CN106399475A - 一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗鉴定的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗进行鉴定的方法，提供了用于铁皮枫斗鉴定的标准序列，可有效解决铁皮枫斗药材分子鉴定问题。具体步骤如下：(1)设计两对引物对ITS2序列分段进行PCR扩增；(2)对扩增结果测序后，按重叠区域连接在一起，获得ITS2序列；(3)与本发明标准序列SEQ ID No.1比对，序列相似性大于或等于99％，则鉴定为铁皮石斛。本发明能够实现铁皮枫斗药材、基原植物、种子种苗等的快速、准确鉴定。

Description

一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗鉴定的方法
技术领域
本发明涉及术语中药材来源品种鉴定技术领域，具体涉及利用核糖体DNA(rDNA)ITS2片段快速鉴别铁皮枫斗的方法及其应用。
背景技术
铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo(《中国植物志》英文版eflora中拉丁名为Dendrobium catenatum Lindley)为兰科珍稀名贵药用植物，有“中华九大仙草之首”之盛名。铁皮石斛对生长环境条件要求苛刻，其自然繁殖能力低，生长缓慢，又经长期采挖，自然资源濒临枯竭，被列为国家重点保护的药材品种。铁皮枫斗是由铁皮石斛鲜条加工而成，已被公认为高端养生品。目前，我国药用石斛约有40余种，近年来铁皮石斛价格不断攀升，市场上把石斛属其他植物或兰科某些植物也作为铁皮石斛混入商品流通和临床应用，对铁皮石斛的临床疗效和用药安全产生了很多不良影响。DNA条形码技术依赖样品自身的基因分子信息，能够实现物种的准确鉴定。目前该技术在铁皮枫斗的鉴定中有以下问题：(1)铁皮石斛加工成铁皮枫斗的过程中，多进行高温加热进行加工，且时间较长，造成样品DNA的严重降解，影响DNA的提取效率；(2)通用引物ITS2F/3R在铁皮枫斗ITS2序列扩增中，扩增效率低。针对以上问题，本发明提供了一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗进行鉴定的方法。
发明内容
本发明第一个目的在于提供获取铁皮枫斗rDNA ITS2序列的PCR扩增策略、PCR扩增特异引物和体系配比。
本发明第二个目的在于提供鉴别铁皮枫斗的鉴定方法。
本发明提供的铁皮枫斗rDNA ITS2序列制备方法主要包括如下步骤：
(1)扩增策略：由于铁皮枫斗DNA降解较严重，故对铁皮枫斗ITS2序列进行分段扩增，即设计两对引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R分别扩增更短的序列，保证扩增的成功率，将DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R获得序列按重叠部分连接起来即得ITS2序列。
(2)PCR扩增特异引物：
用于铁皮枫斗ITS2序列分段扩增的引物为：
正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；
反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；
按以下程序扩增：95℃ 5min；94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s，40个循环；72℃10min；
正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；
反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’；
按以下程序扩增：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40个循环；72℃10min。
(3)PCR扩增体系配比：
由于铁皮枫斗基因组DNA降解严重，通过普通植物基因组DNA提取试剂盒提取DNA浓度很低，需加大模板DNA的体积。DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R引物进行PCR扩增的体系均为25μL，包括2×Taq PCR Mix 12.5μL，特异引物正反向各1.0μL(2.5μmol·L-1)，DNA模板溶液10.5μL。
(4)鉴定
本发明提供了应用于铁皮枫斗分子鉴定的标准序列SEQ ID No.1，若使用引物DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R所得样品ITS2序列与SEQ ID No.1序列相似性大于或等于99％，则鉴定为铁皮枫斗。
本发明适用于铁皮枫斗市售药材，以及基原植物、种子种苗等方面的鉴定，可有效解决铁皮枫斗的物种鉴定以及种质资源的开发利用等问题，适用性广，操作简单，易于掌握，准确性高。
附图说明
图1所示为引物DO-2F/2R与ITS2F/3R对铁皮枫斗ITS2序列扩增对比电泳图CK为空白对照；1-6为引物ITS2F/3R扩增；7-12为引物DO-2F/2R扩增；M为分子量标准(条带由上到下依次为：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp)。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1铁皮枫斗的鉴定
1.实验材料
本案例共收集69份铁皮枫斗样本，具体信息见表1。
表1铁皮枫斗样品信息
2.实验仪器
台式高速离心机、PTC-100基因扩增仪、电泳仪、紫外凝胶成像分析系统、MM400球磨仪(德国Retsch)。
3.DNA提取
取铁皮枫斗干燥药材20-30mg，切碎后使用MM400球磨仪粉碎，加入核分离液500-1000μL，充分混匀，7000r/min离心5min，弃上清，加入核分离液500-1000μL，重复此步骤3-5遍至上清不粘稠。其余步骤参照植物基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司)标准操作方法进行。核分离液的配方为：Tris-HCl(pH8.0)终浓度100mM，EDTA(pH8.0)终浓度20mM，NaCl终浓度0.7M，2％PVP-40(W/V)，以上各物质配成溶液后灭菌，使用之前加入β-巯基乙醇0.4％(V/V)。
4.PCR扩增
(1)均按以下扩增体系进行PCR扩增：反应体系25μL，包括2×Taq Master Mix12.5μL(北京艾德莱生物技术有限公司)，正反向引物各1.0μL(2.5μmol·L-1)，DNA模板溶液10.5μL。
(2)引物由生工生物工程公司有限公司(北京)合成，用无菌去离子溶解并稀释至2.5μmol·L-1。引物序列及PCR反应参数为：
DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；
DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；
PCR反应参数：95℃5min；94℃ 30s，54℃30s，72℃ 45s，40个循环；72℃ 10min。
DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；
DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’，
PCR反应参数：95℃ 5min；94℃ 30s，52℃ 30s，72℃ 45s，40个循环；72℃ 10min。
5.DNA测序
PCR产物直接进行双向测序，测序引物同PCR扩增引物(DO-2F/DO-2R、DO-3F/DO-3R)。
6.序列拼接
本实施例采用软件CodonCode Aligner 5.1(CodonCode Co.，USA)进行序列拼接及校对。首先，利用该软件去除序列两端的引物区，然后进行测序质量评估及预处理，即去除测序结果两端的低质量部分，并对剩余部分进行质量评估。具体步骤是：以20bp的窗口分别从序列5’端和3’端进行滑动，如果窗口内有多于2个碱基的Q值小于20，则删除一个碱基，窗口继续滑动，如果窗口内碱基Q值小于20的数目小于或等于2个，窗口停止滑动，即去除了低质量的区域。
序列拼接获得的两段序列，按重叠部分连接起来，也可以一条完整的铁皮石斛ITS2作为参考序列进行比对连接。
7.序列比对
用DNAMAN软件对获得各样品的ITS2序列与Seq ID No.1进行比对，序列相似性均大于或等于99％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
实施例2铁皮石斛基原植物的鉴定
基本同实施例1，所不同的是以铁皮石斛基原植物为样品，按上述方法提取DNA，扩增ITS2序列，结果也能成功获得目标序列，完成鉴定。
实施例3铁皮石斛种子种苗的鉴定
基本同实施例1，所不同的是铁皮石斛种子和种苗为样品，按上述方法提取DNA，扩增ITS2序列，结果也能成功获得目标序列，完成鉴定。

Claims (9)

1.一种获取rDNA ITS2序列用来对铁皮枫斗进行鉴定的方法，其特征在于：rDNA ITS2序列的PCR扩增策略及特异引物、PCR扩增体系配比和鉴定。
2.根据权利要求1所述的方法，包括以下步骤：
1)样品的DNA提取；
2)应用两对引物对ITS2序列分段进行PCR扩增；
3)对分段扩增结果测序后，按重叠区域连接在一起，获得ITS2序列；
4)与SEQ ID No.1所示序列比对分析进行鉴定。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述样品为铁皮枫斗。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，由于铁皮枫斗在加工过程中DNA降解严重，故设计DO-2F/DO-2R和DO-3F/DO-3R分别扩增更短的序列以保证扩增的成功率，即对铁皮枫斗ITS2序列进行分段扩增。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，用于分段扩增ITS2序列的引物为：
正向DO-2F：5’-GCATGGTGGCTCCTCGTG-3’；
反向DO-2R：5’-ATGGATTGGGATCACCTAAAA-3’；
正向DO-3F：5’-AAAGGCCTATGCTATTGTGA-3’；
反向DO-3R：5’-CGCTTATTGATATGCTTAAACTC-3’
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，由于铁皮枫斗药材基因组DNA降解严重，提取的DNA浓度很低，需加大模板DNA的体积。PCR扩增体系25μL，包括2×Taq PCR Mix 12.5μL，特异引物正反向各1.0μL(2.5μmol·L-1)，DNA模板溶液10.5μL。
7.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的PCR扩增条件为：
引物DO-2F/DO-2R进行PCR扩增反应参数：95℃5min；94℃30s，54℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min；
引物DO-3F/DO-3R进行PCR扩增反应参数：95℃5min；94℃30s，52℃30s，72℃45s，40个循环；72℃10min。
8.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其特征在于，用DNAMAN软件对样品的ITS2序列与SEQ ID No.1所示序列进行比对，序列相似性大于或等于99％，则鉴定为铁皮枫斗。
9.权利要求1-8任一项所述方法在鉴别铁皮枫斗及其基原植物、种子、种苗中的应用。
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