CN107604092A - 一种朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法，其包括如下步骤：1)提取待测样品DNA；2)以待测样品DNA为模板，PCR扩增含有叶绿体psbA‑trnH序列的片段；3)对扩增产物进行拼接，获得完整叶绿体psbA‑trnH序列；4)基于K2P模型，构建测序拼接后的psbA‑trnH序列的系统发育树。本发明方法适用性强，操作简单，能够实现朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的快速准确鉴定，在短时间内鉴定大量样本。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法。
背景技术
淫羊藿属Epimedium L.植物为多年生草本，是古老原始的双子叶植物类群，在植物系统进化树中处于特殊分类地位，也是我国传统的重要药用植物之一，具有补肾阳、强筋骨、祛风湿的作用，且在助孕、抗骨质疏松、提高免疫力和抑制肿瘤等方面具有明显功效。《中国药典》2015年版收录了5种淫羊藿：淫羊藿E.breviconu Maxim.、箭叶淫羊藿E.sagittatum(Sieb.et Zucc.)Maxim.、柔毛淫羊藿E.pubescens Maxim.、朝鲜淫羊藿E.koreanum Nakai和巫山淫羊藿E.wushanense T.S.Ying。淫羊藿属植物形态极其相似，大大增加了形态学鉴定的难度。仅仅凭借物种形态上的微小差异来对其进行鉴别易导致鉴别不准确等问题的产生。除药典种外，同属植物粗毛淫羊藿在地方也作为淫羊藿来使用。药材的基原准确是临床准确用药的前提，因此需要一种能对药典种朝鲜淫羊藿及其同属形态近似种粗毛淫羊藿快速准确鉴定的方法。
DNA条形码技术根据物种DNA的差异来完成对物种的鉴定，摆脱了传统形态鉴定方法依赖长期经验的束缚，不受个体形态、大小等特征和完整性的影响及经验的限制，能直接从基因水平上提供丰富的鉴别依据，操作步骤简便，具有稳定、高效、准确等优点，是传统鉴定方法的有效补充。本发明使用DNA条形码技术，能够实现对朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿进行快速准确鉴定。
发明内容
本发明的目的在于提供利用叶绿体psbA-trnH片段鉴别朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的方法。
具体包括以下步骤：取朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿新鲜叶片，在基因组DNA提取前，用75％的乙醇擦拭表面。
本发明提供的朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的鉴定方法，包括PCR扩增叶绿体psbA-trnH序列。具体包括如下步骤：
1)提取待测样品DNA；
2)PCR扩增含有叶绿体psbA-trnH序列的片段；
3)对扩增产物进行双向测序，拼接，去除引物，获得完整叶绿体psbA-trnH序列。
本发明所用扩增引物序列为：
正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；
反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。
所述PCR扩增的体系为每25μL：
2×Taq PCR Mix 12.5μL，2.5μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL(约30ng)，ddH2O 8.5μL。
所述PCR扩增的条件为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环。
4)基于K2P模型，构建测序拼接后的psbA-trnH序列的系统发育树。
与传统的形态学鉴定、理化鉴定等方法相比，本发明操作简单，结果准确，所获得的psbA-trnH序列有助于实现朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的快速鉴定，缩短鉴定时间。
附图说明
图1所示为朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的种间变异位点图；
图2所示为基于psbA-trnH序列构建的朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的邻接(NJ)树。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
1.从贵州省、四川省和重庆市收集粗毛淫羊藿原植物5份；从吉林省不同地区收集朝鲜淫羊藿原植物2份。详细信息见表1：
表1朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿样品信息表
| 序号 | 样品编号 | 样品名称 | 收集地 |
| 1 | CX01 | 朝鲜淫羊藿 | 吉林省 |
| 2 | CX02 | 朝鲜淫羊藿 | 吉林省 |
| 3 | CM01 | 粗毛淫羊藿 | 贵州省 |
| 4 | CM02 | 粗毛淫羊藿 | 四川省 |
| 5 | CM03 | 粗毛淫羊藿 | 四川省 |
| 6 | CM04 | 粗毛淫羊藿 | 重庆市 |
| 7 | CM05 | 粗毛淫羊藿 | 四川省 |
2.朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿DNA的提取
取朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿新鲜叶片，用75％乙醇擦拭表面，取约30mg样品，用DNA提取研磨仪(Retsch MM400，Germany)研磨2min(30次/秒)后，用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen Biotech Co.，China)提取总DNA，65℃水浴40min，其余步骤按照试剂盒说明进行。DNA储存于-20℃备用。
3.PCR扩增
psbA-trnH序列引物为：
正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；
反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。
由生工生物工程公司有限公司(北京)合成。引物用灭菌双蒸水溶解并稀释至2.5μmol/L。
PCR反应体积为25μL，体系内含2×Taq PCR Mix 12.5μL，2.5μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL(约30ng)，ddH2O 8.5μL。
PCR反应程序：psbA-trnH引物序列在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
PCR产物短期保存于4℃，长期应保存于-20℃。
4.测序
将PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物同PCR引物。
5.序列拼接
应用CodonCode Aligner V5.2.0软件对双向测序峰图进行序列拼接，去除引物区和低质量区。
6.序列比对
用MEGA6.0软件对测序并拼接后的各个样品的psbA-trnH序列进行比对，比对后序列长度为572bp。结果表明，朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的psbA-trnH序列种内变异较大(图1)，序列分别如SEQ ID No.1-2和SEQ ID No.3-7所示。
7.基于K2P模型，构建测序拼接后的psbA-trnH序列的系统发育树，可以将朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿有效分开(图2)。
Claims (7)
1.一种用于朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的分子鉴定方法，包括PCR扩增叶绿体psbA-trnH序列。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
1)提取样品DNA；
2)PCR扩增叶绿体psbA-trnH序列的片段；
3)对扩增产物进行拼接，获得叶绿体psbA-trnH序列；
4)基于K2P模型，构建测序拼接后的psbA-trnH序列的系统发育树。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的引物为：
正向引物PA：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；
反向引物TH：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。
5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的体系为每25μL：2×TaqPCR Mix 12.5μL，2.5μmol/L引物各1μL，DNA模板2μL(约30ng)，ddH2O 8.5μL。
6.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述PCR扩增的条件为94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，30个循环。
7.权利要求1-6任一项所述方法在鉴别朝鲜淫羊藿与粗毛淫羊藿的应用。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108165608A (zh) * | 2018-01-22 | 2018-06-15 | 新疆维吾尔自治区药物研究所 | 鉴别刺山柑和薄叶山柑的方法及其应用 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1190894A (zh) * | 1995-06-07 | 1998-08-19 | 路德维格癌症研究所 | 鉴定或分离分子的方法和由此鉴定的分子 |
| CN103805522A (zh) * | 2014-02-25 | 2014-05-21 | 福建农林大学 | 一种白灵菇及其分子标记鉴定方法 |
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