CN106967807A - 一种有毒饮片土荆皮的分子鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种有毒饮片土荆皮分子身份证，所述分子身份证中含有如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。利用本发明所提供的分子身份证和方法可以准确的判定市场所售土荆皮饮片是否为真，且与其相似药材中是否混有土荆皮。本发明所提供的方法适用性更广，能检测所有能提取出DNA的任何样品。因此，能够实现土荆皮饮片的快速、准确鉴定。

Description

一种有毒饮片土荆皮的分子鉴定方法

技术领域

本发明属于中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及一种应用分子身份证鉴定土荆皮饮片的方法。

背景技术

土荆皮(Pseudolaricis cortex)，又称土槿皮或者金钱松树皮，为金钱松科金钱松属金钱松(Pseudolarix amabilis(Nelson)Rehd.)的干燥根皮或近根树皮。土荆皮主要功效为杀虫除真菌，临床常用于治疗手癣，脚癣，体癣，止痒等常见疥癣瘙痒。根据研究得知，土荆皮有毒性，含有多种抗真菌的土荆皮酸，对十几种致病真菌都有抗菌功效。目前市面上与土荆皮名称相似的药材还有锦葵科木槿Hibiscus syriacus L.的干燥茎皮根皮，木兰科南五味子Kadsura longipedunculata Finet et Gagnep.干燥根皮(也称川槿皮)，以及曾经为习用药材的大戟科余甘子(又称紫荆皮)Phyllanthus emblica L.的干燥树皮，这几种药材与土荆皮相比较无毒，成分功能主治也均有差异，所以并不能作为代用药材，鉴于这些药材经过高温干燥加工后形态相似，混淆情况也时常发生，且现阶段对于土荆皮的鉴定方式除了传统形态学鉴定之外就是薄层扫描法和色谱法等，本发明则从分子角度出发，对土荆皮进行鉴定。如今分子鉴定已广泛应用于中药材中，而针对经过高温干燥或者加工处理过后的土荆皮而言，DNA的提取会更加困难，扩增长序列存在一定的难度，或者扩增质量不佳影响鉴定结果。邵鹏柱等人的研究表明人参在煎煮两小时后只能扩增获得短片段，该结果可以作为药材土荆皮DNA质量不佳的佐证。土荆皮来源于单种属的金钱松，序列更为保守，因此具有极高的特异性。本发明基于土荆皮的该特性开发了一段土荆皮独有的，具有极高特异的分子身份证，片段长度为25bp，以此弥补土荆皮饮片分子鉴定的不足。

发明内容

本发明的目的在于克服传统鉴别技术中存在的上述缺陷并提供一种结果准确灵敏，鉴定过程简便快速的土荆皮鉴定方法。本发明所利用的分子身份证是根据土荆皮单属单种的特性，在DNA序列中经过筛选和与blastn比对后确定了一段25bp的土荆皮分子身份证序列，该分子身份证具有种内保守、种间变异较大的特点。经过BLAST分析，证明该分子身份证为土荆皮特有，种内序列相似度为100％(见图1)，与其它物种的序列相似度较低。若未知样品DNA扩增获得此段分子身份证，则可判定样品为土荆皮或含有土荆皮。

本发明提供了一种土荆皮饮片的分子鉴定方法，其中，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在本发明所述的分子身份证。当存在所述分子身份证时，鉴定待测样品中存在土荆皮。

可选的，所述方法包括如下步骤：

1)以待测样品的基因组DNA为模板，对所述分子身份证进行PCR扩增，获得扩增产物；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区获得扩增片段，检测扩增片段中是否存在所述分子身份证，如果含有此分子身份证，则证明该饮片为土荆皮。

本发明对于PCR所使用的引物有特别的限制，因土荆皮为单属单种，特异性较高，因此在PCR扩增的过程中为了达到目的条带的准确性，采用专门设计的特异引物。所述PCR扩增使用的引物为：

TJPF1 5’-GGCGTCGCATACAACACA-3’

TJPR1 5’-CGGCAGAGAACATCGGAT-3’

上述PCR扩增的反应程序为：

可选的，所述PCR扩增的反应体系为：

PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg²⁺2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

其中，所述待测样品为土荆皮饮片。

附图说明

图1所示为土荆皮Pseudolarix amabilis分子身份证5’-GATAGCGGGGAGCAGCGGACATGGT-3’的比对结果。

图2所示为土荆皮饮片及其混淆品(含有川槿皮，木槿皮，余甘子)的扩增结果：利用特异性引物TJPF1/R1在土荆皮饮片和混淆品DNA中扩增含有土荆皮分子身份证片段，样品共18个。其中第一条和最后一条泳道为DL 2000 marker。1-12泳道为土荆皮目的条带(样品编号依次为TJP1-TJP12)，泳道13-18为混淆品扩增结果(13为川槿皮CJP1，14-16为木槿皮MJP1-3，17-18为余甘子YGZ1-2)，CK为阴性对照。

图3所示为在土荆皮DNA序列中分子身份证查询结果，序列标黑部分即为土荆皮分子身份证。

序列表中列出的为土荆皮饮片(Pseudolaricis cortex)的分子身份证。

具体实施方式

实施例1

实施例1用于说明土荆皮分子身份证鉴定的真实性

1)DNA的获取

从不同产地收集的土荆皮的基原样本5份。分别取20mg，在MM400球磨仪(德国Retsch)上进行研磨，用天根生化科技(北京)有限公司的植物基因组DNA试剂盒提取总DNA。

2)PCR扩增

正向引物ITS2F 5’-ATTCACACCAAGTATCGCAT-3’

反向引物ITS3R 5’-ATTGTAGTCTGGAGAAGCGTC-3’

由北京赛百盛生物工程公司合成。引物用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol/μL。

25μL反应体系：PCR Buffer(10×)2.5μL，Mg2+2μL(25mmol/L)，dNTPs混合物2μL(2.5mmol/L)，引物各1.0μL(2.5μmol/L)，模板DNA 1μL(-约30ng)，Taq DNA聚合酶1.0U，加灭菌双蒸水至25μL，进行PCR扩增。

PCR反应程序：在PCR仪上按照以下程序进行扩增反应：

3)测序

PCR产物直接送中国农业科学院重大工程实验室测序。测序引物为和。为确保DNA条形码序列的可靠性，需要进行正反向测序或重复测序，然后将正反向测序结果进行拼接获得DNA条形码序列。

4)序列拼接

本实施例采用应用软件CodonCode Aligner 3.7.1(CodonCode Co.，Germany)进行序列拼接及校对。首先，进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估，如果满足质量要求，方可用于序列拼接，具体方法是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动。

5)同属近缘种序列比对

用MEGA 5软件对测序并拼接后的各个样品以及GenBank中土荆皮ITS2序列进行比对，土荆皮样品的ITS2序列包含5’-GATAGCGGGGAGCAGCGGACATGGT-3’，且土荆皮为单属单种，特异性很高(图1)。

实施例2土荆皮饮片的鉴定

采用与实施例1相同的方法进行鉴定，所不同的是以土荆皮饮片为样品，以及扩增引物为土荆皮特异性引物TJPF1/R1。本次所选择的样品来自安徽九华山、浙江临安市、山东青岛市，广东省清平中药材市场、北京同仁堂、河北安国中药材市场。共计12批次，见表1。提取基因组DNA，应用特异引物TJPF1/TJPR1进行扩增(如图2，泳道1-12)并测序，在序列中查找土荆皮分子身份证。研究结果表明：12/12份土荆皮饮片中均检测到了土荆皮分子身份证。证明所购买的土荆皮饮片是正品。(以TJP7为例，图3)

表1土荆皮饮片采样表

实施例3利用土荆皮特异性引物对川槿皮等混淆药材的鉴定

采用与实施1相同的方法进行鉴定，所不同的是使用的药材分别是川槿皮，木槿皮和余甘子为样品。本次所选择的样品来自安徽亳州、江苏苏州、山东济宁、河北保定、广东梅州共计6个批次，见表2。提取基因组DNA，应用特异引物TJPF1/TJPR1进行扩增，通过电泳检测没有得到目的条带，说明该方法适合于土荆皮及其混淆品的鉴定。(见图2，泳道13-18)

表2混淆药材采样表

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.土荆皮分子身份证鉴定方法，其包括如下步骤：

1)以待测样品DNA为模板，扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段；

2)对扩增产物进行测序，拼接后去除引物区，获得完整序列，确定包含SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括检测样品基因组DNA中是否存在权利要求1-2中任意一项所述的分子身份证，如果含有则可判断该份样品为土荆皮或含有土荆皮。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，用于扩增含有SEQ ID No.1所示序列的片段的引物为：

TJPF1 5’-GGCGTCGCATACAACACA-3’

TJPR1 5’-CGGCAGAGAACATCGGAT-3’。

4.含有权利要求3中所述的引物的土荆皮鉴定试剂盒。