CN112980988B - 一种细辛属分子身份证及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种细辛属分子身份证及其应用。所述细辛属分子身份证中含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1‑5所示的核苷酸序列。本发明还提供一种细辛属鉴定方法，包括通过检测高通量原始测序数据中是否含有如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1‑5所示的核苷酸序列来判断混合样品中是否存在细辛属物种。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的鉴定细辛属，本发明所提供的方法适用性更广，可检测所有能提取出DNA的样品中是否含有细辛属物种。因此，能够实现细辛属原植物、药材、种子、种苗、粉末和食物混合品的快速、准确鉴定。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种细辛属分子身份证及其应用。
背景技术
细辛属(Asarum)为多年生草本，全世界约有90种，我国分布的有30种、4变种、1变型，南北各地均有分布，长江流域以南各省区最多。细辛具有解表散寒、祛风止痛、通窍温肺化饮的功效，常用于治疗风寒感冒、头痛、牙痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻渊、风湿痹痛、痰饮喘咳等症。作为常用中药材，细辛属应用历史十分悠久，但该属植物含有马兜铃酸类物质(aristolochic acids，AAs)，需加工炮制过后方可入药。AAs作为致癌数据库(CPDB)中最强的致癌物之一，在人体内具有可蓄积毒性，长期或大量摄入会导致肾间质纤维化、急慢性肾功能衰竭、肝癌和尿路上皮癌等疾病，因而早期发现是预防和治疗马兜铃酸药源性疾病的关键。
但细辛属内物种繁多，传统的形态学方法很难实现对该属所有物种的鉴定；目前常规的DNA条形码方法则一方面无法准确鉴定属内各物种，而且对于DNA降解严重的混合样品，如中成药或食品混合物等，鉴定效率低下；基于PCR产物的高通量测序过程中桥式PCR及拼接会造成一定的污染序列，影响结果的准确性。因此，一种快速、准确并适用性更广的细辛属检测技术具有重要的研究价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种可用于准确鉴定细辛属的分子身份证。
具体地，本发明提供如下技术方案：
细辛属分子身份证，其含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列。
其中，SEQ ID NO.2-5所示的核苷酸序列为辅助分子身份证序列。
本发明中，所述细辛属分子身份证为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，或SEQ IDNO.1-5所示的核苷酸序列。
本发明基于ITS2片段序列对细辛属物种有一定鉴别能力的情况下，应用生物信息学的技术，截取不同长度的序列并在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)中进行批量BLAST，得到如SEQ ID No.1-5所示的核苷酸序列。
本发明还提供一种细辛属的鉴定方法，所述鉴定方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1或2所述的细辛属分子身份证。
优选，所述方法包括如下步骤：
1)以待测样品的基因组DNA为模板，PCR扩增含有所述细辛属分子身份证序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述细辛属分子身份证。
本发明鉴定方法中，PCR扩增所使用的引物为：SEQ ID No.6及SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。
XXF:5'-GGTGGTTGTTGGCTCATT-3'(SEQ ID No.6所示的核苷酸序列)，
XXR:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID No.7所示的核苷酸序列)。
本发明提供了一种混合样品(中成药、食品混合物)中鉴定细辛属的方法，其中，所述方法包括通过检测高通量测序原始数据中是否含有本发明所述的分子身份证判断混合样品中是否存在细辛属成分，该方法避免了PCR过程以及拼接过程中产生的污染或错误序列，通过对原始数据进行分子身份证的查找，即可准确判断样品中是否含有毒的细辛属物种。
优选，所述方法包括如下步骤：
1)利用高通量测序技术对混合样品的基因组DNA进行测序；
2)检测高通量测序原始数据中是否存在包含所述细辛属分子身份证的reads。
当存在SEQ ID NO.1所示的序列片段或SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列片段时可以判定待测样品中存在细辛属；如果不存在SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.1-5所示的片段时，判定待测样品不含细辛属。当通过SEQ ID NO.1-5所示的核苷酸序列进行判断时，准确率更高。
本发明中，所述待测样品包括细辛属及食物混合样品。
可选的，所述PCR扩增的反应程序为：
可选的，所述PCR扩增的反应体系为：
2×PCR Master Mix 12.5μL，正反向引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 2μL，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
上述细辛属分子身份证，或鉴定方法在细辛属鉴定中的应用。
本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的细辛属类样品，同时可实现对混合样品中否含有细辛属物种进行准确鉴定。
附图说明
图1为SEQ ID No.8序列在NCBI中BLAST比对结果。
图2为SEQ ID No.11序列在NCBI中BLAST比对结果。
图3至图7分别为SEQ ID NO.1-5分子身份证序列在NCBI中BLAST比对结果。
图8为马兜铃科其他属与细辛属分子身份证区序列对比。
图9为实施例2中高通量测序原始数据中提取细辛属分子身份证结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1细辛属的鉴定方法
1)从NCBI中下载细辛属internal transcribed spacer(ITS)全序列，通过筛选细辛属在ITS中的序列保守区，得到多段候选序列。将不同候选序列在NCBI中分别进行Blast，筛选出一段位于细辛属ITS2序列区域的属内保守且具有特异性的序列；进一步截取该序列区域内不同长度的片段并再次进行Blast，以确定可作为细辛属分子身份证的最佳序列片段(表1，以多种截取方式获得的位于不同位置且长度不同的片段的BLAST结果统计)。比对结果显示，当序列片段较长时，序列在细辛属内的保守性下降，单条序列无法涵盖属内所有物种(图1)；而序列过短时，其特异性降低，比对结果中会匹配到其它属物种(图2)。最终经不断研究得到由21bp的序列(SEQ ID No.1-5)组成的细辛属分子身份证序列组合(表2)，其中GGAACCCAAGTCGGGGGTCTT(SEQ ID No.1)为核心分子身份证。
表1 NCBI中不同片段BLAST结果
从NCBI下载截止到2021年1月31日所有的细辛属ITS2序列，共计806条，共包括该属126物种。其中核心分子身份证(SEQ ID No.1)在NCBI中Blast的部分结果如图3所示，经统计该序列100％匹配到的仅有细辛属物种738条，占细辛属所有序列的91.6％，可证明该段序列可作为细辛属的核心分子身份证。另有5条序列(SEQ ID No.1-5)与之100％匹配的均为细辛属物种。图3至图7分子身份证序列在NCBI中Blast的比对结果表明，同时与SEQ IDNo.1-5相似度为100％的均为细辛属，而其它种与细辛属分子身份证序列(SEQ ID No.1-5)的相似度均小于100％。图8为马兜铃科其他属物种与细辛属核心分子身份证区序列对比，其他属在该区均存在多个变异位点，进一步说明此分子身份证可区分细辛属与其近缘属种，为细辛属的特有序列，适合作为细辛属的分子身份证。
表2分子身份证BLAST结果
| 序号 | 分子身份证序列 | BLAST匹配到细辛属序列条数 |
| SEQ ID No.1 | GGAACCCAAGTCGGGGGTCTT | 738 |
| SEQ ID No.2 | GGAACCCGAGTCGGGGGTCTT | 2 |
| SEQ ID No.3 | GGAACCCAAGTGGGGGGTCTT | 1 |
| SEQ ID No.4 | GGAATCCAAGTCGGGGGTCTT | 1 |
| SEQ ID No.5 | GGAACCCAAATCGGGGGTCTT | 1 |
2)收集得到26份细辛属样品，包含18种，见表3。分别取样约30mg，在球磨仪中(德国Retsch)研磨后，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。
表3细辛属样品信息
3)PCR扩增
引物序列为XXF:5'-GGTGGTTGTTGGCTCATT-3'(SEQ ID No.6)，XXR:5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'(SEQ ID No.7)，由北京诺赛基因组研究中心有限公司合成。引物用无菌去离子水溶解并稀释至2.5μmol/L。
25μL反应体系：2×PCR Master Mix 12.5μL，正方向引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 2.0μL(40ng)，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。
PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：
4)测序
PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序，测序引物同本发明的PCR引物XXF和XXR。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。
5)序列拼接
本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 5.2.0(CodonCode Co.,USA)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。测序结果的平均Q值大于等于30。去除序列两端引物区，获得目标序列长度为166bp。
6)序列比对
用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中细辛属植物数据的ITS序列进行比对，细辛属分子身份证序列区域比对结果表明SEQ ID No.1-5这组分子身份证序列属内保守。
实施例2细辛属样品的鉴定
1)将细辛属样品(Asarum sp.)在液氮中研磨过后，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取总DNA。
2)将混合DNA样品直接在Illumina平台进行高通量测序。
3)在高通量测序得到的原始数据中提取细辛属分子身份证序列，结果如图6。
4)结果表明，在破碎细辛属的样品中也可以准确检测到分子身份证序列SEQ IDNo.1。证明可通过直接检测高通量原始测序数据中是否存在包含分子身份证的reads判断样品中有无细辛属。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
序列表
<110> 中国医学科学院药用植物研究所
<120> 一种细辛属分子身份证及其应用
<130> KHP211111411.3
<160> 11
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ggaacccaag tcgggggtct t 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggaacccgag tcgggggtct t 21
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ggaacccaag tggggggtct t 21
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ggaatccaag tcgggggtct t 21
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggaacccaaa tcgggggtct t 21
<210> 6
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggtggttgtt ggctcatt 18
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcctccgctt attgatatgc 20
<210> 8
<211> 184
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
attcggacct acggtggact gcgacacgtc cagtggtggt tgttggctta tagccgcgat 60
tgacaggagg acgtgtcgac gccccgcctt aaggtttgcc tttggaaccc aagtcggggg 120
tcttttgact ttcgaacagc gaccccaagt caggtgggga cacccgctga gtttaagcat 180
atca 184
<210> 9
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tttggaaccc aagtcggggg tctttt 26
<210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
tggaacccaa gtcgggggtc tt 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
ggaacccaag tcgggggt 18
Claims (5)
1.一种DNA分子或DNA分子组合物，其特征在于，所述DNA分子的核苷酸序列如SEQ IDNo.1所示，或所述DNA分子组合物由核苷酸序列如SEQ ID NO.1-5所示的5条DNA分子组成。
2.一种细辛属的鉴定方法，其特征在于，所述鉴定方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1所述的DNA分子或所述的DNA分子组合物。
3.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)以待测样品的基因组DNA为模板，PCR扩增含有所述DNA分子的序列的片段；
2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在权利要求1所述的DNA分子或所述的DNA分子组合物。
4.根据权利要求2所述的鉴定方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
1)利用高通量测序技术对混合样品的基因组DNA进行测序；
2)检测高通量测序原始数据中是否存在包含权利要求1所述的DNA分子或所述的DNA分子组合物的reads。
5.权利要求1所述的DNA分子或DNA分子组合物，或权利要求2-4任一项所述的鉴定方法在细辛属鉴定中的应用。
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