～80d，介于杏鲍菇的60d与白灵菇的100～120d，平均每袋产量约360g，具有很好地开发应用前景。
白灵菇54（CCTCC NO：M2013669）的培养基为马铃薯葡萄糖培养基，即培养基是PDA：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂条20g，水1000mL；培养条件为常规的白灵菇培养，无特殊要求。
本发明还提供了所述白灵菇的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、EF1α(Elongation Factor 1α延伸因子1α)-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。
所述特异酶切片段标记的产生：在8～12 μL EF1α-PCR扩增产物中, 加入2μL DdeⅠ酶的酶切Buffer，1.0～1.5 μL DdeⅠ酶, 5～ 7μL ddH2O，37℃水浴3～4 h，取酶切产物用于电泳检测；
所述酶切产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为315～325bp、220～230 bp和115～125bp的DNA标记条带，是白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54标记。其中电泳条件为：取酶切产物15μL，与3μL上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5 X TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；所述上样缓冲液：0.1％ 溴酚蓝, 40% 蔗糖。
所述EF1α-PCR扩增的反应体系：1 μl 含量50~100 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2 μl 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF116OR, EF116OR序列为5’- CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF595F，EF595F序列为5’- CGTGACTTCATCAAGAACATG -3’，0.3 μl 酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17.2 μl ddH2O。
EF1α-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min, 35个循环;72℃延伸10 min。
本发明具有以下优点：
1、白灵菇54含有白灵菇与杏鲍菇的基因，其子实体形态继承了白灵菇与杏鲍菇的形态特征，栽培周期短于普通白灵菇，产量较高，具有很好的开发应用前景。
2、白灵菇54的分子标记鉴定方法具有真实可靠，一目了然的特点，比经典的形态鉴定误差小，不受环境条件的影响，判断更直观。
3、专一性强：本发明充分利用酶的专一性和高效性，且本发明使用的酶对白灵菇54具有特异性，产生特异识别性的标记片段，非白灵菇与杏鲍菇的杂种得不到这种效果。
4、白灵菇54的分子标记鉴定方法操作简单，检测时间短，经典的形态鉴定需要检测的指标多，时间长且需要综合起来分析。在一般的分子实验室即可以完成检测，无需要特殊的仪器设备。
附图说明
图1为白灵菇54子实体形态。
图2为DdeⅠ酶的酶切电泳图；其中，1～8为泳道编号，2～4和5～7泳道显示的分子量为320bp，223 bp和118 bp的DNA标记条带，是白灵菇54的标志；1泳道显示的分子量为223 bp和118 bp是杏鲍菇的标志；8泳道显示的分子量为320 bp和118 bp是白灵菇的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的阐述。
实施例1：白灵菇54的筛选
选取性状优良的6个白灵菇和8个杏鲍菇菌株，在PDA固体培养基活化后制作原种，按白灵菇和杏鲍菇常规栽培方法对白灵菇菌株和杏鲍菇菌株进行出菇试验，弹射其担孢子，进行孢子萌发获得白灵菇与杏鲍菇的单孢菌株。选取24个白灵菇单孢菌株与32个杏鲍菇单孢菌株进行行单-单杂交，共配对768组，获得116个白灵菇与杏鲍菇的杂交子，对116个杂交子出菇试验，筛选出子实体形状同白灵菇的杂交子54，命名为白灵菇54。白灵菇54经多次出菇，其菇体呈贻贝状或掌状，同白灵菇的基本形态一致；菌盖表面较光滑或有小突点、偶见射状裂痕、浅黄色或浅灰色，遗传有杏鲍菇的特性；菌柄偏生、白色，菌褶延伸至菌柄，这一特性又同白灵菇。因此将其鉴定为白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54，已于2013年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址: 武汉 武汉大学，保藏编号CCTCC NO：M2013669。 所述白灵菇菌株和杏鲍菇菌株均从市场上购得。
实施例2：白灵菇54（CCTCC NO：M2013669）的出菇试验，包括以下步骤：
一、白灵菇54菌种制作
将白灵菇54菌株在PDA培养上活化2次，转接于白灵菇原种常规培养基，25℃恒温培养至长满原种瓶。
二、白灵菇54墙式覆土栽培管理
栽培白灵菇54时的选料、各种原料配方、装袋、消毒灭菌和发菌管理及后熟期管理基本上同常规。出菇管理参照张志轩的白灵菇墙式覆土栽培技术（张志轩. 白灵菇墙式覆土栽培技术[J]. 北方园艺2010，11：189～190.）
白灵菇54从接种至采收70～80d，形态特征见图1，菇体贻贝状或掌状，菌盖表面较光滑或有小突点、偶见射状裂痕、浅黄色或浅灰色，菌柄偏生、白色，菌褶延伸至菌柄，单袋平均产量约360g。白灵菇54的栽培周期较一般的白灵菇栽培周期100～120d短，出菇较整齐，具有很好地开发应用前景。
实施例3：白灵菇54（CCTCC NO：M2013669）的分子标记鉴定方法，包括以下步骤：
一、菌丝培养和收集
1、将白灵菇54、杏鲍菇和白灵菇菌株转接含100ml PDA液体培养基的250 ml广口三角瓶中，其中杏鲍菇和白灵菇购于市场，作参照用；
2、放置在25℃摇床上，转速90～130 r/min培养7～10 d；
3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；
4、称取0.5～1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-20℃备用。
二、CTAB法提取基因组DNA
1、取保存备用的杂交菌株的菌丝0.5～1.3g放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；
2、加2.5 mL 65℃预热的抽提液，同时加入50 μl巯基乙醇,上下震荡,使蛋白质变性沉淀；
3、65℃水浴1h，每隔10min振荡1次；
4、加入2.5 ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；
5、8000 r/min,4℃离心10min,取上清到7ml管；
6、加1/5体积65℃预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5 ml的氯仿异戊醇混匀；
7、10000r/min, 4℃离心10min，取上清；
8、加入2.5 ml 65℃预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65℃水浴1h；
9、12000r/min,4℃离心10min后，去除上清液；
10、用0.5ml TE溶液或无菌水溶解沉淀10min；
11、加入0.25ml饱和酚和0.25m L氯仿异戊醇,混匀；
12、12000 r/min，4℃离心10min，取上清，加入2倍体积在4℃预冷的无水乙醇，混匀；
13、放置-20℃冰箱1h或过夜；
14、12000 r/min，4℃离心10 min，弃上清；
15、自然风干沉淀，用30 μl TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀， -20℃保存备用。
三、EF1α-PCR扩增
EF1α-PCR扩增反应体系：1 μl 含量50~100 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2 μl 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF116OR, EF116OR序列为5’- CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF595F，EF595F序列为5’- CGTGACTTCATCAAGAACATG -3’，0.3 μl 酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17.2 μl ddH2O。
EF1α-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min, 35个循环;72℃延伸10 min。
四、特异酶切片段标记的产生
12μl EF1α-PCR扩增产物, 2μl DdeⅠ酶的酶切Buffer, 1.5μl DdeⅠ酶, 7μl ddH2O，37℃水浴4h。
五、酶切产物的电泳检测
取DdeⅠ酶的酶切产物15 μl，与3 μl上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL 2000的DNA MARK作为片段大小的参照，于0.5 × TBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳60—90 min，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图如图2所示，2～4和5～7泳道显示的分子量为320bp，223 bp和118 bp的DNA标记条带，是白灵菇54的标志；1泳道显示的分子量为223 bp和118 bp是杏鲍菇的标志；8泳道显示的分子量为320 bp和118 bp是白灵菇的标志；M表示分量为DL 2000的DNA MARK。
六、试剂与仪器
CTAB抽提液：100 mmol/L Tris-HCl， 2.0% CTAB，20 mmol/L EDTA，1.4 mol/L NaCl，pH 8.0;
CTAB 沉淀液：50 mmol/L Tris-HCl，1.0% CTAB，10 mmol/L EDTA，pH 8.0;
CTAB/NaCl：0.7 mol/L NaCl， 10% CTAB；
氯仿异戊醇：体积比氯仿比异戊醇为24比1；
TE缓冲液：10 mmol/L Tris HCl ，1 mmol/L EDTA；
0.5×TBE：44.5 mmol/L Tris, 50 mmol/L HBO3、1 mmol/L EDTA;
上样缓冲液：0.1％ 溴酚蓝, 40% 蔗糖；
EB：10 mg/mL溴化乙锭；
DdeⅠ酶购自Fermentas；
PCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。
Claims (2)
1.一种白灵菇，其特征在于：所述白灵菇为白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54，已于2013年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M2013669。
2.一种如权利要求1所述的白灵菇的分子标记鉴定方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、EF1α-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测，其特征在于：
所述EF1α-PCR扩增的反应体系：1 μl 含量50~100 ng的DNA，2.5 μl 10×PCR buffer，2 μl 浓度为2.5 m mol/L的 dNTP，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF116OR, EF116OR序列为5’- CCGATCTTGTAGACGTCCTG -3’，1 μl 浓度为10 μmol/L的EF595F，EF595F序列为5’- CGTGACTTCATCAAGAACATG -3’，0.3 μl 酶活为5 U/ul 的Taq DNA Polymerase,17.2 μl ddH2O；
EF1α-PCR扩增反应程序：94℃预变性5 min；94℃变性1 min，55℃退火1 min，72℃延伸1 min, 35个循环;72℃延伸10 min；
所述特异酶切片段标记的产生：在8～12 μL EF1α-PCR扩增产物中, 加入2μL DdeⅠ酶的酶切Buffer，1.0～1.5 μL DdeⅠ酶, 5～ 7μL ddH2O，37℃水浴3～4 h，取酶切产物用于电泳检测；
所述酶切产物的电泳检测：经电泳检测，在一个泳道上只有同时出现分子量为315～325bp、220～230 bp和115～125bp的DNA标记条带，是白灵菇（Pleurotus eryngii var. tuoliensis）54标记。
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